Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

7.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 Ağustos 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.

Özet

Çok sayıda omurgalı tür, ama çok az teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Bunlar arasında açık çoğunluk Disosiye primer hücre gerçekleştirdiniz. Daha biyolojik ilgili bir ortamda davranır, nasıl teleost hipofiz hücreleri anlayışımızı geliştirmek için bu protokol küçük tatlı su balığı medaka (Oryzias latipes) kullanarak kalıcı beyin hipofiz dilimleri hazırlamak gösterilmiştir. Beyin hipofiz dilimleri yapma, pH ve tüm çözümleri osmolalite vücut sıvıları 25-28 ° C'de yaşayan tatlı su balık içinde bulunan değerleri için ayarlandı Dilim hazırlık protokol elektrofizyolojik kayıtlar delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği kullanarak yapmak gösterilmiştir. Yama-klemp tekniği benzeri görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet, soruşturma tek iyon kanalları aşağı olduğu gibi tüm hücrelerden elektriksel özellikleri sağlayan güçlü bir araçtır. Delikli yama yama pipet elektrot çözüm tarafından seyreltilmiş sitozol düzenleyici elemanlarının bozulmadan önleme hücre içi çevre tutar benzersizdir. Buna ek olarak, geleneksel bütün hücreli kayıtları yapılırken, bu medaka hipofiz hücreleri hızlı bir şekilde Aksiyon potansiyelleri ateş yeteneklerini kaybedecekler gözlendi. Çeşitli perforasyon teknikleri arasında bu iletişim kuralını perforasyon Amfoterisin B. mantar ilacı kullanma yamalı membran ulaşmak gösterilmiştir

Giriş

Hipofiz omurgalılarda hipotalamus aşağıda yer alan ve posterior optik hemisferlerine için anahtar bir endokrin organdır. Bu üretir ve altı ya da sekiz hormonlar belirli hücre türleri salgılar. Hipofiz hormonları beyin ve periferik organlarda arasında bir ara oluşturmaktadır ve temel fizyolojik süreçleri büyüme, üreme ve homeostasis düzenlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir sürücü. Nöronlar, hipofiz endokrin hücreleri benzeri elektrikle heyecanlı aksiyon potansiyelleri kendiliğinden ateş yeteneği ile 1. Bu aksiyon potansiyelleri hücre bağımlı roldür. Birkaç hücre tür memeli hipofiz, Aksiyon potansiyelleri intrasellüler Ca2 + hormon 2sürekli bir sürümü için yeteri kadar yükseltebilir. Buna ek olarak, hipofiz hücreleri 3,4,5,6membran potansiyelini etkileyen beyin uyarıcı ve inhibitör bilgilerini alır. Genellikle, uyarıcı giriş uyarılabilirlik artırır ve sık sık açıklaması, Ca2 + hücre içi mağaza içerir yanı sıra frekans 7ateş arttı. Nasıl hücre iyon kanal kompozisyon kullanır ve bu giriş sinyalleri beyinden adapte anlayış hormon sentezi ve serbest bırakmak için anahtardır.

Yama-klemp tekniği 1970'lerin sonunda Sakmann ve Neher 8,9,10 tarafından geliştirilen ve Hamill 11tarafından daha da geliştirilmiş ve ayrıntılı araştırmalar hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri sağlar tek iyon kanalları aşağı. Ayrıca, teknik akım ve gerilim eğitim için kullanılabilir. Bugün, yama sıkma elektrofizyolojik hücre özelliklerini ölçmek için altın standart 's. Dört büyük yapılandırmaları sıkı mühür yama-klemp tekniği, Gelişmiş 11gelmiş; hücre bağlı, Inside out, dış-out ve bütün hücreli yama. Üç ilk yapılandırmasından genellikle tek iyon kanal araştırmalar için kullanılır. Hücre bağlı yapılandırma aşağıdaki 4 Temmuz'da, hücre zarının delik alt atmosferik basınç kullanılarak yapılır. Bu yapılandırma aynı zamanda araştırmalar iyon kanal kompozisyon tüm cep telefonu 12sağlar. Ancak, bir bu teknik sitoplazmik molekülleri böylece okudu hücrelerinin elektrik ve fizyolojik tepkileri etkileyen yama pipet çözüm 13 tarafından (Şekil 1A), seyreltilmiş kısıtlamasıdır. Nitekim, bazı bu moleküller sinyal iletim veya farklı iyon kanalları düzenlenmesi önemli rol oynayabilir. Bunu önlemek için bir gözenek oluşturmayan bileşik yama pipet eklendiği Lindau ve Fernandez 14 bir yöntem geliştirdi. Hücre bağlı yapılandırma bileşik yama altında plazma zarı içine dahil ve yavaş yavaş elektriksel temas sitozol (Şekil 1B) ile oluşturma membran sorgulamaktı. Nistatin 15 ve Amfoterisin B 16gibi birkaç farklı antifungaller veya yüzey saponin beta-escin 17,18 gibi kullanılabilir. Bu bileşiklerin gözenekleri monovalent katyon ve Cl- difüzyon sitozol ve yama pipet arasında sitozolik düzeyini oluştururlar ve Ca2 + 15gibi daha büyük iyonları korunması sırasında izin vermek için yeterince büyük oluşturmak, 16.

Delikli yama kullanılarak meydan potansiyel yüksek serisi dirençtir. Seri direnç (Rs) ya da erişim direnç yama pipet yere göre kombine direniş bitti. Yama-kelepçe kayıtları sırasında Rs membran direnci ile paralel olacak (Rm). Rm ve Rs bir gerilim bölücü olarak paralel çalışma. İle yüksek Rs, gerilim hataları kayıtları veren Rs üzerine düşecek. Hata kaydedilen büyük akımları ile daha büyük olacak. Buna ek olarak, gerilim bölücü de böylece zamansal çözünürlük etkileyen bir alçak geçiren filtre oluşturma bağımlı sıklığıdır. (Bkz: ayrıntılı okumalar referans 19için) gerilim Na+ akımları geçişli gibi sonuç olarak, delikli yama her zaman daha büyük ve hızlı akıntılar kayıtları izin vermeyebilir. Ayrıca, Rs yama-kelepçe kayıtları, yeniden kaydedilen geçerli değişiklikleri önde gelen sırasında değişebilir. Bu nedenle, yanlış pozitif Rs ilaç uygulama sırasında değiştiği durumlarda oluşabilir.

Elektrofizyoloji dilimlenmiş doku üzerinde ilk beyin 20nöronlarda elektrofizyolojik özellikleri çalışmaya Andersen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Tekniği detaylı araştırmalar tek hücreleri hem de daha sağlam bir ortamda hücre-hücre iletişim ve hücre devreleri açtı. Hipofiz dilimleri yapmak için benzer bir teknik Guérineau ve ark. tarafından 1998 yılında tanıtıldı 21. ancak, değildi 2005'ten önce bu beyin hipofiz dilim hazırlık şekilde teleost 22çalışmalarda yama-kelepçe için kullanıldı. Bu çalışmada yazarlar da delikli yama-kelepçe kayıtları kullanımı bildirdi. Ancak, uzak, hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar çoğu memeliler ve diğer omurgalı teleost balık 1,2,22,23 de dahil olmak üzere, sadece bir avuç yapılmıştır . Teleosts içinde birincil Disosiye hücreleri 24,25,26,27,28,29tarihinde,30 neredeyse tüm çalışmaları yapıldı .

Bugünkü yazıda, sağlıklı beyin hipofiz dilimleri modeli balık medaka üzerinden hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol anahat. Yaklaşım birçok avantaj birincil Disosiye hücre kültürleri için karşılaştırıldığında temsil eder. İlk olarak, hücreleri ayrışmış olan hücre kültür koşulları ile karşılaştırıldığında göreceli olarak korunmuş bir ortamda kaydedilir. İkinci olarak, dilim hazırlıklar dolaylı yollar hücre-hücre iletişim 22tarafından hangi Disosiye hücre kültür koşullarda mümkün değildir aracılı çalışma izin. Ayrıca, biz nasıl yürütüleceği delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği Amfoterisin B ile gözenek oluşturan Aracısı olarak kullanarak elde edilen doku dilimleri üzerinde elektrofizyolojik kayıtları göstermek.

Medaka Asya, öncelikle Japonya'da bulunan yerel bir küçük tatlı su balığı var. Fizyoloji, Embriyoloji ve genetik medaka, 100'den fazla yıl 31için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve birçok laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan araştırma modeli. Bu kağıt için özellikle önem farklı morfolojik teleost balık hipotalamus-hipofiz kompleks organizasyondur: memeliler ve kuşlar hipotalamik nöronlar nöro-hipofiz bezi endokrin hücreleri düzenleyen hormonları yayın ise medyan Hazretleri, portal sisteme doğrudan sinir projeksiyon teleost balık 32hipofiz endokrin hücreleri üzerine hipotalamik nöronların vardır. Böylece, dikkatle yürütülen beyin hipofiz Dilimleme 's ile balık, iyi korunmuş bir beyin hipofiz ağ hipofiz hücreleri ve özellikle nasıl hipofiz hücreleri elektrofizyolojik özellikleri araştırmak bize izin verdiği önem onların uyarılabilirlik kontrol ve böylece Ca2 + homeostazı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan işleme göre bakım ve Norveççe Üniversitesi'nde araştırma hayvan refahı için öneriler yaşam bilimleri ve yetkili müfettişler gözetimi altında gerçekleştirildi.

1. hazırlanması aletleri ve çözümleri

Not: Tüm çözümler steril olmalıdır. Dikkat pH ve dikkatle okudu tür hücre dışı ortama adapte edilmelidir tüm çözümler osmolalite (osmol/kg su) verilmesi gerekir. pH ve osmolalite pH metre ve donma noktası osmometer gibi hassas elektronik ekipman ile anılan sıraya göre ayarlanmalıdır.

  1. 500 mL olmadan Ca2 + ekstra hücresel çözeltisi yapmak (Ca2 + EC ücretsiz): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. 4,38 gram NaCl, 186.37 mg KCl, MgCl2, 360.32 mg glikoz ve HEPES 1.19 g ultrasaf 450 ml 61.89 mg dağıtılması (0,055 uS / cm 25 ° c, 18,2 MOhm direnci) H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  2. Ekstra hücresel çözüm (EC) 500 mL olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  3. 500 mL %0,1 sığır serum albumin (EC BSA ile) ile ekstra hücresel çözeltisi olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize. 50 mg BSA ekleyin.
  4. İntraselüler çözeltinin (IC) 250 mL olun: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sükroz.
    1. 1,54 g KOH, KCl 327.75 mg, HEPES 595.75 mg ve ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml sukroz 1,712 g geçiyoruz.
    2. PH 7.2 asitle (N-morpholino) etan sulfonic (MES) için ayarlayın.
    3. Çözüm 250 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 250 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. Sükroz ile 280-290 mOsm (10 mOsm EC düşük) için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  5. Ca2 + ve BSA ücretsiz EC 100 mL % 2 düşük erime özel çözeltisi yapmak (düşük erime özel Ca2 + 100 ml 2 g ücretsiz EC). Bir mikrodalga kullanılarak dağıtılması ve erimiş özel bir su banyosu 40 ° C'de yerleştirin 40 ° C dokular üzerinde kullanmadan önce ulaşıncaya kadar aşağı soğumaya bırakın.
    Not: EC, ücretsiz EC 4 ° C'de birkaç hafta Eğer steril ve IC çözümleri-20 ° C'de için birkaç ay depolanabilir Ca2 + . Özel bir hafta 4 ° C'de depolanan ve 3-5 kez kısaca mikrodalga tarafından yeniden kullanılabilir. Aşırı yeniden buharlaşma ve değişiklik özel ve tuz konsantrasyonu ve kalite yol açacaktır.
  6. Agar köprü yapmak:
    1. 7.5 mm uzun borosilikat cam kılcal dış çap (OD) 2 mm ile ısı ve cam bend başlayıncaya kadar iç çapı (kimlik) 1.16 Bunsen burner bir odak kullanarak mm yaklaşık 1/3 bir ucundan üzerine gelin. Cam alev kaldırmak ve cam (Şekil 2A) yaklaşık 120 derecelik bir açı ile viraj izin.
    2. Normal EC %2 agar olmadan bir mikrodalga kullanarak glikoz ve özel sıvı dolgu cam ucuna birini sıvı içine koyarak ve birkaç dakika için bekleyen önceden yapılmış cam capillarity kullanarak kapiller kuvvetleri ise boğulmak. EC 4 ° C glikoz olmadan kullanımı kadar köprüleri depolamak.
  7. Borosilikat cam bir uygun pipet çektirmenin kullanarak filaman yama Pipetler ile hazırlayın. İstenen elektrot direnç elde etmek için pipet çektirme el kitabına başvurun.
    Not: Pipet ucu olabildiğince kısa olmalıdır. Kısa pipet konik 4-6 çekerek adımlar kullanılarak elde edilir. Elektrot direnç 2 ve 6 MΩ bağlı olarak hücre boyutu arasında olmalıdır.
  8. Yama-kelepçe deneyler sırasında doku hareketi önlemek için kayıt odası % 0,1 oranında polyethylenimine (PEI) Bor tampon ile yüzey kat.
    1. Bor arabelleği (25 mM) 500 mL hazırlayın:
      1. Na2B4O710 H2O 450 ml ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek 4.768 g geçiyoruz.
      2. PH HCl ile 8,4 için ayarlayın.
      3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O su vakum sistemi kullanarak solüsyonu 500 mL ve 0.2 µm filtre sterilize dolduramazsınız.
    2. % 1'stok çözüm PEI (1 mL % 50 PEI 49 mL 25 mM bor arabelleğine) ve % 0.1 PEI seyreltme sulandrarak 10 µL bor arabelleği 100 µL % 1'stok çözümün nihai kullanım için hazırlayın.
    3. Dilim tutucu camın üzerine 2 mL % 0,1 PEI eklemek ve 1 dakikadır kuluçkaya kaplama. O zaman kısaca ultrasaf H2O iki kez ile 5 mL bardak yıkama ve kullanım kadar kuru hava girsin.
  9. Amfoterisin B çözümleri hazırlayın.
    1. 60 mg/mL stok çözüm 3 mg 50 µL dimetil sülfoksit (DMSO), Amfoterisin B tozu çözülerek ışıktan korunan 1 mL tüp içinde olun. Girdap 30 için maksimum hızda s ve 15dk için homojenize solüsyon içeren temizleyicide. -20 ° C'de 3-5 tüpler içine aliquots kapaklarý takýlý günlük bir aliquot.
      Not: Amfoterisin B hisse senedi çözüm açık ve sarı yoksa renk ama sonra 15-20 dk sonication sütlü (hala sarı) yeni bir hisse senedi çözüm alın.
    2. IC çözüm Amfoterisin B ile IC tarafından pipetting 2 mL 10 mL kapasite fazlası ile temiz cam kabı içine olun. Amfoterisin B hisse senedi çözüm 8 µL pipet çözüm içine ve pipetting tarafından karıştırın. Alüminyum folyo ve yer ile kabı buz kadar kullanmak sarın ve her 3 h yenilemek.

2. diseksiyon ve Vibratome ile dilimleme

  1. Diseksiyon araçları dissekan önce bir güçlü forseps ve keskin bir makasla dahil olmak üzere hazırlayın. Etanol araçlarıyla (doku tutucu, fırça, forseps) temiz ve diseksiyon amaçlı ve asla sabit dokular ile temas halinde kullanıldıkları emin olun. Onları kirlenmesini önlemek için ayrı bir kutuda tutun.
  2. 1 dk. için soğuk buz suda balık ötenazi.
  3. Hızlı bir şekilde medaka beyin ve hipofiz keskin forseps (en fazla 3 dk kullanın) incelemek için sonraki adımları izleyin.
    1. Balık güçlü forseps ile şiddetli gözlerinin arkasında iki görme sinirini makasla tutarak iken veya forseps keskin.
    2. Dorsal Kafatası parçası arka ön tarafına güçlü forseps ile adım adım kafatası kemikleri kırarak açın.
    3. Bir tarafta kafatası akasındaki güçlü forseps ile.
    4. Şiddetli makas veya keskin forseps ile spinal kord.
    5. Yavaşça, spinal kord forseps ile kapmak için anterior posterior beyinden flip ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile bir çanak içine yerleştirin
  4. İle sıvı özel bir 1,5-2 cm3 metal kalıp doldurmak ve buz üzerinde yerleştirin.
  5. Sadece özel (yaklaşık 25-30 ° C'de) katılaşır önce hafifçe beyin omurilik tarafından forseps ile kapmak, forseps iyi kağıt ile Kuru ve doku özel koymak. Hızlı bir şekilde sol doku EC izleri sulandırmak ve doku yönlendirmek ve kalıp buz üzerinde özel sertleşir kadar birkaç saniye için izin için özel karışımı.
    Not: Hızlı olmak için bu adım gereklidir. Metal kalıp buz tarafından soğuduktan gibi özel çabuk katılaşır.
  6. Bir neşter bıçakla doku içeren özel bir kare blok döşeme ve cerrahi (non-toksik) tutkal kullanarak vibratome numune tutucu üzerinde tutkallayın.
  7. Buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile numune (beyin-hipofiz) sahibi alma vibratome küvet doldurmak
  8. Vibratome yer numune tutucu ve özel blok 150 µm, yüksek frekans ve düşük hızlı kesit için kullanarak parasagittal bölümlerini yapmak için kesti. Seçili bölümleri toplamak ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC 3 mL ile yama-kelepçe kayıt odasına koyun
  9. Kılavuz ARP (Şekil 2B) doku bölümüne yerleştirin.
    Not: ARP kaplama ile birlikte doku stabilize ve yama-kelepçe kayıtları sırasında taşınmasını engelleme.
  10. ARP yer sonra Ca2 + ücretsiz EC orta ile Ca2 + normal EC ve BSA için değiştirin. 10 dk için doku dinlensin.

3. delikli yama-kelepçe ve elektrofizyolojik kayıtlar

  1. Deneme başlamadan önce klorür gümüş tel elektrotlar tarafından aşağıdaki adımları: Öncelikle, gümüş tel elektrot temizlemek için ince zımpara (p180) kullanın. İkinci olarak, 2 mL % 70 etanol ile yıkayın. Üçüncü olarak, 2 ml, 2-%5 klor 10 dk teller daldırma. Son olarak, 2 mL, ultrasaf H2O. durulama
  2. Kayıt odası beyin hipofiz dilim ile mikroskop aşamasında yer ve 10 X objektif kullanarak hedef alan (hipofiz) belirleyin ve 40 X objektif kullanarak hücreleri incelemek.
    Not: hazırlık başarılı olursa, çok az yuvarlak hücre görünür olmalıdır. Dokudan ayırma genellikle zarar görmüş hücreleri bu yuvarlak hücrelerdir.
  3. %2 agar Köprüsü üzerinden Topraklama elektrot EC banyo içine yerleştirin.
  4. 40 X objektif kullanarak bir sağlıklı hücreye bulun.
    Not: Sağlıklı hücre olmalı sıkıca doku dilime bağlı ve değil yuvarlanır ve dilimden ilişkisi kesildi.
  5. Amplifikatör gerilim-kelepçe (VC; ayarla Şekil 4A nokta 1) modu. Açık mühür test pencere ve basın banyo yapılandırması (4B rakam noktası 1 ve 2. 5-mV nabzı pipet direnç (4B rakam noktası 3) izlemek için kullanın.
  6. Backfill IC çözüm Amfoterisin B ile mikro-dolgu kullanarak eklemeden önce antifungal ücretsiz IC çözüm ile yama pipet ucu (bkz. Şekil 3).
  7. Biraz olumlu hava basıncı 1 mL şırınga kullanarak düzeltme eki pipet ekleyin.
    Not: Bu uç kontaminasyon yama pipet küçük bir sıvı akışı yapar.
  8. Bir kez banyo, yama pipet direnç değerlendirmek ve hiçbir parçacıklar pipet (Şekil 4 c) ucuna bağlı emin olun.
    Not: Küçük bir parça bant video kayıt formu görüş alanı gösteren monitör eklenir. Bu ne zaman amaç cepten odaklanarak değil yama pipet hücreye göre daha kolay konumlandırma yapar.
  9. Yama pipet micromanipulators kullanarak hücre aşağı yol.
    Not: pipet pipet ucu bağlı küçük parçacıklar yaşar temiz olduğundan emin olun. Direnç ani değişiklikler de pipet ucu sıkışmış parçacıklar bir sonucu olabilir.
  10. Ne zaman bir kaç pipet yeniden düzenlemek mikron hücrenin üstündeki pipet ucu 1/3 Orta hücre, hücre Şekil 5' te gösterildiği gibi dokunmatik olacak böylece. Ne zaman hücre dokunmadan, basınç ve yumuşak emici bir mühür yapmak uygulamak.
    Not: Yama pipet zaman banyo başarılı bir girer mühür tutulan olabildiğince kısa. Fazla 1-1,5 Amfoterisin B sızıntı ve Pipet Ucu banyo içine ulaşan önlemek için min.
  11. Hemen yama-kelepçe yazılım (Şekil 4 D noktası 1) Düzeltme Eki penceresinde geçiş ve -50 ve -60 mV (Şekil 4 d noktası 2) arasında bir holding potansiyele sahiptir. Sıfır out hızlı kapasite Cam Pipet (Şekil 4 d 3 nokta) tarafından yapılmış.
  12. Yama-kelepçe yazılım (4E rakam noktası 1 ve 2) hücre penceresine geçin ve erişim direnç, Ra, pencerede görüntülenen izleme başlatın. Membran kapasitans amplifikatör yazılım (4E rakam noktası 3) dışarı sonra yeterli erişim sıfır.
    Not: Yeterli erişim 10-30 dk (4E rakam noktası 2) alabilir. Ulaşım için geçerli kelepçe kayıtları 20 M olmalıdır.
  13. Geçerli kelepçe, IC, amplifikatör yazılım penceresinde (4F rakam nokta 1) geçin. Hızlı kapasitif akımlar 3.12 olduğu gibi aynı değere amplifikatör yazılım (4F rakam noktası 2 ve 3) ben-kelepçe penceresinde ayarlayın. Membran potansiyeli (4F rakam nokta 1) kontrol edin.
    Not: Önemlisi, potansiyel membran sığ ise (tipik -35 yukarıda mV) hücre zarar görmüş olabilir. Kaydı iptal et ve yeni bir hücre bulma.
  14. Sağlıklı hücre bulduktan sonra (membran -40 altında potansiyel dokuyla sıkıca bağlı mV), deneysel kayıtları üreticinin iletişim kuralı 33,34detaylı olarak başlatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı bir medaka transgenik hat [Tg (lhb- hrGfpII)] nerede (Lh üreten gonadotropes) hedef hücreleri kullanılarak hipofiz (gonadotrope) hücrelerden güvenilir elektrofizyolojik kayıtları elde etmek nasıl adım adım protokolünden gösterir yeşil flüoresan protein (GFP) ile etiketlenir.

Başlangıçta, tüm hücreli yapılandırma'yı kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Ancak, spontan Aksiyon potansiye...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Elektrofizyolojik kayıtlar yama-klemp tekniği beyin hipofiz dilimleri kullanarak dikkatli optimizasyonu gerektirir. Teleosts araştırmalarda özellikle canlı hücre yürütmek için iyi optimize edilmiş memeli sistemlere dayalı iletişim kuralları kullanarak yayınlar çoğunluğu ile sınırlı iletişim kurallarıdır. Bu bağlamda, olmak önemlidir gibi parametreleri çeşitli fizyolojik pH ve osmolalite aslında farkında değil sadece tür bağımlı ama de çok bağımlı olup söz konusu organizma karada veya su'da yaşıyor. Eğer onlar bir deniz v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

Biz Bayan LourdesCarreon G Tan medaka tesisin bakımı ona yardım için ve Anthony Peltier açıklayıcı rakamları için teşekkür ederim. Bu eser NMBU ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numaraları 244461 (su ürünleri programı) ve 248828 (Digital hayat Norveç programı) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VibratomLeicaVT1000 S
Kirurjik yapıştırıcıWPIVETBOND3M Vetbond Doku Yapıştırıcı
Paslanmaz çelik bıçaklarCampden Instruments752-1-SS
metal kalıplarSAKURA4122
çelik arpWarner instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
Ultra saf LMP agarozinvitrogen166520-100
yama pipetleriSutter InstrumentBF150-110-10HPBorosilikat filamentli OD:1,5 mm, ID:1.10 mm
Mikroskop SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Moleküler Cihazlar# 1-2500-0180yazılım
Sayısallaştırıcı Digidata 1550A1Moleküler CihazlarDD1550
Amplifikatör Multiclap 700B Başlık CV-7BMoleküler Cihazlar1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifloroasetat tuzu 
pipet çektirmeSutter AletiP-1000
amfoterisin BSIGMAA9528gözenek oluşturan antibiyotik
polietilenimin ve nbsp;SIGMAP3143%50 PEI çözeltisi
mikrofiler şırıngaWPIMF28/g67-5
agar köprüsü için camSutter InstrumentBF200-116-15Filamentli borosilikat OD:2.0 mm, ID:1.16 mm Ateşle cilalanmış
Micro-Manager yazılımıAçık Kaynak Mikroskopi Yazılımı
optiMOS sCMOS kameraQimaging  01-OPTIMOS-RM-16-C
sonikatörElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-GlikozSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2SiGMAC8106
SükrozSiGMA84097
D-mannitolSiGMA63565
MES asitSIGMAM0895
BSASIGMAA2153

Kaynaklar

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Elektrofizyolojik Kay tlarPerfore Patch clampAmfoterisin B PerforasyonuTeleost Bal k HipofiziMedaka Oryzias latipesVibratom Kesit AlmaT m H cre Patch clampAksiyon Potansiyeli KaydKalsiyumsuz Sol syon
Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.