Yöntem makalesi

Ölçeklenebilir, Hızlı montaj ve biyoaktif proteinler ve Immunostimulants yükleme yolu ile birden parlamak Nanoprecipitation çeşitli sentetik Nanocarriers içine

DOI:

10.3791/57793

⸱

11 Ağustos 2018

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomalzemeler çok yönlü kontrollü tedavi teslimat temel bilim ve çevirim uygulamalar için mekanizmalar kullanır, ancak onların imalat kez en Biyomedikal laboratuvarlarda kullanılamaz uzmanlık gerektirir. Burada, iletişim kuralları ölçeklenebilir imalat ve terapötik flash nanoprecipitation kullanarak çeşitli kendi kendine monte nanocarriers yüklenmesini için mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomalzemeler tedavi ve görüntüleme uygulamaları için tek ve kombine moleküler payloads kontrollü teslimat özelleştirmek için seçenekleri çok çeşitli sunuyoruz. Bu artan özgüllüğü düşük yan etkileri ve daha düşük dozlarda ile daha yüksek güç de dahil olmak üzere önemli klinik üzerinde etkileri olabilir. Ayrıca, in situ hedefleme ve belirli hücre alt kümeleri kontrollü modülasyon temel biyolojik olayların içinde in vitro ve in vivo incelemeler geliştirmek ve hücre işlevini prob. Ne yazık ki, nano bilimi, kimya ve mühendislik kez gerekli uzmanlık yasaklamak laboratuvarlar bu alanlardaki deneyimi olmayan imalatı ve onların soruşturma için araçları veya Araçlar için Nanomalzemeler özelleştirme onların tedavi stratejileri. Burada, sentez ve ölçeklenebilir bir çok yönlü toksik olmayan blok kopolimer sistem facile oluşumuna müsait Meclisi ve biyomedikal uygulamalar için nano araçların yükleme için iletişim kuralları sağlar. Flash nanoprecipitation farklı nanocarriers poly(ethylene glycol) -blüzerinden hızlı imalatı için bir metodoloji olarak sunulan-poli (propilen sülfit) kopolimerler. Bu protokoller laboratuvarları geniş bir yelpazede uzmanlık ve kaynaklara kolayca izin ve tekrarlanarak gelişmiş nanocarrier dağıtım sistemleri uygulamaları için imal. Tasarım ve flash nanoprecipitation kolaylaştırmak için bir yüksek hızlı şırınga pompa istihdam otomatik bir araç inşaat süreci ve homojenliği gelişmiş denetime izin vermek için boyut, Morfoloji ve yük-in polymersome nanocarriers olduğunu açıklanan.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocarriers küçük ve makromoleküllerin kargo, kontrollü teslimat için izin dahil olmak üzere etkin varlıklar, aksi takdirde kapsüllü, ya son derece parçalanabilir ve/veya Yönetim içinde vivoiçin de hidrofobik olurdu. Düzenli olarak fabrikasyon nanocarrier türleri morfoloji, polimer veziküller (polymersomes olarak da bilinir) lipozomlar benzer teklif Hidrofilik ve hidrofobik kargo1,2aynı anda yüklemek için yetenek. Gelecek vaat eden onların avantajlara rağmen polymersomes nedeniyle, kısmen, birkaç temel zorlukla onların imalat için klinik uygulamalarda hala nadirdir. Klinik kullanım için polymersome formülasyonları büyük ölçekli, steril ve tutarlı gruplar halinde yapılması gerekir.

Bir takım teknikler-ebilmek var olmak kullanılmış için formu polymersomes poly(ethylene glycol) -blokgibi bir diblock kopolimer üzerinden-poli (propilen sülfür) (PEG -bl- PPS), solvent dağılım3, ince film rehidrasyon1 içeren , 4, havacilik 5,6ve doğrudan hidrasyon7. Solvent dağılım uzun bir kuluçka kez proteinler gibi bazı biyoaktif payloads denatüre organik çözücüler huzurunda içerir. İnce film rehidrasyon kez kabul edilebilir monodispersity elde etmek için pahalı ve zaman alıcı ekstrüzyon teknikleri gerektiren kurulan polymersomes polydispersity üzerinde denetim sağlamaz. Ayrıca, microfluids ve doğrudan hidrasyon ölçek daha büyük üretim birimleri için zordur. Farklı nanocarrier imalat yöntemleri, flash nanoprecipitation (FNP) büyük ölçekli ve tekrarlanabilir formülasyonları8,9,10yapma yeteneğini sunmaktadır. Sırasında FNP daha önce katı çekirdekli nano tanecikleri formülasyon için rezerve edilen, laboratuarımıza son zamanlarda çeşitli PEG -bl- PPS nanostructure türleri morfoloji11, tutarlı oluşumu dahil etmek FNP kullanımı genişletti 12, polymersomes11 ve bicontinuous nanospheres12de dahil olmak üzere. İnce film rehidrasyon ve solvent dağılımı tarafından kurulan sigara kalıptan çekilmiş polymersomes göre üstün polydispersity dizin değerlerini sonuçlanan FNP ekstrüzyon, gerek kalmadan polymersomes monodisperse formülasyonları şekillendirme yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymuştur 11. Bicontinuous nanospheres, onların büyük hidrofobik etki alanları ile bir dizi FNP12ile solvent koşul altında şekillendirme rağmen ince film rehidrasyon tarafından oluşturulmasına izin mümkün değildi.

Burada, biz bir sentezi için PEG -bl- PPS diblock kopolimer polymersome oluşumunda kullanılan ayrıntılarıyla, FNP FNP için kullanılan sınırlı sıkışma jetler (CIJ) Mikser protokol kendisi ve otomatik bir sistem uygulanması Kullanıcı değişkenliği azaltır. Yeterince endotoksin-Alerjik formülasyonları kullanım vivo içindeve FNP tarafından kurulan polymersomes karakterizasyonu ilgili temsilcisi verilerin için üretmek için sistem sterilize hakkında bilgi içerir. Bu bilgileri kullanarak, okuyucuların ilgi polymersomes vitro ve in vivo çalışmaları için kullanan ile steril, kendi monodisperse formülasyonları imal etmek mümkün olacak. Deneyime sahip okuyucular nanocarrier formülasyonları ve polimer sentez uzmanlığı ile hızla FNP geçerli formülasyonu teknikleri için potansiyel bir alternatif olarak kullanarak kendi polimer sistemleri test edebilecektir. Ayrıca, burada açıklanan protokoller eğitim araçları nanocarriers nanoteknoloji Laboratuvarı dersleri formülasyonu için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Poly(ethylene glycol) -bloksentezi-poli (propilen sülfit)-Thiol

  1. Metoksi-poly(ethylene glycol) mesylate sentez (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, ben).
    1. MeO-PEG17- Oh 200 ml % 100 Toluen 3-boyun yuvarlak alt kabı (RBF) içinde 10 g 600 RPM manyetik karıştırma altında geçiyoruz.
    2. Kendisi bir kondansatör için bağlı bir Dean-Stark aparatı 3-boyun RBF bağlanmak, asal gaz altında tüm sistem tutmak azot veya argon.
    3. 3-boyun RBF bir yağ banyosu, karıştırma 600 rpm'de ise 165 ° C ısıya yerleştirin.
    4. İzleme su ve 100 mL Toluen azeotropic damıtma kullanarak kaldırın.
    5. 3-boyun RBF yağdan çıkarın, Dean-Stark aparatı inert gaz koşulları koruyarak ayırmak ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
    6. MeO-PEG17-OH çözüm karıştırma 600 rpm'de ise 5.6 mL % 100 trietilamin (3 molar EQ) ve susuz % 100 Toluen 300 mL ekleyin.
    7. 3-boyun RBF bir buz banyosu için hareket, karıştırma 600 rpm ve inert gaz koşulları sağlamak.
    8. % 100 methanesulfonyl klorür (3 molar EQ) 3.1 mL % 100 Toluen 30 mL seyreltik, yavaş yavaş karıştırmaya 600 rpm'de ise bir ek huni ile 3-boyun RBF ekleyin.
    9. Gecede etkisiz koşullar altında oda sıcaklığında 600 rpm'de ilave edin.
    10. Filtre çözümü Buchner huni Paketli atomik toprakla (bakınız Tablo reçetesituzları kaldırmak için).
    11. Toluen döner buharlaştırıcı üzerinden 40 ° c, rotasyon 120 rpm ve 50-100 milibar arasında ayarlamak basınç ayarla su banyosu ile kaldırın.
    12. % 100 diklorometan (DCM) 200 ml ürün yeniden dağıtılması ve filtre atomik earth ile Paketli Buchner huni ( Tablo malzemelerigörmek).
    13. DCM döner buharlaştırıcı 40 ° c, rotasyon 120 rpm ve 450-600 milibar arasında ayarlamak basınç ayarla su banyosu ile kaldırın.
    14. İdareli ürün % 100 DCM yılında yeniden dağıtılması ve yavaş yavaş buz gibi % 100 dietil eter 500 mL dropwise (Pasteur pipet) ekleyerek ürün çökelti. Karıştırma 300 devirde korumak.
    15. Dikkatle boşaltmak veya dietil eter zarlarını ürününden MeO-PEG17kaldırmak için Aspire - Mesylate ve Mağaza Vakum desiccator tamamen kurumasını bir gecede.
    16. Ürün hemen kullanın veya inert gaz-20 ° c altında birkaç ay için saklayabilirsiniz.
  2. Metoksi-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-PEG17-TA, II) sentez.
    1. MeO-PEG17-Ms (I) % 100 susuz dimethylformamide (DMF) 3-boyun RBF 200 ml, 5 g geçiyoruz, inert gaz altında oda sıcaklığında 600 rpm'de ilave edin.
    2. % 100 potasyum karbonat (3 molar EQ) 2.5 g çözüm karıştırarak ekleyin.
      Not: potasyum karbonat tamamen çözümünde eriyecektir değil.
    3. % 100 Tioasetik asit (3 molar EQ) 1.3 mL 100 mL % 100 oranında seyreltin susuz DMF ve dropwise eriyik yolu ile bir ek huni ekleyin.
      Not: Tioasetik asit güçlü, nahoş bir kokusu vardır. Gecede önce elden çıkarma veya temizlik kimyasal duman hood içindeki tüm kirli nesneler tutmaya özen göstermelidir.
    4. Karistirin (d/d 600 veya daha büyük) bir gecede oda sıcaklığında.
      Not: Tuz oluşumu kolayca bu çözümün karıştırma bozabilir. Gecede karıştırarak korumak için özen göstermelidir.
    5. Filtre çözümü Buchner huni Paketli atomik earth ile (bkz. Tablo malzeme).
    6. DMF döner buharlaştırıcı 60 ° c, rotasyon 120 rpm ve 5-15 milibar arasında ayarlamak basınç ayarla su banyosu ile kaldırın.
    7. Ürün % 100 tetrahydrofuran (THF) 100 ml dağıtılması ve tarafsız alümina ile kırmızı/turuncu renkli kirleri çıkarmak için Paketli bir sütun ekleyin.
    8. THF döner buharlaştırıcı 40 ° c, rotasyon 120 rpm ve 200-300 milibar arasında ayarlamak basınç ayarla su banyosu ile kaldırın.
    9. İdareli ürün % 100 DCM yılında yeniden geçiyoruz. Tuz bir çökelti formlar varsa, filtre solution'ı 6 mikron gözenek boyutu filtre kağıdı bir Buchner huni kullanarak.
    10. Yavaş yavaş ürün dropwise buz gibi % 100 dietil eter 300 devir / dakikada karıştırarak, 500 mL Pasteur pipet ile ekleyerek çökelti. Dietil eter çökelti kaza değil Eğer daha fazla ile-20 ° C arasında bir patlama koruyucu dondurucuda birkaç saat için soğutulmuş gerekebilir çözüm 4 ° C'de dışında
    11. Dikkatle boşaltmak veya dietil eter zarlarını ürününden MeO-PEG17-Thioacetate kaldırmak için Aspire edin. Ürün gecede bir vakum desiccator ve daha sonra inert gaz-20 ° C'de altında depolamak
  3. Diblock kopolimer poly(ethylene glycol) -blok -poly(propylene sulfide)-thiol sentez (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. MeO-PEG17-TA (II) 10 mL % 100 dağıtılması susuz DMF argon, oda sıcaklığında su banyosu içinde 400 rpm karıştırma sırasında altında bir Schlenk şişesi içinde.
    2. Sodyum methoxide (metanol 0,5 M çözümde), 1.1 molar eq izin 400 rpm'de 5 dakika karıştırın için ekleyin.
    3. % 100 propilen sülfür, 35 molar eq hızla ekleyin. 400 devir / dakikada 10 dakika karıştırın olanak sağlar.
    4. 400 rpm'de 5 dakika karıştırın için izin, 10 molar eq % 100 buzul asetik asit ekleyin.
    5. DMF döner buharlaştırıcı 60 ° c, rotasyon 120 rpm ve 5-15 milibar arasında ayarlamak basınç ayarla su banyosu ile kaldırın.
    6. % 100 DCM idareli üründe yeniden dağıtılması, 80 ml % 100 metanol, iki 50 mL konik santrifüj tüpleri arasında bölünmüş çökelti.
    7. 7500 x g 4 ° C'de 5 dakika, konik tüpler santrifüj Dış görev süpernatant Aspire edin.
    8. Mağaza ürün, PEG17-bl- PPS35-SH, bir vakum desiccator ve daha sonra inert gaz-20 ° C'de altında bir gecede

2. montaj PEG -bl -PPS Nanocarriers Hand-Powered Flash Nanoprecipitation yolu ile

  1. (İsteğe bağlı) Sınırlı sıkışma jetler (CIJ) Mikser sterilize.
    1. Bir biyolojik güvenlik içinde dolap (BSC), mikser ile tüm parçaları içinde 0.1 M NaOH gecede demonte daldırın.
    2. Tekrar CIJ Mikser ve radarı-kilit şırınga kullanarak endotoksin ücretsiz su akışı.
    3. Suyun pH test ve tarafsız olarak pH kayıtları kadar su akmaya devam.
  2. PEG17-bl- PPS35çözülür-SH polimer ve hidrofobik kargo bölümünde THF (sıkışma çözüm 1).
    1. PEG17-bl- PPS3520 mg tartmak-SH 1,5 mL tüp içine.
    2. Hidrofobik boyalar (Örneğin,dıı, ICG), eklemek ilaçlar (Örneğin,rapamycin) veya diğer kargo.
      Not: Kargo kuru veya su karışan bir çözücü, tercihen THF içinde çözünmüş olabilir. Kargo THF veya DMF çözünmez ise, polimer çözünür olması pek mümkün olduğu gibi başka bir su karışan solvent, ama idareli kullanılır. Yüklenebilir kargo kargo özellikleri üzerinde bağımlı olan kendisi (Örneğin, molekül ağırlığı, hydrophobicity, steric dikkat edilmesi gereken noktalar) ve bir ayrı ayrı dava-11,12tarihinde araştırdı.
    3. %100 500 µL eklemek THF polimer ve kargo, şiddetle çözülmeye girdap.
  3. Sulu tampon (sıkışma çözüm 2) hidrofilik kargo geçiyoruz. Bunun için gerektiği gibi sulu arabelleği (Örneğin, fosfat tamponlu tuz saf suya, vb) 500 µL polimer veziküller içinde yüklenmesi için hidrofilik kargo geçiyoruz.
  4. Arabellek için rezervuar ekleyin.
    1. 2.5 mL (Örneğin, 1 fosfat tamponlu tuz x) tercih sulu arabelleği uygun ölçekli bir rezervuar için (Örneğin, 20 mL cam mercek flakon) ekleyin. Öyle ki çıkış Mikser üzerinden doğrudan havzanın girer rezervuar CIJ mikser altında yerleştirin.
  5. Sıkışma çözümleri ayrı 1 mL plastik tek kullanımlık şırınga yükleyin.
  6. Çözümleri birbirleriyle aynı anda nanoyapıların oluşturmak ve onları yükü ile yüklemek için vurmak.
    1. Şırınga radarı-kilit bağdaştırıcıları CIJ Mikser üstündeki takın.
    2. Bir tek, pürüzsüz ve hızlı hareket, her iki şırınga aynı anda ve eşit güçle düşürmek.
      Not: birden çok sıralı eklemininden performans varsa, ilk boş bir depo çıkış toplamak.
    3. (İsteğe bağlı) Birden çok eklemininden gerçekleştirin. İki şırınga ve adımları yineleyin 2.6.1-2.6.2 en fazla 4 kez daha arasında bölünmüş doğmakta olan nanostructure çözüm.
    4. Çıkış 2.4.1 içinde hazırlanan sulu tampon dolu Reservoir toplamak ve karıştırma sağlamak için hafifçe karıştırın.
  7. Boş kargo ve organik çözücü kaldırın.
    1. (1. seçenek) En az 24 saat en az 2 arabellek değişiklikleri ile uygun bir MW kesme tüp kullanarak nanocarrier formülasyonu sıkışma için kullanılan aynı sulu arabellek ve depo, diyaliz. Bu oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.
      Not: Nanocarriers boru ile MW kesim tarafından muhafaza edilecektir < 100.000 kDa ve potansiyel olarak daha yüksek cutoffs tarafından de tutulabilir. Bu seçenek bir BSC steril tampon kullanarak gerçekleştirilen zaman kısırlık tutar.
    2. (Seçenek 2) Formülasyon bir boyutu dışlama veya 1 x PBS sulu tampon olarak kullanarak desalting/tamponu Satım sütun (Örneğin, Sepharose 6B sütun) aracılığıyla filtre.
      Not: Bu seçenek bir BSC iyice sterilize bir sütunla gerçekleştirildiğinde kısırlık tutar.
    3. (Seçenek 3) Uçucu organik çözücü vakum kuruma gecede kullanarak kaldırın.
    4. (Seçenek 4) Filtre 50-100 kDa filtre bağlı olarak uzak saf unencapsulated kargo molekül ağırlığı 1 saat 15 dakika 20-60 mL/dk akış hızında çalıştırarak bir teğet akış filtrasyon sistemi kullanarak formülasyonu (daha büyük kargo daha uzun alacak).
  8. (İsteğe bağlı) Nanocarrier formülasyonu konsantre.
    1. (1. seçenek) Konsantre bir spin yoğunlaştırıcı sistemi kullanarak (Örneğin, spin sütun MW ile kesme > 100.000), kullanılan üreticisi tarafından açıklandığı gibi.
      Not: Nanocarriers spin arasında resuspended gerekebilir ve spin aşağı istediğiniz birim konsantre bir dizi gerektirebilir. Spin konsantrasyon nanocarrier formülasyonları kısırlık azaltabilir.
    2. (Seçenek 2) Vakum kuruma kullanarak ses azaltın.
      Not: Birim değişikliği bu koşullar altında kontrol etmek zordur ve öncesi ve konsantrasyon sonrası Osmolarite korumak için özen göstermelidir.
  9. Ay hafta nanocarriers 4 ° C'de depolayın. Sonra depolama, kısaca girdap nanocarrier formülasyonları kullanmadan önce.

3. Nanocarrier formülasyonları karakterize

  1. Verimlilik yükleme ölçmek
    1. Kargo floresan veya belirli bir dalga boyu 260-450 nm dışında güçlü emer, floresans/absorbans fluorimeter/spektrofotometre kullanarak ölçmek.
      Not: PEG -bl- PPS şiddetle 260-310 nm emer ve miktar benzer bir dalga boyu emer kargo karmaşık hale 310-450 nm den polymersome formülasyonları emer.
    2. Kargo 260-450 nm aralıkta emer ve hidrofilik ise, PEG -bl- PPS nanoyapıların eşit miktarda % 1 H2O2 veya % 1'için formülasyon 25 μL ekleyerek bozabilir Triton X-100 ve daha sonra ayrı ve ayırt Kargo polimer absorbans sulu ile uyumlu bir boyutu dışlama sütun kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) üzerinden üzerinden arabelleğe alır (Örneğin, bir Sepharose 6B sütun) 11.
    3. Kargo 260-450 nm aralıkta emer ve THF veya DMF çözünür ise, formülasyon bir 1,5 mL plastik tüp-80 ° C'de 100 μL gecede dondurarak lyophilize. O zaman bir cam vakum kabı ve yer bir lyophilizer üzerine tüpü yerleştirin. Lyophilization oluşur ve daha sonra yeniden ayırma ve HPLC ile algılama önce 50 μL DMF veya THF içinde erimesi için 24 saat süre tanıyın.
  2. Ölçü nanocarrier boyut ve Morfoloji
    1. Dinamik ışık saçılma (DL)11 veya analiz13 izleme nanopartikül nanocarrier boyutunu ölçmek için kullanın.
      Not: Nanocarriers PEG17-bl- PPS35kurdu-SH beklenen 100-200 nm arasında ortalama bir çapa sahip, bir polydispersity ile < 0,3 dizin için.
    2. Nanocarrier morfoloji kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu (cryoTEM)14kullanarak belirleyin.
      Not: Nanocarriers PEG17-bl- PPS35kurdu-SH polimer veziküller (polymersomes) bir açıkça discernable polimer membran ve büyük ölçüde küresel şekli ile olacağı tahmin ediliyor.
  3. (İsteğe bağlı) Endotoksin için test formülasyonları
    1. (1. seçenek) Bir hücre tabanlı tahlil endotoksin, Örneğin, ham mavi hücreleri veya HEK mavi TLR4 hücreler, ( Tablo malzemelerigörmek) durumu için ya bir nitel veya nicel tahlil lipopolisakkaritler (LPS)13 için üretici tarafından açıklandığı gibi kullanmak .
    2. (Seçenek 2) Bir Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 tahlil seti, üretici tarafından açıklandığı gibi kullanın.

4. FNP için bir yüksek hızlı şırınga pompa imalatı

  1. Özel alet bileşenleri imal.
    Not: tüm özel parçaları işleme için 3D modelleri içinde ek materyalleri sağlanır.
    1. ¾" Akrilik levhalar çok katmanlı enstrüman şasi makine ve (bkz: Ek dosyalar 1-5) bir araya.
      Not: Akrilik zavallı kimyasal dayanımı yüksektir. Araç ile sert çözücüler kullanılacak ise, uygulama için uygun görülen bir metal tabanından makine.
    2. 3D baskı parçaları ile polylactide (PLA) plastik ile basılmış.
      1. Şırınga sınırdışı (SE) 2 parça aparat yazdırma: SE Bölüm 1 - taşıma (Şekil 5F, gri bölüm; holding arka FNP blok Ek dosya 6) ve SE Bölüm 2 - açık sınırdışı Kılavuzu (Şekil 5F, siyah bölümleri; Ek dosya 7). Ek dosya 2 şemaları için bkz.
      2. Kızılötesi sensör ayraçlar (Şekil 5I, siyah kutular; Yazdır Ek dosyaları 8 ve 9).
      3. (İsteğe bağlı) Çift şırınga dalgıç ayraç yazdırın.
  2. Araç kasa katmanları M5 onaltılık cıvata birlikte bağlayın ve Kauçuk ayak tabanına ekleyin.
  3. Bir Tek platalı bilgisayar Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) işletim sistemi (Linux Debian dayalı) ile yapılandırın.
    Not: yazılım aracı çalıştırmak için istek üzerine mevcuttur. Araç yazılım kaynak kodu elde edilebilir üzerinde rica. Sıkıştırılmış dosyayı aldıktan sonra Benioku dosyasında belirtilen tüm bağımlılıkları indirin. Bu bilgisayar yazılımı alet çalışma, temel çalışma parametreleri (motor hız, yön, vb) dahil olmak üzere üzerinde kontrol sağlayan basit grafik kullanıcı arabirimini içerir. Kullanıcılar varolan kaynak kodu üzerinde genişletmek için teşvik edilir ve kendi deneyleri programı özel modülleri için özel olarak tasarlanmış kullanın. Tüm yazılım Python 2.7.12 kullanılarak yazılmıştır ve şu anda Python 3 ile uyumlu değildir. RPi, PicoBorgRev, antep ve çoklu işlem modülleri kullanılmaktadır. Benioku dosyası yazılım dağıtım lisansı ile ilgili ayrıntılı bilgi içerir.
  4. 24 V DC motor (Şekil 5A) ve hassas slayt (4,5"(114.3 mm) kontur; kurşun 1,27 mm vida) fırça (Şekil 5C) yükleyin.
    Not: burada kullanılan 24 V DC motor bir RPMMaksimum, vardır benmaxve 4,252 RPM, 4.83 A, tam yük tork ve ~0.2 N * m, anılan sıraya göre.
    1. (İsteğe bağlı) Doldurma işlemi sırasında titreşimi azaltacak motor altında yerleştirin.
      Not: Bir 2-3 mm kalın lastik pedi enstrüman Bankası motorlu obüs boyutları uygun kesilmiş önerilir.
    2. Hassas slayt enstrüman tabanına monte.
      1. Dişli çubuk geçici olarak kaldırın.
      2. İki #8-32 düz makine vidaları kullanarak slayt bağlayın.
    3. Mount DC motor vida ışın kaplin (1-1/4" uzunluk) 6/16" ve 1/4" çapında içeren kullanarak hassas slayda sıkıyor.
      Not: enstrüman taban katmanları makine için kullanılan akrilik kalınlığına bağlı olarak, dolgu verileri motor ve hassas slayt milleri seviye için gerekli olabilir.
  5. Sınırdışı platformu metal plakalar ve L şeklindeki köşe parantez (Şekil 5 d) topla. Yana kayar platform (dişli çubuk için ekli) bölge: erime çizgisinin platforma monte #6-32 vidaları kullanarak. Hassas slayt şematik montaj kısıtlamaları ile ilgili ayrıntılı bilgi için üretici tarafından sağlanan bakın.
  6. Şırınga sınırdışı sistem kurulumu bir araya getirin.
    1. Doğrusal hareket Yastık bloklar (montaj platformlar + lineer hareket taşıyan) (paralel çelik raylar kolayca Şekil 5' te görülebilir) M8 krom kaplama paslanmaz çelik raylar üzerine ekleyin.
    2. İş parçacığı Raylar doğrusal şaft aracılığıyla Kılavuzu/destek ve raylar kilitleyin. Demiryolu başına üç Kılavuzlar'ı kullanın. Mount SE parçalar 1 ve 2 yastık bloklar M4 makine vidaları kullanarak üzerine.
    3. Gevşek SE parçalar 1 ve 2 onaltılık M8 civata ile katılın. SE Bölüm 1 ve 2 ile güvenliği sağlanan her cıvata kapsayan helisel baskı yayları arasındaki iki içe dönük naylon burçlar (bkz. Şekil 5F) arasındaki boşluğu yapılandırın. Bu burçlar SE Bölüm 1 ve SE Bölüm 2 dış bağlayın.
  7. Tel devre (bkz. Şekil 6 çekirdek bağlantı şeması için)
    1. I2C/SDA, 3,3 V, motor kontrolörü bağlayın ve GND pimleri tek tahta bilgisayar.
    2. DC motor terminalleri M - ve M + motor kontrolörü kurulu bloklarını bağlayın. 24 V, 2.5 A güç kaynağı (Şekil 5B) motor kontrolörü V + ve GND bloklarını bağlanmak (denetleyici nihai tasarım basit elektronik kutusunda kaplı, Şekil 5 Hbakınız).
    3. Motor kontrol kurulu 3V3 ve 5V pin tek tahta bilgisayar ilgili pimlerinden bağlayın. Motor kontrolörü ile SDA ve SCL pim pim 3 ve 5 / tek tahta bilgisayar için sırasıyla bağlayın.
      Not: Motor denetleyicisi aracılığıyla tek tahta bilgisayar üzerinden DC motor için komutlar verilir. Motor hızı darbe genişlik modülasyonu ile motor terminaller arasında voltaj düzenleyen tarafından kontrol edilir. En fazla geçerli 24 V DC motor ile çalışan bu kurulumunda (tam yükleme amper: 4.83 A) 2,5 bir 24 V güç kaynağı ile sınırlıdır. Bu motor devre bir normalde kapalı (NC) acil durum durdurma (5J rakam) kablolu tavsiye edilir. Bunu yaparken bir temel acil kapatma işlemi etkinleştirmek için motor devre bozmak için bir yol sağlar.
    4. Ön ve arka kızılötesi yakınlık duyumsal (dijital mesafe sensörleri, Şekil 5I) sırasıyla 24 ve 23, RPi GPIO pin bağlayın.
      1. Rota Sensör kablo kanallarını enstrüman Bankası'aracılığıyla.
        Not: Temassız sonu-ışın hareket sensörleri bir algılama mesafesi 2-10 cm ile IR algılayıcılar.
      2. 4.7.4.2 kablolu IR sensörleri 3D baskılı kızılötesi sensör ayraçlar (Şekil 5I, siyah kasa) snap ve enstrüman Bankası monte. Küme ayracı doğru olarak ayarlandığında, sensör yüzü dışa doğru 14 mm x 7 mm açma küme ayracı dikdörtgen çıkıntı.
        Not: Bu sensör diş telleri geçici olarak Velcro veya bir yapıştırıcı kullanarak monte edilebilir (geçici montaj uygun şekilde ayarlamak ve IR sensör yerleşimi optimize etmek yararlı). Alternatif olarak, kalıcı enstrüman Bankası küçük kılavuz delik delme ve ayraçlar M2 vida ile güvenli hale getirme tarafından monte.
    5. 7" dokunmatik LCD ekran 5V, GND, bağlanır ve seri arayüz (DSI) iğne tek tahta bilgisayar görüntüler. 7" RPi ve montaj görüntü LCD Şekil 5Giçinde gösterilir.

5. Polymersomes özel yapım yüksek hızlı şırınga pompa kullanarak FNP ile imal

  1. (1. seçenek) Auto koşmak modunu kullanın.
    1. Otomatik Çalıştır ı seçerek projeyi seçin. Sistem kullanıcıların motoru otomatik olarak hassas slayt başına şırınga sınırdışı platformu konumlandırmak için izin ister. Yolun önünde ve arkasında metal plakayı devam etmeden önce açık olduğundan emin olun.
    2. 1 mL plastik şırıngaların 2.5 bölümünde açıklandığı gibi ve mount şırınga dişi radarı konektörler CIJ Mikser üzerine yükleyin. Yük CIJ Mikser (şırınga ile bağlı) içine arka sınırdışı taşıma açılış dikdörtgen (bkz. Şekil 5E).
    3. İstediğiniz motor hızını ayarla (birim: devir/dakika) GUI kaydırıcıyı kullanarak (dikkat edilmesi gerekenler için aşağıdaki nota bakın). En iyi motor hızı belirli pompa ve kurulum bağlıdır ama bir akış hızı en az 1 mL/s burada sağlanan CIJ karıştırıcı kanal boyutları için emin olmalısınız.
      Not: ayar akış hızı ise şunları göz önünde bulundurun. Dikey-elle işletilen FNP yapılandırmada, şırınga ~ 1 mL oranında Reaktanları ihraç / s, ama ne zaman-ebilmek var olmak son derece değişken tahrik el. Bu sadece hangi Kullanıcı şırınga pistonu gelişmeler oranı tarafından kontrol edilir şırınga varil üzerinden akışını oranıdır. 1 mL/s oranı Not çıkış debisi daha küçük çaplı meme atıfta değil . Belgili tanımlık yukarıda belirtilen kanal boyutları, ~ 1 mL/s çalkantılı karıştırma10için uygun bir Reynold numarası sağlamak için tutulan. Kanal çapı buna göre çalkantılı koşulları destekler bir Reynold sayısı korumak için ayarlanır sürece farklı akış oranları kullanılabilir. Şırınga itici bir yüksek-tamlık alüminyum slayt boyunca hamle 24 V DC motor fırçalanmış birleştiğinde dikey bir metal plaka tarafından ileri seviyededir. Bu yapılandırmada, bir dizi faktöre, (1) en yüksek motor hızı (4,252 devir/dakika) dahil olmak üzere en fazla varil akış hızı etkilenir ve birleştirilmiştir hassas slayt (1,27 mm) motoru vida kurşun Milli Küçük (2) motor tork (~0.2 N * m tam-l OAD tork), hangi içine sıvı giriş (3) geri dönüş basıncı katkılarıyla akışı ve CIJ Mikser ve (4) kullanılan şırınga gücünü çıkmak için direnci aşmak için gereklidir (kullanıcılar şırınga üzerinde hareket güçlerinin dikkatli olmalı ve şırınga ile kullanın uygun gücü). (2) ne zaman akışı artan, nokta ile ilgili oranı yeterli tork motor geri dönüş basıncı artırarak altında sabit sınırdışı koruyarak durdurduklarını önlemek için gereklidir. Namlu akış oranları-varil akışı göstermek için oranı söz konusu sistemi elde etmek, durumda düşünün nerede FNP iki tane mililitre şırınga yüklü Reaktanları kullanılarak gerçekleştirilir. 1 mL/s akışı elde etmek için oranı namlu, motor ile metal plaka dalgıç uzunluğu (tipik bir mL şırınga için ~ 68 mm) tarafından tanımlanan bir saniyede mesafe yükseltmelisiniz. Hassas slayt 1,27 mm vida kurşun, o 4,252 rpm'de çalışan bir DC motor platform kadar ilerleyen bir kapasitesine sahip olduğunu aşağıdaki sağlanan ~ 90 mm/s (71 devir/s * 1,27 mm/rev). Bu ~1.3 mL/s, 1 mL/s hedef hızı aşan bir varil akış hızı için karşılık gelir.
    4. Araç çalıştırılmadan önce yolunu emin olmak için sistem kontrol engelleri açık bir platformdur ve ön ve arka IR yakınlık dedektörleri (IR algılayıcılar küçük siyah kutular hassas slayt yakınındaki engelleri açık olan terminalleri; Şekil 5Ibkz.). Ayrıca CIJ Mikser Kılcal boru prizinden uygun toplama konteyner içine yönlendirilir emin olun (ex: cam kabı, vb).
    5. Reaktanları şırıngaları ve CIJ Mikser kovmak için yazılım arayüzü Çalıştır düğmesine basın.
  2. (Seçenek 2) El ile çalıştırma modu kullan. Otomatik çalıştırma modu yönergeleri yukarıdaki bakın ve aşağıdaki değişikliği 5.1.5 adım Not: basın Çalıştır (platform gelişmeler bir baskı olay ve motor yanıtYani, tamamlanması ile sürekli olarak sıkışık belgili tanımlık ileri düğme bir yayın üzerinde olay-ecek durmak).
  3. (Seçenek 3) El ile platform modu konumlandırma kullanın; Bu tarz bırakmak kullanıcı düşük hızda (% 20 güç) motor çalıştırarak platform konumlandırmak yanıt olarak yazılım arayüzü üzerinde ileri ve geri düğmeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz vivo içinde fare ve insan dışı primat Yönetim11,13için güvenli Hidrofilik ve hidrofobik kargo yükleme kapasitesine sahip nanocarriers formülasyonu için basit bir protokol sundu. Mekanik kontrollü sıkışma CIJ Mikser çözümleri için özel bir araç imalatı için bir açıklama ile birlikte temsilcisi sonuçlarımız kullanılan polimer sentezi için detaylı bir protokol de dahil ettik. Şekil 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz polymersomes PEG17-bl- PPS35kullanarak hızlı imalatı için ayrıntılı talimatlar hazırladık-SH diblock kopolimer. Veziküler polymersomes PEG Hidrofilik ve hidrofobik PPS blok moleküler ağırlık bu oranında monte birincil toplama morfolojisi vardır. Ne zaman birden çok kez gerilmelere, onlar bir çapa sahip ve ince film hidrasyon ile 200 nm membran sonra kalıptan çekilmiş polymersomes eşleşen polydispersity kurdu. Bu iletişim kuralı böylece monodisperse polymersome nanocarriers imal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Destek personeli ve araçları Northwestern Üniversitesi yapısal biyoloji tesisinden anıyoruz. R.H. Lurie kapsamlı Kanser Merkezi, Northwestern Üniversitesi ve Northwestern Üniversitesi yapısal biyoloji imkanları desteğinden kabul edilmektedir. Gatan K2 doğrudan elektron dedektörü Chicago toplum güven, Searle fonlarından destek ile Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından sağlanan fonları ile satın alınmıştır. Biz de Northwestern Üniversitesi'nde aşağıdaki imkanları teşekkür: Keck disiplinlerarası yüzey bilim tesis, yapısal biyoloji tesis, biyolojik Imaging tesis, gelişmiş moleküler görüntüleme merkezi ve analitik Bionanotechnology ekipman çekirdek. Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Hibe 1453576, sağlık Müdürü ulusal kurumları'nın yeni yenilikçi Ödülü 1DP2HL132390-01, rejeneratif Nanomedicine Catalyst Ödülü ve 2014 McCormick Catalyst Ödülü Merkezi tarafından desteklenmiştir. SDA kısmen NIH HGUGM Biyoteknoloji eğitim Grant T32GM008449 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Başlangıç Kiti - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Lineer Rulmanlı Platform (Küçük) - 8mm ÇapAdafruit1179
Lineer Hareket 8 mm Şaft, 330 mm Uzunluk, Krom Kaplama, Sementasyon Sertleştirilmiş, MetrikVXBkit11868
Lineer Ray Mili Kılavuzu/Desteği - 8 mm ÇapAdafruit1182
Manuel Konumlu Hassas Slayt 4.5" Strok, 15 lb yük kapasitesiMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Demir At DC motorDemir AtMTPM-P10-1JK43
Resmi Raspberry Pi Vakfı 7" Dokunmatik LCD EkranRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Keskin GP2Y0D810Z0F Dijital Mesafe Sensörlü Pololu Taşıyıcı 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Set Vidalı Kiriş Kaplini, Cilalı Alüminyum, İnç, 5/16" Delik A Çapı, 1/4" Delik B Çapı, 1 "OD, 1-1 / 4" Uzunluk, 44 lb-in Nominal TorkRulandPSR16-5-4-A
Polietilen glikol monometil eterSigma Aldrich202495
Metansülfonilklorür Sigma Aldrich471259
ToluenSigma Aldrich179418
Toluen, SusuzSigma Aldrich244511
TrietilaminSigma AldrichT0886
Elit 545 (Diyatomlu Toprak)Sigma Aldrich419931
DiklorometanSigma Aldrich
Dietil eterSigma Aldrich296082
N, N-Dimetilformamid, susuzSigma Aldrich227056
Potasyum karbonatSigma Aldrich791776
Tiyoasetik asitSigma AldrichT30805
TetrahidrofuranSigma Aldrich360589
Alüminyum oksit, nötr, aktif, Brockmann ISigma Aldrich199974
Sodyum metoksit çözeltisi, metanol içinde 0,5 MSigma Aldrich403067
Propilen sülfürSigma AldrichP53209
Asetik asitSigma AldrichA6283
MetanolSigma Aldrich320390
Sodyum hidroksit çözeltisi 1.0 NSigma AldrichS2770
Endotoksin içermeyen suGE Healthcare Yaşam BilimleriSH30529.01
Kağıt pH şeritleriFisher Scientific13-640-508
Endotoksin içermeyen Dulbecco'nun PBS'siSigma AldrichTMS-012
Borosilikat cam sintilasyon şişeleriFisher Scientific03-337-4
1 mL tamamen plastik şırıngaThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Sıvı kromatografi kolonuSigma AldrichC4169
CIJ karıştırıcı, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma Aldrich216763
HEK-Mavi hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Mavi HücrelerInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Jel Pıhtı LAL TestleriLonzaN183-125
için gelişmiş motor kontrolü320269

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Flash NanoprecipitationPolymer VesiclesBioactive Protein LoadingImmunostimulant DeliverySynthetic NanocarriersHigh Speed Syringe PumpConfined Impingement JetsDynamic Light ScatteringCryogenic Transmission Electron MicroscopyTangential Flow Filtration

İlgili makaleler