Yöntem makalesi

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

9.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57789

⸱

16 Temmuz 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Bu makalede

Özet

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Özet

Temel hücre süreçler, membran kaçakçılığı ve apoptosis, gibi çok çeşitli hücre zarının şekli geçişler kalsiyum iyonu konsantrasyonu yerel varyasyonlar ile aynı anda ortaya. Ana moleküler bileşenleri Bu süreçlerle ilgili tespit edilmiştir; Ancak, belirli Interplay kalsiyum iyon gradyanlar ve hücre zarı içinde lipidler arasında çok daha az, özellikle biyolojik hücreleri karmaşık yapısı nedeniyle bilinmektedir ve gözlem düzenleri, zor. Sentetik bir yaklaşım bu boşluğu için başarıyla hücre zarı taklit eder lokalize kalsiyum iyonlarının etkisi ortaya çıkarmak için uygulanır. Hücre içindeki koşullar benzemeye bir taklit kurma severalfold bir sorundur. İlk olarak, uygun boyutları ve membran kompozisyon bir yeterli biomimetic modeliyle hücrelerin fiziksel özelliklerini yakalamak için gereklidir. İkinci olarak, embriyolardan Kur az miktarda kalsiyum iyonları belirli membran konuma teslim için gereklidir. Son olarak, bir gözlem düzeni algılamak ve lipid membran yanıt dış uyarılması için kayıt için gereklidir. Bu makale, nerede multilamellar bir vezikül (MLV), bağlı bir dev unilamellar vezikül (şef) oluşan bir lipid vezikül sistemi için yerelleştirilmiş bir kalsiyum maruz kalsiyum iyon-membran etkileşim çalışmak için detaylı biomimetic yaklaşım sunar degrade mikroenjeksiyon sistemi kullanılarak oluşturulmuş. Membran iyonik etkisi dinamikleri floresans mikroskobu kullanılarak gözlenen ve video kare hızlarında kaydedildi. Membran uyarılması sonucu olarak son derece uzak membran odaklı Şef içinde oluşturduğu membran borulu çıkıntılar (MTPs) kavisli. Açıklanan yaklaşım tamamen temassız ve kontrollü bir şekilde lipid membran ve MTP üretim remodeling neden olmaktadır. Bu yaklaşım hücre zarının yeniden şekillendirilmesi mekanizmaları incelemek için yeni yollar sağlayan kalsiyum iyon-membran etkileşimlerin Ayrıntılar adres için bir araç sunar.

Giriş

Kalsiyum iyonları Biyolojik süreçler, sinyal, hücre bölünmesi ve membran fusion, özellikle onların katılımı içinde odak birçok mekanik çalışmalar1rolüdür. Hücre içi sitoplazmik kalsiyum iyonu konsantrasyonu sırasına 100dür nM, endoplazmik retikulum, salgı veziküller ve mitokondri, gibi organellerin kalsiyum süre kadar millimolars konsantrasyon onlarca düzeyleri ulaşmak. Bu hücre içi membranlar2,3,4,5,6,7arasında,8 dik kalsiyum iyon konsantrasyonu degrade büyüklük oluşturur ,9. Ekstrasellüler kalsiyum iyon düzeyi 2 mM civarında ve bu nedenle, her iki hücre dışı ve hücre içi düzeyde kalsiyum iyonu konsantrasyonu varyasyonları oluşur. Ayrıca, son çalışmalar bu hücre içi kalsiyum iyon olaylar sinyalizasyon kanıt ve nöronal aktivite ekstraselüler kalsiyum iyon konsantrasyonlarının, önemini gösteren yerel dalgalanmalar koşullar altında ortaya çıkabilir senkronize Intra - ve ekstraselüler kalsiyum iyon değişimleri10.

Kalsiyum iyonları ve biyolojik membranlar, yerel hücre zarlarında lipid bilayer veziküller ile yerine sentetik bir yaklaşım arasındaki etkileşimi anlamak amaçlayan başarıyla uygulamaya konmuştur. Veziküller kalsiyum iyon çözümlere açığa lipid kafa grupları ve hidrokarbon zinciri ambalaj, artan membran gerginlik ve vezikül toplama yanı sıra lipidler ve membran faz geçiş11,12 ayrılığı değişikliklere yol açar ,13,14,15,16. Lipid membranlar maruz kalsiyum iyonları için üzerine özelliklerini x-ışını, 1H-NMR ve spektroskopik veya termodinamik çalışmalar11,16, bu tür Deneysel teknikler kullanarak araştırdık 17 , 18. bu çalışmalarda membran kompozisyon kez yerel hücre zarlarında benzemek için ayarlanmıştır ve fizyolojik böyle lipidler phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) ve Fosfatidilserin (PS) içerir. PS hücre içi membran kaçakçılığı, ekzositozu ve Apoptozis19,20de dahil olmak üzere birçok hücresel süreçlerinde önemli bir bileşeni olduğundan yapay vezikül hazırlanmasında özellikle önemlidir.

Sentezlenmiş lipid veziküller boyutunu kez nanometre birkaç mikrometre arasında değişmektedir. Farklı vezikül hazırlıkları arasında dev unilamellar veziküller (GUVs), hangi are birkaç mikrometre çapında onlarca için bireysel boyutları hücreleri21 yakından benzeyen onların nispeten büyük boyutları nedeniyle özellikle önem vardır , 22 , 23. GUVs mevcut yüzey alanı yerel kimyasal degradeler etkisi incelenecektir için membran biyofiziksel özellikleri sağlar. Membran yüzey dış uyaranlara karşı yalnızca bir bölümünü açarak, membran dynamics daha yakından soruşturma. Örneğin, kimyasal ya da pH degradeler yerelleştirilmiş uygulama GUVs yüzeyine toplu poz24,25, gözlenen değil borulu çıkıntılar oluşumuna yol açar gösterilmiştir. Hücre zarının remodeling mekanizmaları biraz anlayışlar kazanmak için tek veziküllü sorgulama düzenleri yöntem geliştirilmesi için gözlenen membran davranış farklılıkları arayın.

Embriyolardan erken 1900'lerde26,ile27, 2000'lerde23,28 tek veziküllü manipülasyon düzenlerinden daha yeni gelişmeler ile bağlantılı olarak ve mikroenjeksiyon yöntemleri üzerine bina , bu makalede hangi membran yenileme ve membran borulu çıkıntılar (MTPs) Şef membran oluşumu oluşturulur kalsiyum iyonlarının yerel uygulama yanıt olarak bir yaklaşım sunuyor.

Yaklaşımımız bir biomimetic membran modeli sistemi (Şekil 1A) multilamellar bir vezikül (MLV) bağlı bir şef oluşan karmaşık bir vezikül kullanır. MLV olarak lipid depo kompleks kalsiyum iyon degrade maruz sırasında Şef lipid malzeme sağlamak için gereklidir. Bu bağlantı indüklenen tadilat sırasında membran gerginlik artışı telafi etmek ve Şef membran geçiş şekil ve lipidler MTP büyüme için sağlamak için karmaşık tanır. Kütlesi büyük olduğu için Ayrıca, yüzey immobilizasyon MLV kolaylaştırır Şef e kıyasla. Ne zaman bir katı substrat immobilize Şef-MLV kompleksleri daha önce nanotüp veziküllü ağlar üreten, polimer membran etkileşim eğitim ve ekzositozu29,30geç aşamalarında taklit için kullanılmıştır, 31,32,33.

Önceki iletişim kuralları soya polar lipit özü (SPE) Şef-MLV kompleksleri28hazırlamak için kullanılan. SPE phosphatidic asit (PA, % 6,9) ve diğer lipidler (% 6,9) karışımı içeren PC (%45.7), PE (%22,1), phosphatidylinositol (PI, %18,4), fosfolipitler karışımından oluşur. Burada bizim protokolünde, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodyum tuzu) % 20'si ile SPE karışımı katkılı hücre plazma zarı iç broşürü taklit etmek için (DOPS). Ek bir %1 sınav 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) membran floresans mikroskobu kullanılarak remodeling izleme özelliğini etkinleştirme lipid bilayer leke için kullanılır. GUVs simetrik lipid kompozisyon var bilayer arasında ve yerel olarak kalsiyum klorür (CaCl2) 5 mM konsantrasyonları maruz kalır. Bu deneysel koşullar, bir yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonu ile Ayrıca PS molekülleri ifade34nerede apoptotik hücrelerin dış membran broşür taklit. Şef-MLV kompleksleri oluşumu başlangıçta Criado ve Keller35tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş rehidratasyon su kaybı yöntemi kullanılmasını gerektirir. Vezikül hazırlık Protokolü sonra küçük veziküller içinde çözüm oluşturmak için kullanılan bir kuru lipid tabakanın oluşumu içerir. Bu çözüm sonra susuz ve son Şef-MLV konut projeleri oluşturmak üzere rehydrated. Şekil 2A -D tipik bir şef-MLV kompleks hazırlanması için ana adımları göstermektedir.

Vezikül hazırlık tamamlanmış ve karmaşık vezikül cam alt katman üzerinde immobilize sonra mikroenjeksiyon tekniği ile bir açık uçlu cam micropipette Şef e dış broşürü az miktarda kalsiyum iyonları sunmak için kullanılır. Kalsiyum çözüm ucu dışarı akışını membran yenileme ve MTPs nesil için önde gelen Şef membran yüzeyinde lokalize kalsiyum iyon degrade oluşturur. MTPs kalsiyum İyon kaynağı uzak odaklı ve Şef içinde büyür. Bu MTP oluşumu doğrudan floresans mikroskobu aracılığıyla izlenebilir ve bir dijital kamera ile kaydedildi. Şekil 3 membran remodeling üretmek için kullanılan deneysel kurulumu gösterir. Bu iletişim kuralı (Şekil 2E ve Şekil 4) MTPs oluşumu toplu güç koşullarda gerçekleştirilen kalsiyum iyon pozlama deneyler için zıt bir sonuç gösterir. Toplu koşullarda GUVs rüptürü ve form için cam yüzey25uymaları gözlenen membran yamalar.

Daha Şef-MLV kompleksleri yanı sıra kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için yordam oluşumu ile ilgili ayrıntılar, bu makalesinde açıklanmıştır. İletişim kuralları büyük ölçüde kalsiyum iyon mikroenjeksiyon üzerinde duruldu; Ancak, bu yaklaşım yerel veya maruz kalma diğer iyonlar proteinler nedeniyle membran yanıt eğitim kullanmak için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, veziküller bileşimi membran yenileme sürecinde lipid bileşeni rolleri yalıtmak için ayarlanabilir. Sunulan Protokolü Şef-MLV kompleksleri üretmek için herhangi bir gelişmiş donanım gerektirmez ve tekrarlanabilirlik yüksek derecesi ile karakterizedir.

Protokol

1. küçük Lipid veziküller hazırlanması

  1. Lipidler SPE/DOPS/ATTO488-DOPE kloroform içinde bir çözüm 79/20/1.The kloroform lipidler konsantrasyonu 1 mg/mL ve son kitle 0.6 mg (genellikle daha az 1 mg) son oranı karıştırma bir kitle ile hazırlayın. Kullanım alt cam şişe (yuvarlak alt cam tüpler, 10 x 75 mm) yuvarlak lipid çözüm önceden temizlik adım olmadan hazırlarken tek kullanımlık.
    1. Doldurun ve kullanımdan önce en az 5 kez kloroform ile cam şırınga (25 µL) durulayın. Doldurun ve cam şırınga en az 5 kez durulama için 3-4 mL kloroform yeterlidir.
      Dikkat: Ne zaman kloroform, işleme cam şırınga kullanın ve uygun eldiven giyerken duman mahallede tüm yordamları gerçekleştirmek ve koruyucu gözlük her zaman. Herhangi bir plastik şişeler, şırınga veya pipetler kloroform işlerken kullanmayın.
  2. Ortam ışığı içeriği korumak ve 3 h için bir döner buharlaştırıcı-7 kPa vakum 80 devirde ulaşan basınç ile kloroform kaldırmak için solvent buharlaşır için metal folyo ile lipid karışımı içeren cam şişe kaydır. Bir kuru lipid film cam şişe dibinde buharlaşma (Şekil 2A) sonra oluşur.
    Not: birkaç kez ölçeklendirmesinin ve lipidler daha büyük miktarda tam kloroform kaldırılmasını sağlamak için daha uzun döner buharlaşma zaman gerektirebilir.
  3. Fosfat 600 µL serum fizyolojik (PBS) arabellek çözüm (pH 7.8, seyreltme olmadan) kurutulmuş lipit filmin üstüne arabelleğe yavaş yavaş ekleyin. Arabellek ek, yavaşça gliserol Şef-MLV oluşumu (gliserol 1 wt % son bir konsantrasyon ulaşmak) adımları36sırasında tam dehidratasyon örnek korumak için 6 µL ekleyin. Parafilm ve kapak metal folyo ile ortam ışığı korumak için kullandığı cam şişe kapatın. Gecede 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
    Not: PBS arabellek çözüm Trizma tabanının 0.151 g, K3PO41.592 g, KH2PO41.021 g, MgSO4 ·7H2O 0,062 g ve EDTA 0.0465 g 250 mL saf su içinde oluşur. Çözüm 4 ° C'de depolayın ve oda sıcaklığında önce kullanım için sıcak. 10 mM HEPES tampon eşdeğer miktarda PBS çözüm yerine kullanılabilir. HEPES tampon çözüm 1 M HEPES hisse senedi çözüm arıtılmış su ile sulandrarak hazırlanır.
  4. Ertesi gün, bir ultrasonication Banyosu oda sıcaklığında kullanarak 1dk için solüsyon içeren cam şişe solüsyon içeren temizleyicide. Parafilm kaldırın ve küçük lipid veziküller görsel olarak tek tip bir çözüm oluşturulur kadar pipet (Şekil 2B). Aliquot 30 µL elde edilen küçük lipid vezikül çözüm bireysel 0.5 mL Plastik tüpler içine. Bu hisse senedi aliquots en fazla 6 ay için-18 ° C'de tutun.
    Not: küçük lipid vezikül çözüm yoksa görsel olarak üniforma, girdap 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için çözüm.

2. Şef-MLV konut projeleri hazırlanması

  1. Oda sıcaklığında bir aliquot küçük lipid veziküller donmuş süspansiyon içeren bir plastik tüp çözülme. Burgaç 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için tüp.
  2. Yer 5 µL küçük lipid vezikül süspansiyon bir cam kapak küçük oluşturmak için Not (24 x 60 mm) yüzeyinin damlacık yuvarlak. Cam kapak kayma olmadan herhangi bir ön temizleme adımları kullanın.
  3. Cam kapak notu bir vakum desiccator yer (< 100 kPa vakum) 20 dk için.
  4. Kurutulmuş lipit filmin 4 dakika oda sıcaklığında saklamak, sonra yavaş yavaş 10 mM HEPES tampon rehidrasyon için kuru lipid film üstüne 50 µL pipet. Şef-MLV kompleksleri (Şekil 2C) önceden oluşturmak için 5 dakika bekleyin.
  5. Bir cam kapak notu mikroskop sahnede merkezi sonra 300 µL üzerine HEPES tampon pipet ve damlacık amacı (3B rakam) yukarıda ortasına konumlandırın.
  6. Önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV çözüm 50 µL HEPES çözüm (300 µL) aktarın. 25 dk seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sıkıca cam kapak notu (2D rakam) yüzeye bağlı kalmak izin istiyorum.
    Not: Bazen, cam kapak fişinde Şef-MLV kompleksleri oluşturmaz ve lipid yamalar veya sadece MLVs gözlenir. Bu yanlışlıkla örneği adımları sırasında küçük vezikül süspansiyon 2.4 veya 2.6 veya çok sayıda donma-çözülme çevrimleri sallayarak tarafından açıklanabilir. 2.1-2,6 olan adımları yineleyin veya taze hazırlanmış lipid hisse senedi çözüm (adım 1.1) Şef-MLV kompleksler elde etmek için kullanın.

3. micropipette hazırlanması ve mikroenjeksiyon

  1. Micropipette sahibine eklenirken kırık micropipette önlemek için bir mum alevi içine yavaşça kılcal yerleştirerek borosilikat cam kılcal kenarları yuvarlak biter.
  2. Program seti kullanarak bir otomatik lazer çektirme kullanarak en az 3 cam kılcal çekin: ısı 400, FIL = = 4, Vel 50, Del = 225, Pul = =; Isı 400, FIL = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120 =. Program kümesi boş bırakılan Pul ilk değeri ile girilmesi gerekir. Borosilikat cam kılcal iç çapı (kimlik) kullanarak 1.00 mm ve dış çap (OD) 0,78 mm bir micropipette çapı yaklaşık 0.3 µm bir ipucu açılış ile sonuçlanır.
  3. Arka-dolgu ile 8 µL 5 mm CaCl2 çözüm HEPES tampon (10 mM) bir microloader kullanarak her micropipette. 0,2-0,5 kullanarak CaCl2 çözüm filtre µm şırınga filtre kullanımı pipet ucu tıkanmasını önlemek için önce.
    Not: CaCl2 tamamen adımları 2,4-2,6 için de kullanılır HEPES tampon çözelti içinde çözünmüş olun.
  4. Bir micropipette sahibi bir micromanipulator bağlayın. Micropipette micropipette yuvasına sıkıca bağlayın. Enjeksiyon pompası ve kapiller tutucu kaynağı tüp kullanarak bağlayın.
  5. Enjeksiyon pompası başlatın. Enjeksiyon pompası 20 hPa (enjeksiyon basıncı) için ayarları ve bir 5 inç tazminat basınç otomatik modunu ayarlayın. Micropipette mikroenjeksiyon için hazır olması ne kadar enjeksiyon pompası duraklatın.
  6. Mikroskop aydınlık alan moda ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) yapılandırın. 63 X veya 100 X Yüksek NA (1.3) amaçları en iyi membran kenar çözünürlük elde etmek için kullanın.
  7. Kaba micromanipulator micropipette Şef-MLV kompleksleri içeren damlacık yukarıda konumlandırmak için kullanın. Yukarıda amaç micropipette ucu bulun.
  8. Mikroskop Şef-MLV kompleks orta noktasını odaklanmak ve yaklaşık 50 µm Şef yukarıda tekrar odaklayın. Yavaşça micropipette odak haline getirmek için micromanipulator kaba modunu kullanın.
  9. Micromanipulator iyi moduna geçirin. Yavaş yavaş micropipette ucunu aşağı çevirmek ve ucu odak tutmak ise şef yüzeye yönlendirmesi. Micropipette ipucu yaklaşık 20 µm Şef yüzeyinden getirin. Micropipette ucu cam kapak notu ( Şekil 5Börnekte) ile yanlışlıkla temas nedeniyle kırık değilse, hemen gereksiz kalsiyum iyon yayın örnek toplu çözüm içine önlemek için değiştirin.

4. oluşumu ve kalsiyum İyon kaynağı kullanarak MTPs çeviri

  1. Mikroskop floresans moduna ayarlayın. Ayarla dichroics 488 heyecanlandırmak için nm ve 505-550 nm, emisyon tespit.
  2. Enjeksiyon pompası üzerinde geçiş ve kalsiyum iyon enjeksiyon başlar. Micromanipulator iyi modunu kullanacak ve yavaş yavaş micropipette ucu Şef e yaklaşım. Micropipette ipucu MTPs formu (Şekil 4) izin vermek için micropipette CaCl2 çözümden enjekte ederken 3 µm membran yüzey uzaklıkta yerleştirin.
  3. MTPs Şef yüzeyi boyunca çevirmek için yavaş yavaş hareket pipet ucu (0,1-0,3 hızı µm/s) Şef yüzey iyi micromanipulator (Şekil 6) kullanarak. Yaklaşık olarak aynı uzaklıkta (3 µm) Şef yüzey ve belgili tanımlık micropipette uç arasında kalsiyum iyon enjeksiyon devam ederken korumak.
    Not: micropipette İpucu (yukarıda 0.7 µm/s) yüksek çeviri oranlarda MTPs BT'nin micropipette de geçirmeyecektir. Bunun yerine, dağılım ve kısaltmak, yeni MTPs micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulacak iken.
  4. Mikroenjeksiyon durdurmak için enjeksiyon pompa kapatmak ve Şef yüzey uzak micropipette hareket.

Sonuçlar

Bu çalışmada, Şef-MLV kompleksleri ve onlar kalsiyum iyon degradeler etkisi hücre zarı dynamics aydınlatmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Şef-MLV kompleksleri yüzey bağlı bir iyon degrade mikroenjeksiyon ile kurulurken bir sabit Cep Boy taklit için izin vermek bu deneyler için gereklidir. Şef membran lokalize kalsiyum konsantrasyonu kalsiyum İyon kaynağı uzak yönetmen MTPs oluşumu ile yanıt verir. Ayrıca, MTPs Şef temassız bir şekilde micropipette ucunu membran yüzey etrafında hareket ettirerek tercüme edilebilir.

Şef-MLV hazırlık yordamı şematik gösterimi Şekil 2' de gösterilmiştir. Her ne kadar sunulan protokolünde, Şef-MLV kompleksleri zaten adımı sırasında 2.4 (Şekil 2C) önceden oluşmuş, vezikül çözüm başka bir 300 µL damlacık arabelleği (adım 2.6 Protokolü'nün) için aktarma seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sağlar yeterince uygun cam alt katman. Bu şekilde, embriyolardan ve mikroenjeksiyon için uygun bir kompleks kurulur (Şekil 2B). Zaman zaman, GUVs MTP oluşum Şekil 4Agörüldüğü gibi etkilemez bir veya daha fazla sıkışmışlık lipid veziküller içerir. Bu GUVs MTPs üretmek; Ancak, sıkışmışlık veziküller büyükse görüntüleme engel. Hazır GUVs çoğunluğu (% 75 kadar) yarımküresel görünür ve MLVs için Şekil 1A' gösterildiği gibi eklenir. Bu veziküller bu protokol ana odak ve mikroenjeksiyon işlemi için uygun. Kalan GUVs yaklaşık % 25 dalgalı görünür (Şekil 1B), daha düşük bir membran gerginlik rejim gösterge olduğu. Bu dalgalı veziküller Ayrıca borulu çıkıntılar oluşumu için izin; Ancak, onlar farklı kinetik ve bu iletişim kuralı25kapsamý dýþýndadýr kurulan MTPs farklı bir morfoloji sergi. Hazırlanan veziküller tipik çapı 2-40 µm GUVs için ve MLVs için 2-15 µm arasında değişir. En iyi şef veya daha büyük boyut için kalsiyum iyonları maruz 5 mikron.

Mikropipetler singe hücreli sorgulama şemaları de olduğu gibi sentetik GUVs manipülasyon için birkaç yıl37,38gerektiren prosedürler içinde kullanılmaktadır. Bu uygulamaların çoğu micropipette ve yüzey hücreleri veya veziküller ile arasında doğrudan fiziksel temas söz konusu. Yama-klemp tekniği veya membran bağları nanotüp veziküllü ağlar23,28,39bina yanı sıra Şef zar çekerek örnekler. Son zamanlarda, Mikropipetler iyonları ve moleküllerin türdeş olmayan hücre microenvironments24,25birleştirmeye GUVs etrafında lokalize degradeler oluşturmak için de kullanılmıştır. Sunulan protokolünde düzgün işleyen micropipette (Şekil 5A) içinde bulunan çözüm serbest bırakarak Şef yüzeyinde kalsiyum iyon degrade oluşturmak için çok önemli bir faktördür. Uygun micropipette Şef yüzeyde konumlandırma ve lipid membran ile temas kaçınarak başarılı mikroenjeksiyon için gereklidir. Micropipette ipucu MTPs yakınındaki hücre zarı kalsiyum varyasyonları taklit ederken oluşturmak için en iyi bir mesafe Şef yüzeyden yaklaşık 3 µm olarak düzenlenmektedir. Micropipette ucunu kazara kırık (Şekil 5B) ise, yerine gereklidir. Hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu için karşılık gelen 2 ve 5 mM25, MTP oluşum için sağlar, micropipette içinde daha önce test edilmiş konsantrasyon aralığı CaCl2 arasındadır. Düşük CaCl2 konsantrasyonlarda, yani, 1 mM, hiçbir MTPs gözlenir.

MTPs oluşumu üzerine kalsiyum mikroenjeksiyon MTPs pozlama (Şekil 4B) sitesinde büyüdüğünde küçük membran invaginations oluşumu ile başlar. MTPs kalsiyum iyonları maruz Şef membran kalır sürece büyümeye devam ediyor. Dalgalanma ve kalsiyum İyon kaynağı uzak (Şekil 4 c, takıma giren film 1) gelin. Ne zaman kalsiyum İyon kaynağı edildin, MTPs dağılım MTPs kalır veya yok sonuçlandırmak üzere Şef yüzey üzerinde.

MTPs oluşumu doğrudan ilişkili olduğu Şef membran maruz dış broşür için bağlama ve spontan eğriliği (m), uyarının harekete geçirilmesine karşılık lokalize kalsiyum iyon açıklanabilir kendiliğinden oluşumu gerilim σ = 2κm2 (κ ise bükme sertlik) membran bükme ve şekillendirme içe MTPs ikna etmek. Önceki raporlar membran deformasyon yoğunlaşma tarafından açıklanmış ve/veya negatif spontan eğriliği40ile sonuçlanan bağlama kalsiyum iyonlarının membran için üzerine olumsuz ücret lipidler, kümeleme olabilir göstermiştir. Alternatif olarak, Ca2 + olumsuz ücret bilayer yüzeyine güçlü bağlama maruz lipid bilayer broşür yüzey şarj yoğunluğu etkisiz hale getirir. Bu ücret yoğunluk farkı sıfır olmayan spontan eğrilik, membran25eğmek için yeterli kaynaklanan bilayer genelinde yol açar.

MTPs gözlenen oluşumu lipid membranlar kalsiyum iyonları için hassasiyet gösterir ve membran yapılar üreten bir roman temassız yaklaşım sunuyor. Kaynağını elucidating bu membran tubulation, membran şekil çeşitli hücre fonksiyonları ve hücre yeniden şekillendirme sırasında geçiş dinamiklerini anlamak için önemli olabilir ve lipid organizasyon içinde hücre içine anlayışlar kazanmak için yardımcı olabilir membranlar.

Gözlenen MTPs kalsiyum iyon pozlama geçiren membran sitede her zaman oluşturulur. Böylece, micropipette ucunu konumunu seçerek, bu çıkıntı büyüme için Şef yüzey alanını tanımlamak mümkündür. Micropipette yavaş yavaş ise ileri (0,1-0,3 µm/s) membran ayırma mesafeden koruyarak Şef yüzeyi taşındı MTPs micropipette ile tandem çevrilir. Şekil 6 ve karşılık gelen ek Movie 2 Şef yüzeyi çevresine MTPs böyle geçiş göstermektedir. Bu işlem sürekli kalsiyum iyon enjeksiyon25üzerine yeni MTPs oluşumu tarafından eşlik etmesi muhtemeldir. (Yukarıdaki 0.7 µm/s) yüksek çeviri fiyatlara MTPs micropipette ipucu takip etmek mümkün değildir. Bunun yerine, yeni çıkıntılar micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulur.

Gözlenen temassız kalsiyum iyon güdümlü çevrilmesi MTPs etrafında daha fazla sürüş anlayışımız hücrelere membran yapılar dinamikleri arkasında zorlar Şef yüzey olabilir. Ayrıca, bu yaklaşım malzeme taşıma yumuşak madde sistemlerinde kimyasal degradeler kullanarak kontrol etmek için bir roman temassız modu sunuyor.

figure-results-1
Resim 1 : Bir cam kapak kayma yüzeyi üzerinde immobilize Şef-MLV kompleksleri görüntülerini temsilcisi Floresan Mikroskobu. (A). örnek olarak küresel bir şef. Şef MLV için bağlı bir yarımküre şeklinde görünür. (B). örnek olarak dalgalı bir şef. Siyah okları membran deforme alanları belirtir. Görüntü gelişmiş ve fluorescently etiketli Şef membranlar görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2 : Şef-MLV hazırlık ve mikroenjeksiyon düzenleri şematik çizimler. (A). Kuru lipit katmanı kloroform lipid çözümden döner buharlaşma sonucu cam şişe dibinde oluşturulur. (B). rehydrated lipit katmanı sonicated ve küçük lipid veziküller kurdu. (C). vezikül çözüm (5 µL) küçük bir damlacık bir cam kapak kayma yüzeyine yerleştirilen ve lipid çözüm kurutmak ve (Bu adım gösterilmez) bir kuru lipid film oluşturmak için bir desiccator 20 dk için transfer. Tampon çözeltinin 50 µL kuru lipid filmle nemlendirilmesi önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV kompleksler oluşturur. (D). önceden biçimlendirilmiş kompleksleri aktarım arabellek sonuçları seyrek ayrılmış Şef-MLVs oluşumunda daha büyük bir hacim için cam kapak kayma yüzeyine bağlı. (E). micropipette Şef yüzeye yakın konumlandırma ve kalsiyum iyonları serbest MTPs oluşumunu tetikler. Resimler çizilmez ölçek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 : Kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon için deneysel Kur. (A). deneysel kurulumunun MTPs GUVs içinde oluşturmak için gereken bileşenleri. (B). mikroenjeksiyon kurulum ayrıntılarını. Cam coverslip Şef-MLV kompleksleri çözüm ile mikroskop sahne alanı'nda yerleştirilir. 30 ° (beyaz işaretli) micropipette ve cam kapak kayma yüzeyi arasındaki açıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4 : MTPs üzerine mikroenjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının oluşumu. (A). Şef-MLV karmaşık bir kalsiyum iyon degrade maruz önce. Şef entrapped lipid vezikül ok gösterir ve hangi gözlem MTPs. (B) engel değil. Küçük MTPs mikroenjeksiyon kalsiyum iyonlarının (CaCl2 micropipette 5 mM konsantrasyonu) üzerine oluşur. (C). kalsiyum iyonları için sürekli maruz üzerine MTPs büyüme. Floresan görüntü gelişmiş ve görselleştirme amaçlar için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5 : Cam kalsiyum iyon mikroenjeksiyon için kullanılan Mikropipetler. (A). düzgün işleyen bir micropipette örneği. (B). ucu kırık (hasarlı bölgeyi siyah bir ok ile gösterilen) sahip bir micropipette örneği. Her iki görüntü gelişmiş ve daha iyi görselleştirme için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6 : Kalsiyum iyon güdümlü tercümesi Şef yüzeyi çevresine MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette ipucu tercümesi (0,2-0,3 mikron/s) membran yüzey MTPs kalsiyum İyon kaynağı yönünde hareket tetikler. Siyah okları micropipette hareket yönü vurgulamak. Görüntü gelişmiş ve membran görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-7
Şekil 7 : Yüksek çeviri hızında micropipette ipucu MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm (beyaz çizgi) üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette Şef yüzeyi (1 mikron/s) çevresine yüksek çeviri oranında daha önce kurulan MTPs (beyaz çizgi) saçılma yanı sıra micropipette uç (kırmızı çizgi), yeni konumda yeni MTPs oluşumu sonuçlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-8
Takıma giren film 1: MTPs oluşumu içinde Şef Ca için yerelleştirilmiş maruz üzerine 2 + gradyan. Bu film indirmek için buraya tıklayınız. 

figure-results-9
Takıma giren film 2: Kalsiyum iyon güdümlü MTP geçiş Şef yüzeyi çevresine.   Bu film indirmek için buraya tıklayınız. 

Tartışma

BioMimetic hücre sistemleri membran davranış iyonları, proteinler veya nano tanecikleri gibi dış uyaranlara karşı maruz üzerine bir çalışma için izin verir. Böyle bir model olmak gUVs, kimyasal ortamda değişiklikler sık sık tübüler yapılar ve invaginations24,41,42,43 oluşumu içerir onların şekli ayarlayarak yanıt verebilir .

Bu makale, MTPs Şef yüzey üzerine yerelleştirilmiş enjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının remodeling ile temassız bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunar. Protokol ne kadar kalsiyum oluşturmak için bir mikroenjeksiyon tekniği kullanırım için iyon degradeler Şef e yakın forma MTPs yüzey de bir hücre plazma zarı taklit eden Şef-MLV kompleks hazırlanması açıklar. Kalsiyum iyon-membran etkileşimleri ele önceki deneysel çalışmalarda çoğunluğu kalsiyum iyon konsantrasyonu14,17toplu olarak lipid veziküller maruz. Deneysel koşullarına bağlı olarak, bu tür toplu poz yok borulu çıkıntılar oluşan25farklı membran yanıtta neden olabilir.

Şef-MLV kompleksleri oluşumu oldukça basittir ve sadece standart Laboratuar donanımları, rotary evaporatör, ultrasonik banyo ve vakum desiccator gibi gerektirir. Yine de, vezikül hazırlık sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli kritik adımlar vardır. (Veziküller susuzluktan adım iletişim kuralı sırasında 2.3) tamamlandıktan ve az miktarda tuz kristallerinin içeren bir Kuru dairesel lipid film cam kapak kayma yüzeyi üzerinde oluşturulur emin olmak önemlidir. Deneme sırasında dikkatli vezikül çözümü, işleme kloroform yanı sıra taze HEPES tampon, taze lipid hisse senedi çözüm kullanmaktır Şef-MLV kompleksleri başarılı hazırlanması için gerekli. Ayrıca, güvenli bağlanma cam kapak kayma yüzeyi Şef-MLV kompleks embriyolardan ve mikroenjeksiyon için çok önemlidir. Şef MLV yeterli yapışma onaylamak için karmaşık, micropipette (enjeksiyon akışı) olmadan yavaşça Şef yüzeyine karşı itmek için kullanılabilir. Sıkıca yapıştırılan bir vezikül üzerine doğrudan fiziksel temas yüzeyi boyunca kaydırın değil. Çünkü deneyler için birkaç saat sorguya, bir açık arabellek damlacık içinde gerçekleştirilir buharlaşma dikkate alınması gerekir. Buharlaşma arabellek damlacık gelen etkiler ve veziküller istikrarsızlaştırmak ozmotik koşullar değişecek. Ozmotik koşullar geri yüklemek için sistem periyodik özgün birimi geri yüklemek için örnek için saf su ilavesi homeostazı için döndürür.

Lipid membran kompozisyon değiştirirken MLV membran yeniden şekillendirme sırasında Şef'e lipid malzeme aktarmak için izin verdiğinden veziküller Şef-MLV kompleksi şeklinde üretilen önemlidir. Önceki çalışmalar ile saf lipidler SPE karışımı bileşenleri değiştirme veya kolesterol, % 5-30'u eklemek de Şef-MLV karmaşık oluşumu28,44için sağlar göstermiştir. Hazırlanan GUVs unilamellar45çoğu.

Ayrıca, magnezyum iyonları gibi diğer divalent katyonlar sınarken MTPs oluşumu ağır lipid karışımı olumsuz ücret DOPS varlığını bağlıdır. DOPS, bu protokol için açıklanan veziküller içinde MTPs oluşturmaz. Ayrıca, potasyum ve sodyum, gibi monovalent katyon oluşumunda MTPs, hatta veziküller25DOPS içeren, neden değil.

Hazırlık ve GUVs manipülasyon ile ilgili kritik adımlarına ek olarak, mikroenjeksiyon işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli faktörler önemli. Kalsiyum iyonlarının başarılı mikroenjeksiyon ağır düzgün çalışıp dayanmaktadır cam deneme günü hazır mısın Mikropipetler. Çeşitli faktörler micropipette çalışmasına neden olabilir. Ortak bir akıl tıkanmış ipucu açıyor. Yan vezikül hazırlanması, çözüm içinde dağınık ve böylece bir tıkanma üreten micropipette ucuna kadar uygun eğilimi küçük lipid parçacıkları. Pipet Ucu temizleme en iyi vezikül eriyik--dan yukarı kaldırarak ve Şef yüzeye yakın yerleştirerek yapılır. Çünkü toplu çözüm içine kalsiyum iyonlarının büyük enjeksiyon içinde sonuçlar mikroenjeksiyon pompa blow-out işlevinin kullanımını kaçınılmalıdır. Ayrıca, küçük hava kabarcıkları micropipette içinde entrapped uygun mikroenjeksiyon, dava micropipette yenisi ile değiştirilmelidir önlemek. İpucu kırılması önemli ölçüde deneysel Kur ipucu salınımlarını en aza indirmek için bir titreşim nemlendirme masaya yerleştirerek en aza indirilebilir.

Ayrıca, bakım photobleaching zaman karar vermek en iyi görüntüleri elde ederken en aza indirmek için bir gözlem düzeni seçerken alınması gerekiyor. Çünkü bir objektif sınırlı sonda derinlikte bir nispeten yüksek görüntü edinme oranı sağlar geniş alanlı lazer kaynaklı floresans mikroskobu bu protokol için kullanılmıştır. Ayrıca, ters mikroskobu kullanımını eşzamanlı mikroenjeksiyon ve lipid veziküller ve MTPs gözlem olanağı sağlar.

Bir sunulan yönteminin ana sınırlamaları kapsamlı el ile çalışmaları ve yeterli embriyolardan becerileri gereksinimdir. Kompleksleri bir spontan şişme sürecinde oluşur çünkü, GUVs ve MLVs boyutunu kontrol edilemez. Ayrıca, bu iletişim kuralını membran yenileme ile ilgili ek ayrıntıları toplamak gerekli olabilir hazır şef-MLV kompleksleri membran gerginlik kontrolü için izin vermez. GUVs MLVs sadece GUVs kullanılabilir membran kullanarak elde etmek imkansız bir ölçüde MTPs önemli büyüme için ikinci sağlama lipid malzeme ile bağlanır. MLVs de hangi vezikül gerilimi micropipette aspirasyon kullanarak denetlemek için girişimleri karmaşık Şef-MLV karmaşık44içinde herhangi bir yan yüzey gerilimi varyasyonları düşürülmesi için katkıda bulunur. Bu Şef-MLV tabanlı model daha iyi membran kıvrımlar ve invaginations46gibi membran su depoları bağlı hücresel membran yapılar bulunan gerginlik rejimler taklit eden bir alt gerginlik sağlar. Aynı zamanda, micropipette Aspirasyon tekniği başarıyla tek GUVs membran gerginlik denetlemek için uygulanabilir. Örneğin, Graber vd. eseri ayrıntıları membran borulu invaginations bağlama üzerine tek GUVs içinde kalsiyum iyonlarının oluşumu için toplu koşulları, membran çeşitli gerilim rejimler40sağlanan. Son olarak, hem yerel hem de toplu pozda kalsiyum için membran davranışının karşılaştırma bu protokolü kapsamý dýþýndadýr yüzeye membran yapıştırılması Gelişmiş denetimi gerektirir.

Özetlemek gerekirse, temassız membran yenileme ve kalsiyum iyonları ile yerelleştirilmiş stimülasyon üzerine MTPs oluşumu için önerilen tekniği sağlar. Sentetik vezikül sistemlerden çeviri için hücre blebs gibi yerel biyolojik membranlar üzerinde bu yöntemi merkezinin gelecekteki uygulamalar. Önerilen yöntem Birleşmiş amperometry, yama-kelepçe veya elektrot gibi diğer tek hücreli sorgulama düzenleri ile veya ile birlikte lokalize stratejileri31,47,48Isıtma. Diğer iyonlar veya moleküller etkisini test basittir ve sadece faiz molekülleri ile kalsiyum iyonları yerine içerir. Ayrıca, karmaşık sentetik lipid veziküller ile yerel algılama ile ilişkili hücre yeniden şekillendirilmesi ve hücre zarının dinamiği Biyofizik anlayışımızı genişleyebilir transmembran proteinler membran functionalization yoluyla üretilen kimyasal degradeler. Son olarak, lipid membran temassız uyarılması da polimer yumuşak madde sistemleri, bir roman temassız manipülasyon platform için bir temel sunan için tercüme edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Soya fasulyesi polar lipid özütüAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, ABD)		541602C100 mg
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu) DOPSAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, ABD)		840035C1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE)ATTO-TEC (Almanya)AD 488-311 mg
Hamilton  şırınga, 700 serisi, sabit iğne, 702N, hacim 25  μ L, iğne boyutu 22s ga (konik uç), iğne L 51  mm (2  içinde.)Sigma Aldrich (Missouri, ABD)20735  SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tüp, kültür, tek kullanımlık, çerçevesiz, 10x75 mm, Borosilikat cam 250/paketCorning Incorporated (Corning, NY 14831)99445-10
Kloroform  CHROMASOLV  Ayrıca, HPLC için, ≥ % 99.9, stabilizatör olarak amilen içerirSigma Aldrich (Missouri, ABD)650498-1L-D
Döner evaporatörBü chi Rotavapor R-144 İsviçre
Kalciumklorid purum torkad minimum %95 medelkornig 5-10 mmKEBO lab (İsveç)MA00360500
Magnezyum klorür hekzahidrat reaktif sınıfı ACS, ISOSharlau Chemie SA (İspanya)P9333-500G
Potasyum klorür, SigmaUltra, minimum% 99.0Sigma Aldrich (Missouri, ABD)S7653-1KG
Sodyum klorür, SigmaUltra, minimum %99,5SigmaAldrich (Missouri, ABD)G5516-1L
Gliserol, moleküler biyoloji için, minimum %99Sigma Aldrich (Missouri, ABD)T-1503 2050 g
Trizma tabanıSigma Aldrich (Missouri, ABD)P5629-500G
Potasyum fosfat tribazik (K3PO4)Sigma Aldrich (Missouri, ABD)P5655
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)Sigma Aldrich (Missouri, ABD)5886
MgSO4Merck (ABD)34549-100 g
EDTASigma Aldrich (Missouri, ABD)H0887 Sigma 
HEPES çözeltisi 1  M, pH 7.0-7.6, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygunSigma Aldrich (Missouri, ABD)Z260282-1PAK24x60 mm
Acrodisc  şırınga filtreleri,  PVDF membran, çap 13  mm, gözenek boyutu 0.2  μ mSigma Aldrich (Missouri, ABD)631-1339 
Menzel Glä ZER # 1, cam kapak kaymaVWR (ABD)
Kurutucu için diyaframlı vakum pompasıVacuubrand (Almanya)
Ultrasonicate banyosuBandelin Sonolex (Almanya)
VX-100 Lab vortekser vorteks karıştırıcıLabnet International (ABD)
488 nm lazer çizgisi Cobolt MLD-488 nm (Solna, İsveç)
Leica Microsystems  mikroskoplar için daldırma yağıLeica (Almanya)12847995 
Ters floresan mikroskopi sistemi Leica DM IRB (Wetzlar, Almanya)
Kamera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)Technologies GmbH (Thüringen, Almanya)300038
PatchStar MicromanipulatorScientifica (Uckfield, İngiltere)612-7933
Borosilikat cam kılcal damarlar, GC100TF-10,   1.00mm OD X 0.78mm İç Çap Harvard Apparatus U.K
Eppendorf mikro yükleyici (pipet uçları)VWR (ABD)
P-2000 CO2 lazer çektirme Sutter Instruments (Novato, ABD)
Femtolitre otomatik enjeksiyon pompası, Eppendorf FemtojetEppendorf (Almanya)

Kaynaklar

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum? Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035(2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281(2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150(2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086(2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256(2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dev Unilameler Vezik lMultilameler Vezik lKalsiyum yon GradyanFloresan MikroskopisiMikroenjeksiyon SistemiMembran T b ler Protr zyonuLipid Vezik l Olu umuTemass z Stim lasyonDiferansiyel nterferans Kontrast

İlgili makaleler