Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
5-metilsitozin tarafından (5mC) aracılı epigenetik transkripsiyon yönetmelik ökaryotik gelişiminde önemli bir rol oynamıştır. Demethylation bu epigenetik izlerini timin-DNA glycosylase bağımlı baz eksizyon tamiri tarafından takip sıralı oksidasyon on-on translocation dioxygenases (TET1-3), tarafından sağlanır. TET2 gen genetik mutasyonlar nedeniyle veya diğer epigenetik mekanizmalar tarafından inactivation çeşitli kanserler, özellikle hematopoetik maligniteler olan hastalarda kötü prognoz ile ilişkilidir. Burada, enzimatik etkin etiketsiz insan TET2 dioxygenase ba * exchange Kromatografi kullanarak verimli tek adım arınma açıklayın. Biz daha fazla ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yaklaşım sağlar. Bu tahlil etkinlik vahşi türü ve mutant TET2 dioxygenases değerlendirmek için kullanılabilir.
Giriş
C5 sitozin üsleri KSY dinucleotides içinde (5mCpG) baskın metilasyonu sitedeki memeli genleri1konumudur. Buna ek olarak, son çalışmalar bir dizi sigara CpG siteler kapsamlı C5 sitozin metilasyonu (5mC) ortaya (5mCpH, nerede H = A, C veya T)2,3. 5mC değişiklik endojen retrotransposons ve gen Rehberleri3,4,5, transkripsiyon bir susturucu olarak hizmet vermektedir. DNA metilasyonu 5mC, aynı zamanda X kromozomu inactivation, gen sürecinden, nükleer yeniden programlama ve doku özel gen ifade
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. klonlama ve etiketsiz insan TET2 Dioxygenase arıtma
- İnsan TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) yukarıda açıklanan22siteye özgü rekombinasyon teknikle pDEST14 hedef vektör içine kopyalayın.
Not: Önceki çalışmalarda C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) etki alanı en az catalytically etkin etki alanı21,23olduğunu göstermiştir. PDONR221 vektör kullanarak etiketsiz TET2 dioxygenase etki alanı hızlı için Parlatıcı Dalgarno ve Kozak diziler PCR (Tablo 1) sırasında ileri astar dahil edilmiştir. - Etiketsiz insan TET2 (TET2 11....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TET-aile dioxygenases tarafından DNA ' 5mC dinamik modifikasyonu epigenetik transkripsiyon yönetmeliğinde önemli rol oynar. TET2 dioxygenase sık sık çeşitli hematopoetik maligniteler12' mutasyona uğramış. Normal geliştirme ve hastalık TET2 enzimi rolünü araştırmak için biz-klonlanmış herhangi bir benzeşme etiketi olmadan en az catalytically etkin etki alanı pDEST14 vektör22. Etiketsiz TET2 dioxygenase bakteriyel SDS SAYFALIK analizde toplam .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
TET2 gen mutasyonlar çeşitli hematopoetik maligniteler olan hastalarda en sık saptanan genetik değişiklikler vardır. Mutasyonların saçma, çerçeve-shift ve missense mutasyonlar içeren farklı TET2, bugüne kadar yüzlerce hastalar12tespit edilmiştir. TET2 mutasyonlar hastalarda kemik iliği wt-TET214olanlarla karşılaştırıldığında genomik 5hmC seviyesinin düşük gösterir. Mutant TET2 çakma deneyler Bu mutasyonlar 5hmC düzeyleri,14-transfec.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bildirmek için mali hiçbir ilgi alanlarına sahip.
Teşekkürler
Bu araştırma ABD Savunma Bakanlığı bir fikir Ödülü (W81XWH-13-1-0174), aplastik anemi ve MDS Vakfı Hibe şeklinde tarafından finanse edildi ve UMRB grant mm yazarlara teşekkür Mohit Jaiswal ve Subhradeep Bhar ilk TET2 pDEST14 vektörde klonlama için.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| HEPES | Karbosentez | FH31182 | |
| Demir(II) sülfat heptahidrat | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| &alfa;-Ketoglutarik asit (2-Oksoğutarik asit) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Askorbik asit | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Amonyum asetat | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Asetonitril | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC sınıfı su | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo temiz ve yoğunlaştırıcı | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nükleaz | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Buzağı bağırsak alkalin fosfataz) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Karbosynth | EI05931 | |
| MES [2- (N-Morfolino) etansülfonik asit monohidrat] | Karbosentez | FM37015 | |
| Sodyum klorür | Fisher Bilimsel | 7647-14-5 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sefaroz | Fisher Bilimsel | 45-002-934 | |
| 2'-Deoksi-5-metilsitidin | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoksi-5-hidroksimetilalsitidin | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoksisitidin-5-karboksilik asit, sodyum tuzu | Berry ve Amp; İştirakler | PY 7593 | |
| 5-Formil-2'-deoksisitidin | Berry & İştirakler | PY 7589 | |
| 2'-Deoksisitidin | Berry & İştirakler | PY 7216 | |
| 2'-Deoksiadenozin | Karbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoksiguanozin | Karbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoksitimidin | VWR Yaşam Bilimleri | 97061-764 | |
| Ağ Geçidi teknolojisi | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R santrifüj | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ve AUML; KTA FPLC sistemi | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry sistemi | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo arıtma kolonları | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 sütun | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap kütle spektrometresi | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC sütunu | Pharmacia (GE Sağlık) | 28988937 |
Kaynaklar
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
