Yöntem makalesi

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

DOI:

10.3791/57774

⸱

25 Mayıs 2018

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall, University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center, University of California, Berkeley

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) gen ekspresyonu nedeniyle algılayıp bireysel RNA molekülleri saymak için onun yetenek tek kişilik hücrelerde çalışma için güçlü bir tekniktir. Derin-dayandırılmış yöntemleri için tamamlayıcı, smFISH hücre hücre varyasyon transkript bolca ve belirli bir RNA'ın hücre altı yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Son zamanlarda, NDC80 gen ifade mayası mayoz sırasında çalışmaya smFISH kullanmış, hangi iki transkript izoformlarının adlı biri yok ve tüm onun sırası ile uzun izoformu paylaşılan kısa transkript izoformu vardır. Güvenle her transkript izoformu tanımlamak için bilinen smFISH iletişim kuralları en iyi duruma getirilmiş ve yüksek tutarlılık ve kalite tomurcuklanma sırasında alınan örnekleri için smFISH veri elde Maya mayoz. Burada, en iyi duruma getirilmiş bu iletişim kuralı olup kaliteli smFISH veri elde edilir ve bu iletişim kuralı diğer maya suşları ve büyüme koşulları uygulamak için bazı ipuçları belirlemek için kullandığımız ölçütleri açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik, düzenleme, Gen ifadesinin bir organizma gibi çevresel stres, enfeksiyon ve değişiklikler onun yanıt gelişimi metabolizmasında kullanıyor. Transkripsiyon regülasyonu odak çalışmaları RNA bereket ölçen teknolojilerine güveniyor. Böyle bir yöntem tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) olarak adlandırdığı bireysel RNA molekülleri tek hücreler1,2tespiti için kullanılır. Bu yöntem, hücre hücre değişkenlik gen ekspresyonu ölçümü ve hücre içi RNA yerelleştirme belirlenmesi sağlar.

En sık kullanılan smFISH teknikte bireysel bir RNA molekülü tespiti hedef RNA tamamlayıcı ve aynı floresan boyalar için Birleşik birden çok kısa DNA prob (genellikle ~ 48 20-mer probları) gerektirir. Tek bir floresan sonda bağlama sinyali zayıf sonuçlar, ancak tüm probları topluluğu sinyalini sağlamdır. Tek bir sonda hedef kapalı bağlama sergi olsa bile, böyle sinyal çok zayıf olarak hedef RNA molekülü3kıyasla beklendiği için bu özellik sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde artırır. İçinde hata algılama RNA molekülleri sayısı sayılır ve çeşitli büyüme koşullarında ve farklı mutantlar arasında göre.

İlk gelişimi beri smFISH gen ifade4,5,6,7 patlama transkripsiyon Uçbirleştirme transkripsiyon uzama1,gibi2, çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanmıştır , 8 , 9, hücre içi allelic ifade10,11,12ve RNA yerelleştirme13,14,15. Son zamanlarda, hangi aynı genin iki transkript izoformlarının ifade eğitim için bu yöntemi kullandık kısa transkript izoformu (NDC80ORF) vardır onun tüm sıra uzun izoformu (NDC80luti ile paylaştı )16. İki mRNA izoformlarının benzersiz olarak tanımlamak için biz iki yoklama kümesi kullanılır: bir set NDC80lutibenzersiz sırasını belirli ve diğer küme başka bir floresan boya, Birleşik, iki izoformlarının ortak bölgesine bağlar. NDC80luti RNA colocalized bir yer her iki floresan sinyali ile ise tanımlanan NDC80ORF RNA biri sadece sinyal ortak soruşturma kümesinden içerir. Sayısı beri NDC80ORF transkript sonda hibridizasyon, yüksek verim ve yüksek sinyal gürültü oranı güvenle smFISH noktalar tanımlamak ve hata azaltmak gerekli "çıkarma" yöntemine göre hesaplanır yayma.

Bu kağıt tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaesmFISH gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, cep numarası, fiksasyon süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon içinde smFISH deneyler için kullanılan arabellek en iyi duruma getirilmiş S. cerevisiae geçiren SK1 zorlanma arka için bitkisel büyüme veya mayoz. Ancak, aynı zamanda bu el yazması Not: resim alma ve (2) ek optimizasyon farklı zorlanma arka planlar ve büyüme koşulları için gerektirebilir Protokolü adımları sonra smFISH verilerin kalitesini kontrol etmek için (1 yöntemi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Tüm tamponları ve bu protokol için kullanılan ortamı Tablo 1' de listelenmiştir. Satıcı bilgileri reaktifleri için Malzemeler tablolistelenir.

Gün 1/1-2 gün:

Not: bitkisel kültür için 0.4-0.6 tercih edilen bir ortamda, bir OD600 hücrelerin büyümesine. Segregasyonun kültür için hücreleri (genellikle bir OD600 itibaren 1.85 içinde kültür) tercih edilen bir yöntemle mayoz geçmesi için ikna etmek.

1. örnek fiksasyon ve sindirim

  1. ~3.5 OD%600 3 formaldehit hücrelerinin toplam düzeltmek.
    1. Bitkisel kültür için 480 µL % 37 formaldehit 15 mL konik tüpler kültürünün 5.52 mL ekleyin.
    2. Segregasyonun kültür için 160 µL % 37 formaldehit 2 mL microcentrifuge tüpler 1840 µL kültürünün ekleyin. ~ 5 kat için ters çevir'i karıştırın.
      Uyarı: Toksik formaldehit. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.
  2. Tüpler bir silindir davul oda sıcaklığında 20 dakika yerleştirin. Segregasyonun örnekleri,-20 dk, oda sıcaklığında sabitleme sonra gecede 4 ˚C sabitleme devam etmek için döner.
    Not: Gece fiksasyon tekrarlanabilirlik ve segregasyonun örnekleri için elde edilen smFISH verilerin kalitesini artırır. Fiksasyon zaman optimize edilmelidir.
  3. Örnekler tespit ederken, 200 mM Vanadyl Ribonucleoside kompleksleri (VRC), en az 10 dk 65 ˚C çözülme.
  4. Sindirim ana karışımda 15 mL Tüp hazırlayın: 1 örnek için arabellek b 425 µL 200 mM (65 ˚C ısındı); VRC 40 µL ile karıştırın. 5 örnekleri için 2125 µL arabellek b 200 µL 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC ile karıştırın. Açık kahverengi yeşil VRC eklenmesinden sonra görünür ana karışıma eklemeden önce VRC tam olarak resuspend için girdap ~ 5 s.
    Not: VRC eklenmesi sırasında sindirim smFISH sonuçları, tutarlılığını potansiyel olarak ham özü saf zymolyase karışımı tarafından tanıtıldı nükleaz kirletici engelleyerek iyileştirir. Bu adımda gerekli VRC miktarı optimize edilmelidir.
  5. Bitkisel örnekleri için ~ 1057 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi. Segregasyonun örnekleri (sonra gece fiksasyon) için 1,5 dk. Decant 21.000 x g, santrifüj kapasitesi veya süpernatant formaldehit atık için Aspire edin.
    Not: Oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımlar gerçekleştirilir.
  6. 1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri yukarı ve aşağı pipetting veya tüplerin ters çevirme ve karıştırmak için flicking resuspend. Bitkisel örnekleri 2 mL tüpler için resuspension sonra aktarın.
  7. 1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.
  8. 1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri resuspend
  9. 1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.
  10. Hücreleri 21.000 x g de 1,5 dk. aspiratı soğuk arabellek B. santrifüj 1,5 ml sıvı vakum tamamen veya pipetting resuspend.
  11. Sindirim ana mix ve kısaca resuspend girdap 425 µL hücrelerde resuspend. 100T 10 mg/mL zymolyase 5 µL her tüp için ekleyin.
    Not: Girdap önce tüpler için ekleme her zaman zymolyase. Zymolyase ana karışıma eklemek yerine her tüp için ayrı ayrı ekleyin. Her iki adım zymolyase hızlı bir şekilde precipitates çünkü tüpleri arasında sindirim tutarlılığı korumaya yardımcı olmak.
  12. Girdap 2-3 s karıştırmak için. Tüpler silindir davulunun üstündeki yerleştirin ve 15-30 dk 30 ˚C, sindirmek. Bitkisel hücreleri ve erken segregasyonun aşamaları, genellikle ~ 15 dk sürer ve segregasyonun profaz ve segregasyonun bölümler için genellikle ~ 30 dakika sürer.
    Not: mikroskobunun her 5 dk 15 dk sonra denetleyin ve saydam olmayan ve Refraktif ~ %80 hücre görünür sindirim durdurur. Şu andan itibaren çok kırılgan hücrelerdir. Hücreleri nazikçe işlemek ve vakum aspirasyon ya da vortexing kullanmayın.
  13. Tüpler ~ 376 x g 3 dk. Kaldır, sıvı tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
  14. Yavaşça yukarı ve aşağı 1 - 2 kez için pipetting tarafından arabellek b 1 mL içeren hücreleri resuspend karıştırın.
  15. ~ 376 x g 3 dk. Kaldır Tampon B sıvı, tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça 1 mL % 70 etanol (RNase free su ile seyreltilmiş) hücrelerde resuspend.
  16. Oda sıcaklığında 3,5-4 saat için kuluçkaya.

2. hibridizasyon

  1. Formamide oda sıcaklığına getirmek (50 mL aliquot için ~ 30 dk su banyosunda alır).
    Not: formamide şişe şişe formamide oksidasyonunu önlemek için oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar açmayın.
    Dikkat: Formamide zehirlidir. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.
  2. % 10 formamide yıkama arabellekte bir 15 mL konik Tüp hazırlayın.
  3. ~ 376 x g 3 dk. kaldırmak 500 µL % 70 etanol için de tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça yukarı ve aşağı kalan hücreleri resuspend ve sonra hücreleri düşük yapışma tüpler için aktarmak için damlalıklı.
    Not: yüksek yapışma borular kullanarak büyük ölçüde hücre kaybı sırasında sonraki yıkar azaltır.
  4. Tüpler ~ 376 x g 3 dk. çıkarmak için de tekrar pipetting tarafından tüm etanol santrifüj kapasitesi.
  5. 1 mL % 10 formamide yıkama arabellek ve yavaşça damlalıklı aşağı yukarı 2 - 3 kez eklemek hücreleri resuspend.
  6. Hücreleri hibridizasyon çözüm hazırlarken ~ 20 min için oda sıcaklığında oturmak izin. 1 örnek için 50 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 5 µL ve her sonda (200 nM final) 1 µL karıştırın. 5 örnekleri için 250 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 25 µL ve her sonda (200 nM final) 5 µL karıştırın.
    1. Hibridizasyon (-20 ˚C dondurulmuş) arabellek formamide oksidasyonu önlemek için tüp açmadan önce oda sıcaklığına çözülme.
    2. 200 mM VRC, sondalar, eklemeden önce 5-10 s için girdap ekledikten sonra hangi tasarlanmış ve ticari satın ve üreticinin yönergelerine göre yeniden düzenlendi.
    3. İki problar Co inkübe varsa, 1:10 1 µL ekleyin seyreltme prob #1 stok, hem de 1:10 1 µL seyreltme, son seyreltme yapmak için prob #2 stokunun ~ 1:500 her iki soruşturma için. Olmak en iyi sinyal-gürültü oranı ihtiyaçları için gerekli konsantrasyonu (Ayrıntılar için bkz: tartışma) en iyi duruma getirilmiş.
  7. ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
  8. Hibridizasyon çözümünün en az 50 µL her tüp için ekleyin. Karıştırmak için tüpler fiske.
  9. Bir rulo davul üzerinde 30 ˚C, en az 16 saat karanlıkta kuluçkaya.

Gün 2/gün 3

3. yıkama ve görüntüleme

  1. Formamide oda sıcaklığına getirmek.
  2. % 10 formamide yıkama arabellek (FWB) 15 mL konik Tüp hazırlayın.
  3. Tüpler rulo davul kaldır ve ışıktan korumak için bir folyo kaplı kutusuna koyun.
  4. ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
  5. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL % 10 FWB resuspend 2 - 3 kez.
  6. 30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.
  7. 3 dk. için çıkarmak süpernatant tehlikeli atık için pipetting tarafından ~ 376 x g de örnekler santrifüj kapasitesi ve ~ 50 µL bırakın.
  8. Bu arada, DAPI/FWB 15 mL konik tüp içinde hazırlamak: 1 örnek için 1000 µL % 10 formamide yıkama arabelleği 5 mg/mL DAPI 1 µL ile karıştırın. 10 örnekleri için 10 mL % 10 formamide yıkama arabellek 5 mg/mL DAPI 10 µL ile karıştırın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL DAPI/FWB resuspend 2 - 3 kez.
  9. 30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.
  10. Anti-çamaşır suyu reaktifler buz çözme.
  11. ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Gerekirse, tüm süpernatant kaldırmak için tekrar santrifüj kapasitesi.
  12. Hemen görüntüsü değil örnekleri, Pelet GLOX arabellek olmadan enzimler 50 µL içinde resuspend. Damlalıklı aşağı yukarı 3 - 4 kez karıştırmak için.
    1. Unimaged örnekleri folyo kaplı kutuda 4 ˚C görüntüye kadar hazır tutun. Görüntü hazır olduğunuzda ~ 376 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant tamamen kaldırmak pipetting göre. Aşağıdaki gibi enzimler ile GLOX içinde resuspend.
  13. Hemen yansıma örnekleri için 15-20 µL GLOX arabelleği enzimler ile ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için damlalıklı.
    Not: eklendi birim hücre Pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir. Biz 15 µL GLOX arabelleği enzimler ile Pelet resuspending tavsiye ve mikroskop hücre yoğunluğu kontrol edin. Hücreleri (çok yoğun hücreleri birbiri topaklanma) varsa, enzimler ile ilave GLOX tampon ekleyin. Hücreleri çok seyrek ise örnek santrifüj kapasitesi ve ~ 5 µL arabelleği kaldırın.
  14. Damlalıklı 5 µL üzerine bir coverslip (18 mm x 18 mm, No. 1) ve koymak bir slayt üzerinde coverslip.
  15. Coverslip yerleştirildiği bir laboratuvar silin slayt üzerine koy. Yavaşça laboratuvar silme slayt (sıvı tüm dört coverslip kenarlarından çıkıyor görmelisiniz) ayarlamak için tuşuna basın.
  16. Slayt alüminyum folyo ile kaplı bir kutu içinde mikroskop Oda aktarın.
  17. Yüksek büyütme (60-100 X) ve yüksek sayısal diyafram ile geniş alanlı floresan mikroskop kullanarak görüntü.
    Not: önemli ölçüde tahsil edilecek ışık miktarını sınırlamak gibi smFISH sondalar tarafından yayılan fotonlar maksimum sayıda toplamak için confocal mikroskoplar, tavsiye edilmez. Burada, veri toplanmıştır üzerinde bir 100 X, 1.4 NA amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) görüntüsü 1.3 s, %100 T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, %100 T; ve DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, %32 - %50 T. Bir parlak alan başvuru yansıması da elde edilebilir. Adım boyu ile 15-25 dilim 0,1-0,2 elde µm, üzerinden tamamen aşağıda görüş alanı tamamen yukarıda, odak tüm sağlamak için RNA noktalar sayılı mı.

4. görüntü analizi

  1. Balık-quant17 ve StarSearch2gibi yayımlanmış smFISH analiz araçları ile veya deneme tam ihtiyaçlarına bağlı olarak özel programları ile smFISH veri analiz.
    Not: Bir iyi analiz boru hattı doğru RNA noktalar ayrı arka plan ve X, Y ve Z (isteğe bağlı) koordinatları ve her yerinde, her hücrede noktaların sayısını yoğunluğu gibi istatistikleri çıkış için bir eşik belirlemek kullanıcılara izin vermelidir ve muhtemelen yanlış algılamaların filtre uygulamak için bir yol olarak parametreleri uygun.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ne kadar iyi çalıştı smFISH Protokolü (anahat içinde Şekil 1), NDC80 gen açık okuma çerçevesi karo 54 probları bir dizi tasarlanmış değerlendirmek için (Şekil 2A, üst). En sonunda 5' bulunan prob prob 1 adlandırılır; bir sonraki, sonda 2; ve üçüncüsü, yoklama 3, vb. 27 probları garip bir atanan sayı (Probe 1, 3, 5...) tüm CAL Fluor 590 (CF590) floresan boya için; Birleşik ve Quasar 670 (Q670) floresan boya için Birleşik bir çift sayı (Probe 2, 4, 6...), 27 probları atanır. Bu nedenle, bu alternatif sonda kümeleri probları "tek/çift" anılır. Hibridizasyon, her iki prob kümeleri aynı transkript etiket.

Nokta algılama sonra biz smFISH veri kümesi kalitesini yargıç için birkaç ölçümleri kullanılır. Birincisi derecesi ve kalitesini colocalization için tek/çift probları oldu. Bizim durumumuzda, beklenen verilen değer içinde herhangi bir renk olan her diğer (eşleştirilmişŞekil 2C,), 2 piksel yakınına eşleştirilmiş noktalar ve algılama % 95'i daha büyük (Şekil 2A ve 2B), smFISH lekelerin % 88 colocalized sapmaları iki floresan kanallar arasında. Buna karşılık, bir komşu en yakın mesafe az 2 piksel, spot bir çift Algıla olasılığı düşük olduğunu gösteren unpaired noktalar % 10'dan az vardı (Şekil 2C). % 12'si unpaired noktalar eşit iki kanal arasında ayrıldı (Şekil 2B

>

Floresan in situ hibridizasyonu, gösteren akış şeması; formaldehit fiksasyonu, zimolsen sindirimi, hibridizasyon.

NDC80 mRNA lokalizasyonu, prob görüntüleme, floresan mikroskobu, istatistiksel grafik sonuçları.

NDC80 geni smFISH ekspresyon analizi; çubuk grafik; nokta eşleştirme kesirleri; CF590, Q670 işaretleyicileri.

Gen ekspresyon mikroskobu; floresan deneyi; NDC80 görselleştirme; sinyal/gürültü grafikleri; CF 590, Q 670 karşılaştırması.

NDC80 gen diyagramı, floresan mikroskobu, mayoz bölünme sırasında protein ekspresyonu, bant yoğunluğu analizi.

Kolokalizasyon çalışması için hücre başına varyans/ortalama ve spot fraksiyonu gösteren smFISH analiz grafiği.

NDC80 transkript frekans dağılımı; çubuk grafik; Vejetatif büyüme ve mayotik faz analizi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan Protokolü diğer yayımlanmış smFISH iletişim kuralları2,3,21,22,23türetilmiştir ve özellikle Maya zorlanma arka SK1 için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş parametreler cep telefonu numarasını, fiksasyon süresi, Santrifüjü hız ve süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon arabellek dahil. Hibridizasyon sıcaklığı ve süresi gibi diğer parametreler optimize edilmemiş. Bu bölümde, bu protokol için herhangi bir Maya zorlanma arka plan ve faiz büyüme koşullarına uyum yardımcı olacak bir kaç not paylaşıyoruz.

Mayası hücre duvarına hücre duvarı sonda penetrasyon engelleyeceğinden mayası yüksek kaliteli smFISH görüntüleri alma karşı büyük bir sorun olduğunu. Hücre duvarı zymolyase tarafından eksik hazım sonda ve sinyal yüksek hücre hücre değişkenlik verimsiz hibridizasyon yol açar. Ancak, aşırı sindirim hücreleri çok kırılgan yapmak, önemli yol kaybı çamaşır adımları sırasında hücre ve görüntüleme için slayt hazırlık sırasında patlama hücre. Böylece, sindirim süresi optimize etmek çok önemlidir. Aynı örnek zaman farklı miktarda sindirerek tarafından pilot smFISH deney tavsiye ediyoruz. ~ %80 hücre refraktif sigara olunca sindirim durdu eğer bizim durumumuzda biz en iyi smFISH veri aldı. Genellikle, aynı büyüme koşulu için farklı genetik mutant suşları ile benzer zamanlama sindirmek. Ancak, sindirim süresi farklı büyüme koşulları ve mayoz mayası içinde farklı aşamalarında arasında karşılaştırıldığında farklıdır. Zamanlama belirlendikten sonra smFISH tekrarlanabilir kalitesidir. Not Ayrıca hafif kusurlu hücre duvarı sentezi ve/veya kompozisyon mutant suşları için sindirimi daha az 15 dk. zymolyase farklı gruplar halinde kullanımı tamamlanabilir sindirim zamanlama değişebilir.

En iyi sonda konsantrasyonu yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için gereklidir. Tasarlanmış ve bizim smFISH sondalar ticari olarak satın aldı. İyi problar (genellikle 20-mers) % %35 45, 2 baz çifti sonda ve düşük olan arasında en az bir boşluk arasında değişen GC yüzdesi olmalıdır. Biz bir web tabanlı sonda tasarımcı üretici probları listesi oluşturmak için kullanılan ve seçim için yeterli probları olsaydı, patlama algoritması Saccharomyces genom veritabanında sondalar fazla 17 baz çifti ile örtüşen ortadan kaldırmak için kullanacağımızı genomik diğer bölgeleriyle. Bu kümedeki tüm yukarıdaki ölçüt (20 probları) memnun probları sayısı daha düşük olduğu için NDC80luti (CF 590) benzersiz bölgesine anneals sonda küme için daha fazla photostable floresan boyalar (CAL Fluor 590) seçtik (~ 25 probları) üretici tarafından önerilen en az sayıda. Üreticinin yönergelerini izleyerek sonda çözüm başlamaktan sonra yaptığımız bir 1:10 seyreltme hisse senedi çözüm oluşturur ve seyreltik çözüm-20 ˚C adlı 5-µL aliquots. Her aliquot yalnızca bir kez kullanıldı. Optimizasyonu için bir seri yapmak gerekir dilutions 1:10 seyreltilmiş çözüm ve test hangi toplama en iyi sinyal-gürültü oranı verir. 1:250, 1:500, 1: 1000 ve 1:2000 özgün stoktan seyreltme dizi yapım tavsiye ediyoruz. Bizim durumumuzda, CF 590 ve Q 670 sonda kümeleri için en iyi sinyal-gürültü oranı 1:500 seyreltme faktörü sonuçlandı.

En iyi fiksasyon zaman da başarılı smFISH mayası için önemlidir. Biz o gece fiksasyon 4 ˚C bulundu yerine, oda sıcaklığında 20 dakika, sabitleme önemli ölçüde tutarlılık ve kalite segregasyonun örnekleri için smFISH sonuçlarının geliştirilmiş. Her ne kadar biz nasıl gecede fiksasyon bitkisel örnekleri etkisi olabilir test etmedim, fiksasyon, oda sıcaklığında bu büyüme durumu iyi çalıştı. Böylece, smFISH Protokolü yeni suşları veya büyüme koşulları için en iyi duruma getirmek için kısa fiksasyon saat oda sıcaklığında ile başlayan ve yüksek sinyal değişkenliği oluşursa fiksasyon zaman artan öneririz.

Diğer yayımlanmış protokolleri3,22,23ile karşılaştırıldığında, sindirim ve VRC daha yüksek bir konsantrasyon hibridizasyon sırasında sırasında RNase inhibitörü VRC bizim protokolünü kullanır. VRC ek olarak aşağıdaki iki adımı gelişmiş tutarlılık smFISH sonuçlarının muhtemelen daha iyi RNA molekülleri (enzim ham özleri saf ve RNase içerebilir zymolyase karıştırmak yanında tanıttı nükleaz etkinliğe karşı koruma kirletici maddeleri). Böylece, bizim iletişim kuralı veya VRC daha yüksek konsantrasyonlarda optimizasyonu için listelendiği gibi VRC miktarı kullanmanızı öneririz.

Hücreleri önemli bir kısmını arabellek B ve formamide yıkama arabellek çamaşır adımları sırasında kaybolabilir. Hücre kaybı azaltmak için Santrifüjü hızını artırmak. Bizim durumumuzda, örneklerimizi sırasında arabellek B cips için yüksek hızlı (21.000 x g) kullanarak önemli ölçüde azaltılmış hücre kaybı yıkar. Ancak, dolayısıyla Santrifüjü hızını değiştirme değil önerilir hücreleri zymolyase sindirim sonra çok kırılgan hale gelir. Bunun yerine, büyük ölçüde yıkama formamide yıkama arabellekte sırasında hücreleri cips yardımcı düşük yapışma tüpler bilimsel ABD üzerinden kullanmanızı öneririz. Genel olarak, bizim iletişim kuralı sürekli hücre verimli görüntüleme için yoğun bir monolayer oluşturabilirsiniz. Genellikle, 7 alanları bakış verim > 130 hücreleri miktar için uygun.

Son olarak, en uygun parametreler için ve görüntü analizi gerekli çıkışları belirlemek önemlidir. SmFISH noktalar algılamak için yayımlanan analiz programları yaygın olarak ham görüntüleri arka plan sinyal kaldırmak için Gauss çekirdek kullanarak filtre ve kullanıcılardan görüntüleri2,17her kümesi için kullanılacak sinyal-gürültü oranı belirlemek ister. Ne yazık ki, şu anda tek bir standart hangi tarafından uygun parametreleri belirlenir değildir ve bu yüzden bazı ampirik bu farklı ayarları test gereklidir. Bu adımların her biri için gerekli parametreleri ayarlamak için bir tekrarlayarak farklı parametre kümesi giriş ve ne kadar iyi her kümesinden elde edilen sonuçları maçlar bu el ile birkaç temsilcisi hücrelerde sayım odasından kontrol gerekiyor. Bir parametre kümesi bulunduktan sonra farklı büyüme koşulları ve genetik arka planlar rağmen elde edilen görüntülerin çoğu için kullanılabilir.

Ayrıca, maksimum yoğunluk projeksiyon smFISH görüntülerin miktar22önce gerçekleştirilen bir test edebilirsiniz. Bu adım nokta algılama algoritması basitleştirir ve önemli ölçüde bazı potansiyel olarak yararlı bilgiler rağmen onların hücre altı yerelleştirme gibi bireysel noktaları hakkında pahasına görüntüleme süresini azaltır. Bizim durumumuzda, mRNA molekülleri NDC80 Gen tarafından üretilen sayısı yeterince düşük noktalar de bu işlendikten sonra (tutanaklar tomurcuklanma içinde3,7Maya için nadir değildir) ayrı kaldık. Colocalization Analizi kritik nerede durumlarda analiz boru hattı colocalization değerlendirmek için her kanaldaki her smFISH spot konumunu belirlemek gerekir. Bağlı olarak özel sorular sordu, her nokta yoğunluğu gibi diğer bilgileri de boru hattı daha ayrıntılı bir çözümleme için elde edilebilir gerekebilir. Anahtar en iyi duruma getirme iletişim kuralında adımlar ve görüntü analiz boru hattı yüksek faiz soru çalışmaya smFISH verilerin kalitesini elde etmek çok önemlidir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anne Dodson teşekkür ediyoruz ve Stephanie Heinrich smFISH Protokolü en iyi duruma getirme konusunda tavsiye için Xavier Darzacq için analiz platformunda, Haiyan Huang öneriler istatistiksel analizi için yardım edin. Bu eser Mart Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable güvenir (00027344), Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (35-15) ve Glenn Vakfı'na EÜ ve bir NSF yüksek lisans araştırma bursu Grant No fon tarafından desteklenmiştir DGE-1106400 Dizayn Merkezi için.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BSA, RNaz içermeyen (50 mg / mL)AmbionAM2616-20 ° C'de saklayın.
KatalazSigmaC3515Mağazası 4 > Kısa vadeli için C. Kullanmadan önce girdap.
DAPISigmaD9564Mağazası -20 &°C; Suda sulandırıldıktan sonra C. Işıktan koruyun.
% 50 Dekstran SülfatMilli GözenekliS4030Oda sıcaklığında saklayınız. Çok viskoz sıvı. Sabırla ele alın.
E. coli tRNASigmaR4251-20 ° C'de saklayın; Suda sulandırıldıktan sonra alikotlarda C.
Etanol (% 100, 200 geçirmez)çeşitliYanıcı.
% 37 FormaldehitFisherF79-500Oda sıcaklığında saklayın. Zehirli. Dikkatli kullanın ve atın.
FormamidAmbionAM93424 ° C'de saklayın Oksidasyonu önlemek için sıcaklık oda sıcaklığına dengelendikten sonra açın. Zehirli. Dikkatli kullanın ve atın. 
Glikozçeşitli4 &° C'de saklayın; C, nükleaz içermeyen suda çözüldükten sonra.
Glikoz oksidazSigmaG2133-20 ° C'de saklayın; 50 mM NaOAc, pH 5'te sulandırıldıktan sonra alikotlarda C.
Nükleaz içermeyen suAmbionAM9932Oda sıcaklığında saklayın.
Potasyum fosfat (monobazik ve dibazik)çeşitliOda sıcaklığında saklayın.
Prob kütüphanesi, TE ile seyreltilmiş, pH 8.0 Biyoarama TeknolojileriMağazası -20 &°C; Alikotlarda C (5 &mikro; L) TE pH 8.0'da sulandırıldıktan sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak. Işıktan koruyunuz.
SorbitolçeşitliOda sıcaklığında saklayın.
20X SSCAmbionAM9763Oda sıcaklığında saklayın.
TE, pH 8.0AmbionAM9849Oda sıcaklığında saklayın.
1 M Tris, pH 8.0AmbionAM9856Oda sıcaklığında saklayınız.
TroloxSigma238813 Mağazası -20 &°C; Alikotlarda C.
200 mM Vanadil ribonükleozit kompleksi (VRC)NEBS1402S-20 ° C'de saklayın; Sulandırıldıktan sonra C, üreticinin talimatlarını izleyerek.
Zymolyase 100TMP Biyomedikal08320932-20 ° C'de saklayın; Suda sulandırıldıktan sonra alikotlarda C.
Düşük yapışma özelliğine sahip tüplerUSA Scientific1415-2600Oda sıcaklığında saklayın.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506(2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417(2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007(2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek Molek l FISHRNA n Situ HibridizasyonMayoz AnaliziGen Ekspresyonu KantifikasyonuTranskript zoform TespitiSubsel ler RNA LokalizasyonuH creden H creye De i kenlikNDC80 Gen al masFloresan Mikroskopi

İlgili makaleler