Yöntem makalesi

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

DOI:

10.3791/57780

⸱

26 Haziran 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sitokinler, otoimmün hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sitokin düzeyleri ölçümü bir girişim self-tolerance ve sonraki otoimmünite dökümü yol açan kesin mekanizmalar anlamak için birden fazla çalışmaların odak noktası olmuştur. Yaklaşımlar şu ana kadar belirli bir yönü (tek veya birkaç hücre tipleri veya sitokinler) bağışıklık sisteminin çalışmaya dayanarak ve karmaşık otoimmün hastalık genel bir değerlendirmesini sağlamaz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz. Sitokin üretim faktörleri, dolaşan "içsel" hasta özel plazma bağlamında birden çok alt bağışıklık hücre kümeleri içinde değerlendirmek için kapsamlı bir tek hücreli yaklaşım burada açıklanmıştır. Bu yaklaşım sağlar hastaya özgü bağışıklık fenotip (yüzey işaretleri) izleme ve fonksiyonu (sitokinler), ya da onun yerli "içsel patojenik" hastalık devlet, veya terapötik ajanlar (içinde VIVO veya ex vivo) huzurunda.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otoimmün hastalıklar morbidite ve mortalite nüfusun % 3-8 etkileyen önemli bir nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen genç ve orta yaşlı kadınlarda ölüm nedenleri otoimmün hastalıklar arasındadır (Yaş < 65 yaş)1,2. Otoimmün hastalıklar türdeş olmayan klinik sunum ve çeşitli temel immünolojik süreçleri ile karakterizedir. Heterojenite yelpazesi de romatoid artrit (RA) eklem tutulumu ve nörolojik hastalığı multipl skleroz (MS) gibi farklı bozuklukları arasında temsil edilir. Ancak, bu düzeyde heterojen da sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi tek bir bozukluğu içinde örneklenir: Diğer hematolojik veya eklem tutulumu3acı çekerken bazı hastalar böbrek patolojisi ile takdim edebilir miyim.

Otoimmün hastalıklar temel immunopathogenesis auto - ve hiper-harekete geçirmek-in birden fazla doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ve eşlik eden dysregulated sitokin üretim ile ilgili klinik heterojenite yansıtır. Sitokinler otoimmün hastalık patogenezinde önemli rol oynarken, hastalığın mekanizması içindeki belirli rolü anlamak zor olduğu ispatlanmıştır. Sitokinler tarafından Pleiotropi ile karakterize (bir sitokin farklı hücre tipleri üzerinde birden fazla etkileri olabilir), (birden çok sitokinler aynı etkisi olabilir) artıklık, ikilik (bir sitokin pro veya anti inflammatory etkileri farklı koşullar altında olabilir), ve plastisite (sitokinler kalıp içine bir rol farklı ortama bağlı "orijinal" onun bir)4,5,6. Sonuç olarak, nüfus düzeyinde yöntemleri aynı "sitokin ortamın" türdeş olmayan hücresel yanıt ayırt edemez. Benzer şekilde, çalışma (bir tek hücre türü veya sitokin) bağışıklık sisteminin bir belirli konu üzerinde odaklanmak tasarımları, karmaşık otoimmün hastalığı dahil tüm öğeleri genel bir değerlendirmesini sunuyor musunuz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz.

Son zamanlarda, aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak için bir tek hücreli proteomik yaklaşım geliştirdik. Burada açıklanan iş akışı bozulmamış çevre tam kan örnekleri, izole periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) karşı kullanımı ile karakterizedir. Bütün kan periferik sistemik immün aracılı hastalığı otoimmün hastalığı (yani, nötrofiller, trombosit) ve 2) plazma kez dahil 1) Sigara-mononükleer kan hücreleri de dahil olmak üzere, eğitim için en fizyolojik ilgili araç temsil eder. Nükleik asitler, immün kompleksler ve sitokinler, gibi faktörler dolaşan olan bağışıklık aktive rollere sahip. Yakalamak için "içsel patojenik" dysregulated sitokin üretim, periferik kan örnekleri hemen sonra kan alımı (T0, sıfır) ve 6 h, 37 ° c (fizyolojik vücut ısısı) bir protein taşıma ile kuluçka sonra işlenir inhibitörü "içsel" hastalık durumu (Şekil 1) yansıtacak sitokin üretim (birikimi, T6-T0) tespit etmek için herhangi bir eksojen uyarıcı durumu (T6, saat 6 h), yokluğunda. (6 h kuluçka protein taşıma inhibitörü ile 37 ° C'de) üzerinden yansıtmak dysregulated işlemler veya periferik kan örnekleri olan yolları bağışıklık yanıtı hastalığa, ilgili yer işaret altında aktif çalışmaya bir eksojen ile tedavi Nükleik asitler yanıt yansıtacak sitokin üretim algılamak için geçiş ücreti-gibi-reseptör (TLR) agonistler SLE (T6 + R848, zaman 6 1 µg/mL ile R848 s), söz konusu olduğunda gibi hastalık patogenezinde yansıtır koşulu uyarıcı (T0 vs T6 vs T6 karşılaştırma + R848, Şekil 1). Onlar kesin bağışıklık dysregulated işlemler için belirli hasta ilgilendirmeyen olarak kullanılabilir therapeutics ex vivo, etkileri immunomodulatory eğitim için periferik kan örnekleri bir JAK inhibitörü ile ilgili, terapötik değerlendirilir konsantrasyonu (burada, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, süre 5 ile 6 h uM ruxolitinib), "iç" hastalık durumunda ilaç (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Şekil 1) karşılık olarak değişiklikleri algılamak için. JAK inhibitörleri gibi ra otoimmün hastalıkların tedavisinde başarılı olduğu gösterilmiştir çünkü bir JAK önleyici bu çalışma için seçildi

Aynı anda birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri, SLE periferik kan örnekleri yukarıda açıklanan dysregulated işlemleri değerlendirmek için hasta ve sağlıklı kontrol yukarıda açıklandığı gibi işlenen ve kitle sitometresi tarafından analiz. 7,8,9spektral konularda örtüşme olmadan kitle sitometresi, olarak da bilinen sitometresi-zaman--uçuş, 40'tan fazla parametreleri tek hücre analizi sunmaktadır. Bu tekniği nadir toprak metal izotoplar çözünür metal iyonları şeklinde Etiketler antikorlar, fluorophores10yerine bağlı olarak kullanır. Kitle sitometresi teknolojik platform (Yani, ayar ve kalibrasyon, örnek alma) ile ilgili ek ayrıntılar bulunabilir Leipold vd ve McCarthy vd. 11 , 12 yüksek-boyutluluk kitle sitometresi, tek hücreli taneciklik (Malzemeler tablo) ile aynı anda birden fazla sitokinler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri boyunca ölçümü sağlar.

Geçerli geleneksel klinik ve laboratuvar parametreleri hassas veya devam eden hastalık aktivitesi veya belirli immunomodulators13daha iyi temel bağışıklık betimlemek gerek yansıtan, cevaben algılamak için belirli genellikle değildir flare-up sürücü değişiklikleri. Sitokin bozukluk kapitalistleri otoimmün hastalığı göz önüne alındığında, antikorlar veya sitokinler hedefleme veya sinyal proteinleri sitokin üretiminin yönetmelikte yer alan küçük moleküler inhibitörleri kullanın tedavi yaklaşımları bir bolluk var Son zamanlarda ortaya çıkan. Temel biçimiyle, burada açıklanan periferik kan analitik yaklaşım hastaya özgü dysregulated hücre alt kümeleri ve anormal sitokin üretim sistemik bulgular ile otoimmün hastalık tanımlamak için bir platform sağlar. Bu metodoloji tedavi seçenekleri kişiselleştirme için belirli dysregulated sitokinler belirlenebilir ve spesifik tedavi seçenekleri olabilir onların yetenek-e doğru immunomodulate değerlendirmek için ex vivo hasta belirli hastalık test sağlar işlem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada Colorado birden çok kurumsal İnceleme Kurulu (COMIRB tarafından), Colorado Üniversitesi onaylanmış olması. Aşağıdaki tüm açıklanan yordamlar steril doku kültürü mahallede, filtre uygulanmış pipet ipuçları ile belirtilmedikten gerçekleştirilmesi gereken ve tüm reaktifler filtre.

1. hazırlanması reaktifler periferik tam kan işleme için

  1. Ruxolitinib hisse senedi aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 10 mM üretici yönergelerine (mağaza-80 ° c) göre DMSO içinde reaktif lyophilized sulandrarak hazırlayın. DMSO konsantrasyonu % 0,2 (vol/vol) aşağıda unstimulated denetimleri de dahil olmak üzere tüm deneyleri unutmayın.
  2. R848 hazırlamak (resiquimod) stok aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 1 μg/μL steril su lyophilized reaktif sulandrarak tarafından üretici yönergelerine başına. Mağaza-80 ° C'de
  3. Lipopolysaccharide (LPS) hisse senedi aliquots (sadece bir süre için şişe başına 5 μL) 1 μg/μL, steril su üretici talimatları uyarınca lyophilized reaktif sulandrarak hazırlayın. Mağaza-80 ° C'de
  4. PBS, % 0.5 BSA ve %0.02 NaN3kullanarak hücre boyama medya (CSM) hazırlayın.
  5. Alacak ve protein taşıma inhibitörü (PTI) kokteyl (Tablo reçetesi) hazır tutun.
  6. Çözülme ve ruxolitinib hisse senedi flakon (10 mM) 1: 10'steril PBS (1 mM) oranında seyreltin. Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
  7. Çözülme ve R848 hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1:10 steril PBS seyreltik (0,1 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
  8. Çözülme ve LPS hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1: 100 steril PBS içinde seyreltik (0.01 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
  9. Steril RPMI (yok L-glutamin) bir standart 37 ° C su banyosu (için en az 10 dk) önceden ısıtmak.
  10. 1:5 filtre uygulanmış GKD2O (çalışma konsantrasyonu) (steril olması gerekmez) benchtop tarafından lyse/düzeltme arabellek sulandırmak.
    Not: tam kan 1 mL 20 mL çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek gerektirir.
    1. Parçalayıcı/düzeltme arabellek tam kan her (en az 100 mL), 1 ml 5 koşulları için yapmak. Lyse/düzeltme arabellek çalışma konsantrasyonu tam kan (keep lyse/düzeltme çözüm gerekinceye kadar 37 ° C'de) mililitre başına 50 mL konik tüpler içine aliquot 20 mL. Aşağıdaki gibi koşullar/düzeltme arabellek içeren konik tüpler koşullara etiket: T0 (zaman sıfır), T6 + 5R (zaman 5 ile 6 h uM ruxolitinib), T6 + R848 (zaman 6 h ile 1 μg/mL R848), T6 + LPS (zamanla 6 h 0,1 μg/mL LPS), T6 (6 h zaman).
  11. Etiket yuvarlak kapaklar ile alt steril polistren tüpler ve 1 mL microcentrifuge tüpleri ile adım 1,10 olduğu gibi aynı adlandırma.

2. stimülasyon ve periferik tam kan (Şekil 1) işlenmesi

  1. Etiketli alt polistren tüpler adım 1,11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) bir raf üzerinde yuvarlak yerleştirin.
    Not: Aşağıdaki adımların tümünü Aksi belirtilmediği sürece bu tür tüp içinde gerçekleştirilir. Tüpler doku kültürü hood ve kısırlık korumak için inkübatör transfer ederken kap.
  2. 37 ° C RPMI (yok L-glutamin) 1 mL tüpler (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) için ekleyin. Kan toplama tüp birkaç kez ters çevir, her tüpün tam kan 1 mL ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez RPMI ile iyice karıştırın (RPMI ile seyreltme engeller kanı 6 h kuluçka döneminde topaklanma).
  3. 1:10 10 μL eklemek ruxolitinib T6 + 5R. P1000 pipet ile iyice karıştırın. 37 ° C'de kuluçka tüpler rafa yerleştirin ve kuluçka zamanlama başlar (T = 0).
  4. T0 örnek aşağıdaki gibi işlem.
    1. T0 tüp tüm içeriğini 37 ° C çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabelleği 20 mL içeren etiketli bir konik tüp pipette. Hücre kurtarma en iyi duruma getirmek için çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek ile tüp durulayın. Konik tüp ters çevirme karıştırın.
    2. Lizis ve fiksasyon için izin vermek 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Fiksasyon, benchtop, tüm sonraki adımları uygulayın. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant dikkatle boşaltmak. Buz soğuk PBS Pelet kadar kırmak için 1 mL hücrelerde resuspend sonra konik bir 15 mL birime PBS ile doldurun.
    4. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant dikkatle boşaltmak. Granül kırmızı PBS yıkama (adımları 2.4.3–2.4.4) işlemini yineleyin. CSM Pelet kadar kırmak, sonra antikor boyama için etiketli microcentrifuge tüp (adım 1.11) aktarmak için 1 mL hücrelerde resuspend. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 µL örnek almak.
      Not: tüm hücreleri bu noktada sabitlenir beri bu canlılığı leke eklemek gerekli değildir.
    5. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Pelet rezidüel hacim ~ 60 µL içinde bırakarak süpernatant, Aspire edin. Diğer koşullar örnekleri işlem tamamlanıncaya kadar bu pelet buz üzerinde tutun.
  5. 30 dk, T = tüp raf (adım 2.3) doku kültürü hood taşımak ve aşağıdakileri gerçekleştirmek.
    1. 0,1 μg/μL 10 μL eklemek R848 T6 + R848. P1000 pipet ile iyice karıştırın.
    2. 0,01 μg/μL LPS 10 μL T6 + LPS ekleyin. P1000 pipet ile iyice karıştırın.
    3. Protein taşıma inhibitörü (500 X hisse senedi) 4 μL eklemek T6, T6 + 5R ve T6 + LPS (ama değil T6 + R848) ve örnekleri için kuluçka T kadar dönmek 6 h. Mix P1000 pipet her 2 h ile iyice =.
      Not: R848 bir endoplasmic TLR agonist ve bu nedenle onun hedef reseptör erişimi için izin vermek için protein taşıma inhibitörü eklenmesi geçici gecikmeden gerektirir.
  6. 2 h, T = 4 μL protein taşıma inhibitörü kokteyl (500 X hisse senedi) eklemek T6 + R848 tüp. Tüm örneklerini P1000 pipet ile karıştırın ve raf için kuluçka T kadar dönmek 6 h =.
  7. Örnekleri ile bir P1000 t bir kez daha karıştırın 4 h =.
  8. T = 6 h, proses T6, T6 + LPS, T6 + R848 ve T6 + 5R kan örnek tüpler açıklandığı gibi adım 2.4 T0 örnek için.
  9. Hücre topakları kalan CSM birim gelecekteki bir tarihte işlemeye-80 ° C'de depolayın. Alternatif olarak, barkod ve antikor depolamadan boyama devam edin.

3. kan hücrelerinin Lysed/Sabit barkod

  1. Buz üzerinde yavaş yavaş-80 ° C depodan lysed/sabit hücre örnekleri çözme; en fazla 20 örnekleri ile benzersiz barkod etiketli ve bu sistemi kullanarak havuza alınmış. 1:10 PBS ile 10 X barcoding perma arabellek seyreltik; ~ 3 mL örnek başına için yeterli arabellek olun.
  2. Bir non-steril yalak CSM ve 1 X barcoding perma arabellek ile doldurun. Buz 1 mL ekleyin taze çözülmüş örnekleri, soğuk CSM bir pipet ile iyice karıştırın ve transfer için ilgili önceden etiketli Polipropilen küme tüpler.
  3. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 μL örnek almak. 1,5-2 katı örnek her küme tüp başına 106 hücre hücre sayısı normale: kaldırmak ve 2 x 106 hücre yukarıda aşırı hücre hacmi atın.
  4. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. 1 X barcoding perma arabelleği bir çok kanallı pipet ve oda sıcaklığında 5 min için 600 x g, santrifüj ile 1 mL hücrelerde resuspend. Süpernatant Aspire edin.
  5. Küme tüpler aynı sırada bir raf üzerinde barkod anahtar örnek onun barkod ile eşleşecek şekilde gösterildiği gibi hizalayın. Barkodlama perma arabellek X 800 μL 1, hücre kaybı azaltmak pipet uçları-(asla karıştırma) ile hücre Pelet dokunmadan küme tüpler tüm örnekleri tarafından çok kanallı pipet ekleyin. Raf kümesi tüp ile bir kenara.
  6. -20 ° C ve çözülme oda sıcaklığında 20-plex Pd barkodlama Kit tüp şeritler kaldırın. 1 X barcoding perma arabelleği 100 μL eklemek, iyice karıştırın ve karşılık gelen hücre örnekleri küme tüpler içine resuspended barkod karışımı 120 μL transfer.
  7. Böylece hiçbir çapraz bulaşma ayrı ayrı barkodlu örnekleri arasında çok kanallı pipet tarafından iyice karıştırın. Küme tüpler hücreleri etiketlemek barkodlar izin vermek için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  8. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin, sonra 1 mL CSM resuspend.
  9. Santrifüj kapasitesi ve CSM içinde tekrar adım 3.8 olduğu gibi resuspend.
    Not: Her örnek şimdi benzersiz bir barkod ile etiketlenir ve örnekleri havuza alınmış hazır.
  10. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Tek bir pipet ve aynı ucu kullanarak, tüm hücre topakları ~ 70 – 80 aktarım μL kalan birime bir polistren tüp. Değil pipet ucu dışarı atmak; Bu uç ile tek pipet kenara.
  11. Bir çok kanallı pipet ve yeni ipuçları, ~ 100 μL CSM hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak için her özgün küme tüp ekleyin. Bir kenara koyun ucu tek pipet ile aynı polistren tüp ~ 100 μL artık birimdeki tüm hücre topakları aktarın.
  12. CSM polistren tüp (~ 3 mL) kapalı dön ekleyin. Sayısı ve kayıt havuza alınan barkod hücre sayısını ayarlayın. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Aynı gün barkodlu örnekleri boyama için devam edin.
    Not: ~ 20-%30 hücre iletişim kesilecek barkodlama sürecinde normaldir.

4. boyama barkodlu Lysed/kan hücreleri ve analiz için hazırlık kitle sitometresi araç üzerinde sabit

Not: antikor boyama her 1 X titresi (antikor 100 başına 1 μL tepki boyama μL), genellikle 3-4 x 106 hücre leke olabilir. Ne zaman tüm barkodlu örnekleri bir tüpün içine birikmiş, bu nedenle, antikor miktarı ölçekli olmalıdır. 20 barkodlu örnekleri tutarı 30 x 106 hücreler ve her 1 X titresi için 3-4 x 106 hücre leke olabilir, barkodlu örnek, ancak bir antikor (başına 1 X 20 X miktarda gerektiren tek tek, her örnek boyama aksine bir 10 X titresi, gereksinimi bireysel tüp). Cep numarası için antikor konsantrasyonu (burada tartışılan değil) her bireysel antikor için kokteyl dikkatle titre.

  1. Antikorlar (Tablo reçetesi) kullanarak hücre yüzey boyama ve sitokin indüksiyon için leke.
    1. Yüzey boyama kokteyl tutarın eklendi ve muhasebe için pipetting hata olmasını hesaplayarak yapmak (yani, 2 x 106 hücre her örneğinde, 20 barkodlu örnekleri boyama 10 X titresi leke ise gerekli son hacim hesaplamaları için; Pipetting hata için bir 10,5 X son çözüm boyama yaparak telafi etmek).
    2. 10 X barkodlu hücre Pelet birime boyama yüzey ekleyin. Aynı ucu hücre kaybı azaltmak için mix ve yüzey lekeleri ve hücre Pelet sesini ölçmek.
    3. Hücrelerin ve kokteyl boyama birimde dayanarak, CSM sayısına göre hücre örnekleri (el 20 örnekleri, X 20 = 1 mL 50 μL çalışsayani) 50 μL son boyama hacmi ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama tanıtmak için tahrik.
    4. Yüzey leke kuluçka sırasında O. Prepare birimleri için permeabilization 2 mL ve 5 mL yıkama sulandrarak 1:10 süzülmüş GKD2perma/yıkama arabellek (Tablo reçetesi) hazır olun. 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
    5. CSM ile tüp boyama yüzey kapalı üst ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj süpernatant Aspire edin. Barkodlu örnek 4 ° C, 1:10 2 mL resuspend seyreltme perma/yıkama arabellek. 20-30 dk tam hücreleri permeabilize 4 ° C'de kuluçkaya.
    6. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
    7. Hücre içi boyama için (gelince yüzey boyama) benzer boyama adımları izleyin. Ancak, 4 ° C, 1:10 kullanın seyreltme perma/yıkama arabellek CSM cilt hücreleri, hücre içi boyama boyunca permeabilizing bir ortamda kadın boyama toplam yapmak yerine.
    8. Hücre içi antikor yüzeye kokteyl lekeli ve hücre Pelet (adımları 4.1.2–4.1.17) permeabilized ekleyin. Hücre örnekleri sayısı başına 50 μL birime boyama toplam getir. 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama emin olmak için tahrik.
    9. Hücre içi boyama sırasında hazırlamak enterkalatörün çözüm: filtre uygulanmış PBS + filtre uygulanmış %16 100 μL 900 μL PFA (son konsantrasyonu % 1.6 PFA) + 0.2 μL 500 enterkalatörün boya (Tablo malzemeler), uM.
    10. Kapalı hücre Pelet + hücre içi antikor soğuk 1:10 ile kokteyl perma/yıkama arabellek üst.
    11. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. CSM ile boyama tüp kapalı üst. Saymak ve telefon numarası kaydedebilirsiniz. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. 1 mL enterkalatörün çözeltisi adım 4,9 hücrelerde resuspend. Tam enterkalasyon için oda sıcaklığında en az 20 dk için kuluçkaya, veya bir gece 4 ° c (enterkalatörün çözüm örnekleri 4 ° C'de onları kitle sitometresi araç üzerinde çalıştırmadan önce 1 hafta kalabilir).
  2. Hücreleri toplu sitometresi enstrüman için hazırlayın.
    1. «Ana sayfa» kapalı süzülmüş GKD2O 3 mL ve 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj tüpü Filtre uygulanmış GKD2O. geçmek 3 mL hücrelerde bu süspansiyon herhangi bir enkaz veya potansiyel olarak kitle sitometresi enstrüman yapışmasına neden toplamları kaldırmak için 100 mikron filtre resuspend.
    2. Say ve hücre sayı sonrası filtrasyon kaydetmek. 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj
  3. 1:10 süzülmüş GKD2O. sulandrarak kalibrasyon boncuk çözüm (Tablo reçetesi) hazırlamak
  4. Lekeli resuspend 1:10 gerekli cilt hücrelerinde hücre konsantrasyonu 106 hücre/mL x 1 ~ ulaşmak için kalibrasyon boncuk çözüm seyreltilmiş.
    Not: 45 µL/min bir CyTOF1 için önerilen optimum 5 x 105 hücre/mL olduğunu; 30 µL/dk, 7.5 x 105 hücre/mL Helios için.
  5. Kitle sitometresi enstrüman9tarihinde örneği çalıştırmak için devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İş akışı uyarılması için Şekil 1 gösterir ve kan örnek aliquots, tahsisi de dahil olmak üzere periferik kan örnekleri işleme zamanlama stimülasyon ajanlar, protein ek taşıma inhibitörü kokteyl ve kuluçka kez kırmızı kan hücresi (RBC) lizis ve fiksasyon kadar. Seçtiğiniz uyarıcı ajanlar bir değerlendirmesi için hedeflenir sinyal ve sitokin yollar bağlı olacaktır. Örneğin, burada açıklanan protokolünde TLR agonistler doğuştan gelen bağışıklık algılama mekanizma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada biz bir roman, tek hücreli, proteomik yaklaşım aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak açıklar. Bu yöntemi periferik tam kan analitik araç ve toplu sitometresi bağışıklık hücresel fenotipik ve fonksiyonel anormallikler değerlendirilmesi için araç olarak kullanır. Yöntem insan ve fare çalışmaları21' e kolayca uygulanabilir ve sinyal anormalli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aimee Pugh-Bernard onun fikri girdi ve yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Boettcher Vakfı Webb Waring Biyomedikal Araştırma Ödülü ve Ödülü K23-1K23AR070897 arasında sayı NIH Elena W.Y. Hsieh tarafından desteklenmiştir. O da ödül sayısı çocuk sağlığı ve insan gelişimi ve Lucile Packard Vakfı tarafından K12-HD000850 Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı, Stanford CTSA UL1 TR001085 ve çocuk sağlığı araştırma için destekli yapıldı. Enstitüsü Stanford Üniversitesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RuxolitinibSanta CruzSC-364729AStok Konsantrasyonu: 10 mM; Son Sonuç: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5Stok Kons: 1 μ g/μ L; Son Sonuç: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsStok Konk: 1 μ g/μ L; Son Sonuç: 0.1 μ g/mL
Steril PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049Stok Kons: 5X; Son Conc: 1X (ddH2O içinde seyreltik)
BD Fosflow perma / yıkama tamponu IBD biosciences557885Stok Conc: 10X; Son Conc: 1:10 (ddH2O içinde seyreltik)
RPMIGibco21870-076
Sodyum Azide (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Stok Kons: %>99,9; Son Conc: 0.0002
Protein Taşıma İnhibitörü (PTI)eBiosciences00-4980-93Stok Kons: 500X; Son Konsantrasyon: 1X
DNA İnterkalatörFluidigm201192BStok Konsantrasyonu: 500 μ M; Son Sonuç: 0.1 μ M
Hücre Boyama Ortamı (CSM)PBS + %0,5 BSA, %0,02 NaN3
MaxPar Barkod Perma TamponSıvısıigm201057Stok Kons: 10X; Son Kapanış: 1X
20-plex Pd Barkod SetiFluidigmS0014Stok Konsantrasyonu: n/a; Son Çözüm: Yok
EQ TM< / sup> Dört Elemanlı Kalibrasyon BoncuklarıFluidigm201078Stok Konsantrasyonu: 10X; Son Konsantrasyon: 1X
%16 MeOH içermeyen Formaldehit ÇözeltisiTermo28908Stok Konsantrasyonu: %16 (a/h); Son Conc:% 1.6 (w / v)
Steril yuvarlak tabanlı polistiren tüplerVWR60818-496Stok Conc: n / a; Son Conc: n / a
Polipropilen küme tüpleriLight LabsA-9001Stok Conc: n / a; Son Conc: n/a
Helios CyTOF cihazıFluidigmHeliosCyTOF analizinde kullanılacak tüm solüsyonların metal kontaminasyonundan arındırılmış olması gerekmektedir. ddH2O, herhangi bir çözeltinin hazırlanmasında kullanılır, en az 18.0 MΩ direncine sahip olmalıdır. ddH2O ve kendi kendine hazırlanan solüsyonlar, hiç otoklavlanmamış yeni plastik veya cam şişelerde saklanmalıdır.
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Kütle Sitometrisi için kullanılan antikorlar
Yüzey belirteçleri
CD1cBiolegendL161Kütle: 161
CD3BDUCHT1Kütle: 144
CD4BiolegendSK3Kütle: 174
CD7BDM-T701Kütle: 149
CD8BiolegendSK1Kütle: 142
CD11bFluidigmICRF44Kütle: 209
CD11cBDB-ly6Kütle: 152
CD15BDHI98Kütle: 115
CD14BiolegendM5E2Kütle: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Kütle: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Kütle: 163
CD21BiolegendBu32Kütle: 141
CD27BDL128Kütle: 155
CD38FluidigmHIT2Kütle: 172
CD45 toplamBiolegendHI30Kütle: 89
CD45RABiolegendHI100Kütle: 153
CD56MiltenyiREA196Kütle: 168
CD66BDB1.1/CD66Kütle: 113
CD86FluidigmIT2.2Kütle: 150
CD123Fluidigm6H6Kütle: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AKütle: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Kütle: 162
IgDBiolegendIA6-2Kütle: 146
IgMBiolegendMHM-88Kütle: 151
CXCR5BDRF8B2Kütle: 173
HLADRBiolegendL243Kütle: 167
Sitokinler
IL-1 ve alfa;Biolegend364-3B3-14Kütle: 147
IL-1 ve beta;Biyoefsane H1b-98Kütlesi: 169
IL-1RASanta Cruz AS17Kütle: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Kütle: 164
IL-8BDE8N1Kütle: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Kütle: 171
IL-17A Biolegend BL168Kütle: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpKütle: 176
MIP1 ve beta;BDD21-1351Kütle: 158
MCP1BD5D3-F7Kütle: 170
IFN&alfa;Miltenyi LT27:295Kütle: 175
IFN&gama;Biyoefsane4S. B3Kütle: 165
PTENBDA2B1Kütle: 159
TNF & alfa;BiolegendMab11Kütle: 166
Not: Üretici Fluidigm olarak belirtilmişse, bu antikor metal önceden konjuge edilmiş olarak Fluidigm'den satın alınmıştır. Üretici Fluidigm'den farklı olarak belirtilirse, bu antikor MaxPar Multi-Metal Etiketleme kullanılarak kendi kendine konjuge edilmiştir  Kit (Fluidigm Cat: 201300) üretici protokolüne göre.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

İlgili makaleler