Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

13.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

19 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

Bu makalede

Özet

Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.

Özet

Memeli kadın düzenli olarak her estrus döngüsü sırasında yumurtalar hemen hemen sabit bir sayıda yumurtlamak. Böyle düzenlilik ve periyodik olarak sürdürmek için düzenleme hipofiz gonad hipotalamik eksen düzeyinde ve follikül yumurtalık içinde geliştirme ortaya çıkar. Etkin çalışmalar rağmen folikül gelişim mekanizmaları çeşitli adımlar uyuyan ilkel folikül etkinleştirme gelen yumurtlama için ve foliküler her aşamada farklı yönetmelik karmaşıklığı yüzünden net değildir. Folikül gelişim mekanizmaları ve köklerinin estrus döngüsü boyunca dinamikleri araştırmak için bir mikroskop kullanarak folikül gelişim gözlemlemek için kullanılabilir bir fare yumurtalık doku kültürü modeli geliştirdi. Sistematik folikül gelişim, periyodik yumurtlama ve folikül atrezi tek kültürlü yumurtalık modelinde çoğaltılabilir ve kültür koşulları deneysel olarak modüle. Burada, biz, folikül gelişim düzenleyici mekanizmaları ve diğer yumurtalık olayları bu yöntemde yararlılığı göstermek.

Giriş

Dişi fare yumurtalık birkaç bin köklerinin1içeren ve düzenli yumurtlama her estrus döngüsü yaklaşık on yumurtalar olgunlaşır. Köklerinin çeşitli gelişim aşamalarında sınıflandırılır: ilkel, İlköğretim, ortaöğretim, antral ve her oosit çevreleyen granulosa hücresel tabaka şeklinde bağlı olarak Graafian köklerinin. En ilkel köklerinin uykuda ve biraz-in onları aktif hale gelir ve her estrus döngüsü2birincil foliküller içine büyümek. İkincil foliküler aşamadan sonra folikül gelişim gonadotropins tarafından uyarıcı hormon (FSH) ve luteinizan hormon (LH) foliküler esas olarak düzenlenir. Ancak, ilkel ve birincil folikül gelişim gonadotropin bağımsız ve bu aşamaların yöneten düzenleyici mekanizmaları kötü inderstood3,4,5kalır. Büyüme faktörleri ve hormonlar ek olarak, ilkel ve birincil folikül köklerinin6,7arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmiştir. Bu nedenle, biz folikül dinamiklerini analiz mouse ovarium dokularda gerçekleştirilen ve yumurtalık dokusu kültürler8,9,10kullanarak ilişkili düzenleyici mekanizmaları araştırıldı.

Burada, biz iki yumurtalık doku kültürü modeli yöntemleri tanıtmak. İlk foliküler alanlarda ölçüm tarafından folikül gelişim analiz etmek için kullanılır ve ikinci transgenik fareler ile ikincil folikül aşamasına gelen ilkel erken folikül gelişimi sırasında düzenleyici mekanizma incelemek için kullanılır. Çünkü onlar köklerinin kolay görselleştirme için izin folikül gelişim analiz için Biz esas olarak yumurtalık 4 - hafta eski dişi farelerin kullanılır. Periyodik yumurtlama ve modeli içinde vivo folikül gelişim ikna etmek için LH dalgalanma ve gözlenen yumurtlama, folikül atrezi ve doku kültürü koşullar altında estradiol salgılanmasını çoğaltılamaz. Kültürlü yumurtalık görüntüleri ele geçirildi ve folikül gelişim süreçleri izleme değişiklikleri foliküler alanında tarafından analiz edildi. Ancak, parlak alan Mikroskobu analizleri, ilkel ve erken birincil foliküller ayrımı belirsiz. Bu nedenle, biz küçük köklerinin algılayıp birincil, ilkel arasında ayırt etmek için bir yöntem geliştirdi ve ikincil folikül kültürlü yumurtalık dokuları kullanarak Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 ve 0 ile 4 gün sonra Doğum11, R26-H2B-mCherry transgenik fareler yumurtalık. Oog1 ifade mayoz girmesinden sonra yumurta algılanabilir ve folikül gelişimi, ilkel geçiş kültürlü yumurtalık dokusunun11 hızlandırılmış görüntüleri kullanarak birincil köklerinin gözlenmesi izin ile yavaş yavaş artar ,12. Morfolojik yöntemleri uyuyan ilkel köklerinin13,14,15,16etkinleştirmek faktörler eğitim için kullanılan, yumurtalık fizyolojik folikül gelişiminde olsa gözlemlemek, zor ve çeşitli faktörlerin etkilerini uncharacterized kalır. Mevcut kültür yöntemleri bu yetersizlik hedef faktörler gerçek zamanlı analizlerde yönelik olarak tasarlanmıştır.

Bu da çalışmanın, biz foliküler gelişim hızlandırılmış bir görüntüleme yöntemi kullanarak izleniyor ve folikül gelişim süreci ile karakterizedir. Roman yöntemlerimiz yumurtalıkların fizyolojisi soruşturma için benzeri görülmemiş bir aracı sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler 23 ±1 ° C 12 h ışık/12 s karanlık döngüsü ile çevre kontrollü bir odada muhafaza. Hayvan bakım protokolleri ve deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak Aichi Tıp Üniversitesi'nde hayvan deneme için yapılmıştır ve görevdeki hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlanması kültür orta ve yemekleri

  1. Temel kültür ortamı hazırlamak için fetal Sığır serum (FBS, % 5 v/v), FSH ekleyin (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) ve penisilin-streptomisin (penisilin, 100 U/mL; streptomisin, 100 mg/mL) asgari temel orta Alfa (MEM-alfa) ve mix 50 mL tüpler için.
    Not: Gerekli kültür ortamının toplam birimleri deneyler arasında değişir, ancak kültür orta 1 mL 3.5 cm cam-alt kültür yemekleri için genellikle yeterli oluyor.
  2. 1 mL aliquots karma kültür ortamının 3.5 cm cam-alt kültür yemekleri dökün ve yer 30 mm hücre kültür ekler yemekleri ayarlayın. Önceden sıcak ortam ve yemekleri bir kuluçka (%5 CO2 ve 37 ° C).

2. yumurtalık dokusu hazırlanması

  1. Önceden sıcak fosfat arabelleğe alınmış serum (PBS) (−) ve MEM-Alfa %5 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin bir kuluçka (%5 CO2 ve 37 ° C) içeren.
    Not: Yaklaşık 3 mL aliquots yumurtalık PBS (−) yumurtalık diseksiyonu sırasında kullanım için yeterli ve 1 mL aliquots MEM-Alfa 3.5 cm yemeklerinde tek yumurtalık geçici depolama için yeterlidir.
  2. Yumurtalık 4 - hafta eski kadın (-den sonra Kanser Araştırma Enstitüsü olarak adlandırılır) ICR fareler gelen tüketim ve makas ve stereoskopik mikroskop altında Cımbız kullanarak yumurtalık çevreleyen dokuların trim. Rezerv kültür orta kaldırılan yumurtalıklarda (bkz. Adım 2.1) kullanımı kadar.
    1. Filtre kağıdı üzerine tek yumurtalık nemlendirilmiş ile yer önceden ısınmış PBS (−) (bkz. Adım 2.1) ve 4 adet stereoskopik bir mikroskop altında microtome bıçak kullanma dilim.
      Not: 4 - hafta eski ICR fareler yumurtalık yaklaşık 2 mm çapında geçerlidir. Parça sayısı yumurtalık boyutuna bağlıdır; Ancak, yaklaşık 500 µm kalınlığında parçalar uygun folikül gözlemler için izin (500 mm daha kalın parçalar halinde doku şeffaflık azalır; 500 mm ince parçalar halinde birçok antral folikül kırık ve kaybetti).
    2. Diseksiyon sonra önceden ısıtılmış kültür orta (bkz. Adım 2.1) 3.5 cm yemeklerinde dilimlenmiş yumurtalık numuneler yerleştirin.

3. yumurtalık doku kültürü

  1. Yumurtalık dokusu yumurtalık dokusu nerede olacak hücre kültür Ekle dilimlenmiş kültür orta yaklaşık 0.5 µL damla bir micropipette kullanarak ayarlayın.
  2. Kültür orta Cımbız kullanarak hücre kültür ekler üzerinde bir damla her dilimlenmiş numune yerleştirin.
  3. 37 ° C'de % 5 CO2 yumurtalık dokularda kültür
  4. Kültür orta ile taze önceden ısıtılmış orta yerine 2 günde.
    Not: 4 - hafta eski ICR fareler bölümlerden yumurtalık kültür için orta değişiklikler için zamanlamayı Şekil 1' de sunulmuştur.
    1. LH dalgalanma çoğaltmak, kültürlü 4 - hafta eski ICR fareler yumurtalık 100 mU/mL FSH ve LH 12 h için her 4 gün (Şekil 1) içeren orta ile tedavi.

4. mikroskop görüntüleri kültürlü yumurtalık

  1. 1. ne zaman belgili tanımlık doku hücre kültür ekler yapıştırılır gün sonra kültürlü yumurtalık görüntüleme başlatın ve zaman puan arasında yeterli folikül büyüme sağlamak için 24 saat aralıklarla confocal veya ters mikroskop çözümlemesi.
    Not: Confocal mikroskobu köklerinin bütün kültürlü yumurtalık içinde gözlemlemek için ters mikroskobu üstündür.

5. kültürlü yumurtalık hızlandırılmış görüntüleme

  1. Hızlandırılmış görüntüleme koşulları, lazer yoğunluklarda ve görüntüleme sistemi (Tablo 1) için pozlama süreleri dahil olmak üzere en iyi duruma getirme.
    1. Eşleştirilmiş yumurtalık numuneler tek fare kullanımı için tedavi ve kontrol grupları olarak seçin. Lazer yoğunluklarda ve en iyi görüntü (Tablo 1) elde etmek için çekim hızı değişir.
    2. Folikül gelişim her kültür koşul altında folikülü alanları kontrol örnekleri 24 h aralıklarla görüntülerini ve hızlandırılmış görüntüleme örnekleri (bkz. Adım 6) ölçerek karşılaştırın. Aynı anda, her yumurtalık sette ovulated yumurta sayısını saymak ve uygun zaman hata görüntüleme koşulları seçin.
  2. Hızlandırılmış görüntüleme sistemi (Tablo 1) belirlenen koşullarda kullanarak 30 dk aralıklarla esir alma imge.

6. folikülü büyüme Analizi

  1. Folikül gelişim analiz etmek için ImageJ yazılım (http://resbweb.nih.gov/ij/) kullanarak çektiğiniz resimleri folikül alanlarında ölçmek.
    1. Başlangıçta, araç çubuğunda "Ölçeği Ayarla" altında "Analiz" tıklatarak görüntü ölçeğini ayarlayın. Yakaladığınız görüntüyü ve piksel karşılık gelen sayıların yan uzunlukları sırasıyla "Bilinen mesafe" ve "Uzaklığını piksel", boş alanlara girin.
    2. "Serbest el" araç çubuğunda tıklatın ve köklerinin yakalanan parlak alan görüntüler anahat.
    3. "Ölçü" altında "analiz" araç çubuğunda'i tıklatın.
      Not: diğer ölçüm verileri isterseniz, "ölçü"Analiz"altında araç çubuğunda ayarla"'ı tıklatın ve listeden uygun kutuları işaretleyin.

7. analiz transgenik fareler kullanarak folikül gelişimi

  1. Yumurtalık 0 ile 4 (P0 ve P4) içeren transgenik fareler transgenes Oog1pro3.9 ve R26-H2B-mCherrve kültür ekler üzerinde açıklandığı gibi adımlar 1.1-3.2 değil dışında Kadın Doğum sonrası gün dilim P0 ve P4 yumurtalık toplamak.
  2. Taze, önceden ısıtılmış orta 3.5 cm yemekleri içeren % 5 CO2 37 ° C'de 2 günde bir kuluçka kültür orta yerine.
    Not: LH dalgalanmaları P0 ve P4 farelerde meydana gelmez çünkü LH konsantrasyonu P0 ve P4 yumurtalık kültür orta sabit kalabilir.
  3. Sadece AcGFP1 pozitif birincil foliküller kültürlü P4 yumurtalık (Tablo 1) içinde görselleştirmek için mikroskop ayarlayın.
    Not: Sadece ilkel ve birincil foliküller P4 dişi fare yumurtalıklarda mevcuttur.
  4. Kültürlü P0 Oog1pro3.9çekim /R26-H2B-mCherry transgenik fareler yumurtalık 30 dk aralıklarla kullanarak (bkz. Adım 5.2) P4 yumurtalık için kullanılan ayarlar.
  5. İzleme ve folikül gelişim AcGFP1 ve H2B-mCHerry sinyallerini kullanarak çözümleyebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 yumurtalık doku kültürü sırasında medya iletişim kuralı için değişiklikleri gösterir. Aşağıdaki bu program, 4-hafta-yaşlı ICR fareler yumurtalık kültürlü ve confocal mikroskobu (Şekil 2) kullanarak 24-h aralıklarla görüntüsü. 3 hafta boyunca kültür yumurtalık dokuları sırasında en antral ve ikincil foliküller folikül atrezi tarafından dejenere ve bazı ovulated (Şekil 2D ve

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, fare yumurtalıklarda folikül gelişiminde eğitim için iki yeni yöntem geliştirdik. İlk yöntem kültür folikül gelişim analizleri tarafından takip dilimlenmiş yumurtalık yetişkin fareler dokuların içerir ve ikinci ön folikül gelişim gonadotropin bağımsız aşamasında görselleştirmek için hızlandırılmış Imaging kullanımını içerir. Daha önce biz lösemi inhibitör faktörü ve progesteron folikül gelişim8,9üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılan mev...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Dr. Naojiro Minami (Kyoto Üniversitesi) Oog1pro3.9 fareler verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma JSP'ler (KAKENHI # JP15H06275) ve Nitto Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan hipofizinden folikül uyarıcı hormonSIGMAF4021
At hipofizinden lütenleştirici hormonSIGMAL9773
Penisilin-streptomisin çözeltisiWako Saf Kimya Endüstrileri168-23191
MEM a, GlutaMax, nükleotid yokThermo Fisher32561037
Cam alt tabakMatTekP35G-0-10-C35 mm çanak, No. 0 lamel , 10 mm cam çapı
Millicell hücre kültürü ekiMerck MilliporePICM0RG50Çapı: 315 mm, gözenek boyutu: 0,4 mm, malzeme: hidrofilik PTTE
3,5 cm hücre kültürü kaplarıGreiner Bio-One627160
50ml / üçlü conta kapaklı santrifüj tüpüIWAKI2345-050
Düşük profilli tek kullanımlık bıçaklar 819Leica14035838925
LSM 710Carl ZeissKonfokal mikroskop
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric CorporationHızlandırılmış görüntüleme
BZ-X700KEYENCEHızlandırılmış görüntüleme

Kaynaklar

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Folik l Geli imiFolik l AtrezisiZaman Atlamal G r nt lemeImageJ AnaliziFSH LH TedavisiOver Kesit K lt rPrimordial Folik llermCherry Transgenik
Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.