Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Özet

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Özet

Gen düzenlemesi gelişiminde önemli bir rol oynar. Çok sayıda DNA ve RNA bağlayıcı proteinler onların hedef sıraları gen ekspresyonu denetlemek için yüksek özgüllük ile bağlayın. Bu düzenleyici proteinler gen ekspresyonu ya DNA (transkripsiyon) düzeyinde veya RNA (pre-mRNA'ın porno versiyonunu, Poliadenilasyon, mRNA taşıma, çürüme ve çeviri) düzeyini kontrol eder. Düzenleyici diziler tanımlaması sadece açık veya kapalı bir gen nasıl açık, ama hangi aşağı akım genler tarafından belirli bir düzenleyici protein Ayrıca düzenlenir anlamanıza yardımcı olur. Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Giriş

Gen düzenlemesi, biyolojide önemli bir rol oynar. Genlerin transkripsiyon, pre-mRNA'ın porno versiyonunu, 3' uç oluşumu, RNA verme, çeviri, mRNA yerelleştirme, çürüme, translasyonel modifikasyon/istikrar, vb her iki DNA ve RNA bağlayıcı proteinler gen anahtar rol oynarlar düzeyinde düzenlenmiş olması Yönetmelik. Moleküler Genetik analizlerle çok sayıda düzenleyici proteinler belirledik iken, yalnızca küçük bir alt kümesini ile karakterize tamamen hücresel işlevlerinin veya bağlama siteleri içinde vivoiçin. Filogenetik dizi analizi ve mutagenesis DNA veya RNA protein etkileşimleri niteleyen tamamlayıcı yaklaşımlar sunuyor.

RNA bağlanıcı proteinler cinsel farklılaşma da dahil olmak üzere gelişim süreçlerinde önemli. Drosophila protein seks-öldürücü (SXL) veya ana seks-anahtar protein yoktur erkek, ama şimdiki içinde dişi. Uridine zengini diziler veya pirimidin-yolları aşağı akım pre-mRNA hedefler (trafo, seks öldürücüve erkek özgü lethal2) somatik hücreler^{1,2'deki belirli splice sitelere bitişik tanır ,3,4}. Buna ek olarak, uridine zengini Poliadenilasyon artırıcı dizileri artırıcı, ilkel (e(r)) transkript^5,6bağlama yaparak geçiş Poliadenilasyon sitesi düzenler. SXL büyük olasılıkla olmak üzere kalan kadın germline ek hedefleri düzenleyen^{1,7,8,9,10,11,} tespit ^{12 , 13}.

Genellikle, bir bağlama sitesini karakterizasyonu mutagenesis, örneğin, silme veya değiştirme tek veya birden çok nükleotit tarafından içerir. Her mutant bağlama siteye göre yaban tipi RNA dizisinin sonra onun bağlama benzeşme belirlemek için bir dizi protein konsantrasyonları kullanılarak analiz (K_d veya denge ayrılma Sabit) protein ilgi; K_d protein konsantrasyonu % 50 RNA bağlama almak için gerekli olduğunu. Detaylı mutagenesis Bu emek yoğun işlem üretimi ve çok sayıda mutantlar analizini içerir — üç vahşi türü nükleotit bağlama sitedeki her pozisyon için. Böylece, daha basit ve ucuz doygunluk mutagenesis protein bağlayıcı sitelerin RNA için alternatif bir yaklaşım için bir ihtiyaç vardır.

Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Protokol

Not: Resim 1 phosphorothioate mutagenesis genel bir bakış sağlar ve işleminin temel adımları özetlemektedir.

1. nesil bir kütüphane mutantların — DNA şablon vahşi türü nükleotit ile Doping

1. T7 astar sentez (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından.
2. Katkılı oligonükleotid (iplikçik) protein bağlayıcı siteye karşılık gelen bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından sentez. Phosphoramidites uygun bir karışımı olarak vahşi türü nükleotit (bkz: Bu oran daha fazla ayrıntı için temsilcisi sonuçları) doping (X aşağıdaki) her site vahşi tipi nükleotid olarak % 90'a ve T % 10 oranında için kimyasal sentez sırasında kullanın.
   Not: Katkılı oligonükleotid dizisi 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 burada '. Altı çizili sıra SXL protein bağlayıcı sitesi, artı faydalı kontroller RNA her değişiklik için yükleme kontrolleri olmasının yanı sıra bağlayıcı etkiler onaylayan sağlamak ek nükleotit bağlama sitesi dışında ters tamamlayıcıdır Karşılaştırma ve normalleştirme nükleotit bağlama site içinde. SXL-bağlama sitesi sıra trafo pre-mRNA^14,15,16,17' mevcut olan UUUUUGUUGUUUUUUUU, önerilen metodoloji hazırlamak için kullanıldı. İtalik sırayla T7 astar dizisine tamamlayıcı ve vitro transkripsiyon T7 organizatörü.

2. RNA sentezi

1. Yukarıda açıklanan¹⁸olarak 20 µL transkripsiyon tepki RNA sentez.
   1. Mix T7 transkripsiyon tampon ve 1 µM T7 oligonükleotid, 1 µM katkılı oligonükleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP ve UTP (guanozin, adenozin, sitidin ve üridin trifosfat) ve 2 U/µL T7 RNA polimeraz.
   2. Ekleme, iki ayrı microcentrifuge tüplerde 0,167 mM α-thio ATP veya 0.05 mM α-thio UTP (bkz: Şekil 2' deki şemaları) phosphorothioates RNA'ların dahil etmek.
      Not: alternatif iletişim kuralları için 0.2 mM α-thio CTP veya 0.2 mM α-thio GTP nükleotit oyuncu değişikliği kalan iki test etmek için bir katkılı oligonükleotid içeren uygun transkripsiyon reaksiyon ekleyin.
   3. RNA sentezi tepki karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
2. 2.5 µL ısı değişken alkalen fosfataz ve 2.5 µL 10xphosphatase tampon RNA örnek ekleyin. Bu 25 µL reaksiyon 10 – 30 dk 37 ° C'de 5' fosfatlar kaldırmak için kuluçkaya.
3. Alkalen fosfataz enzim Isıtma için 2-5 dk 80 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
4. 5' ucuna dephosphorylated RNA'ın radiolabel (5 pmole) 1 µL T4 polinükleotit kinaz ve 1 µL γ -³²P ATP 10 µL tepki birimindeki kullanarak. Reaksiyon karıştırmak için 30-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya
5. T4 polinükleotit kinaz enzim Isıtma için 20-30 dk 65 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
6. Jel Elektroforez % 10 polyacrylamide jel denaturing tarafından RNA arındırmak. RNA üzerinde jel autoradiography tarafından bulun. Radiolabeled RNA içeren jel dilim tüketim, pipet ucu ile duvarlara basarak microcentrifuge tüpte ezmek ve İndinavir K (PK) arabellek (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat) emmek. Gece için 2 h oda sıcaklığında tüp döndürün.
7. Jel Bulamaç santrifüj kapasitesi, jel atmak ve arabellek çözüm toplamak.
8. Fenol kloroform eşit hacmi ile iki kez ve bir kez kloroform ile çözüm ayıklamak ve sulu faz toplamak.
9. Sodyum asetat, pH 5.2, taşıyıcı 3 M sulu faz 0.1 birim eklemek tRNA veya glikojen ve etanol 2.5 hacmi. Örnek 1 h için-80 ° C'de tutun.
10. Örnek için bir yüksek hızlı microcentrifuge 16,873 x g, 5-10 dk santrifüj kapasitesi. Arabellek/etanol çözüm RNA Pelet bozmadan dikkatli bir şekilde çıkarın.
11. Pelet % 70 etanol ile yıkama ve 2-5 dk. Kaldır etanol için dikkatle santrifüj kapasitesi. Pelet hava kuru.
12. Pelet 20 – 50 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) resuspend-tedavi su. -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
    Not: radyoaktivite korumak için uygun önlemleri ve Pleksiglas kalkan kullanarak radiolabeled RNA ile tüm adımları gerçekleştirin. Halen, spin sütunları jel arıtma RNA'ın alternatif olarak adi radyoaktivite, daha yaygın olarak kullanılan ve kaldırmak daha kolay olur.

3. protein bağlayıcı tepki ve bağımlı RNA ayrılması

1. Rekombinant protein hızlı ve E. coliarındırmak.
2. Rekombinant protein konsantrasyonu spectrophotometry veya bir SDS-polyacrylamide jel bir bilinen protein standart, Sığır serum albumin (BSA) yanındaki ayıran tahmin ediyoruz. Faiz ve standart BSA proteini jel Coomassie parlak mavi R-250 ile boyama tarafından görselleştirin. İle karşılaştırıldığında BSA dilutions aynı jel üzerinde bilinen miktarda protein quantitate.
   Not: 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 0.05, - 80 ° C kadar kullanım ve 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) seyreltik piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), Rekombinant protein depolamak NP-40, % 20 gliserol. Kullanım 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü phenylmethane Sülfanil florür (PMSF) isteğe bağlı.
3. RNA-bağlama tepki (20-100 µL) 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 olarak gerçekleştirmek, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 birim/µL RNase inhibitörü, 0.09 µg/µL acetylated Sığır serum albümin, 1 mM EDTA, 0.15 µg/µL tRNA, 5'-son radiolabeled RNA ve uygun konsantrasyon (bir 6 µL konsantrasyon RNA'ın % ~ 50 protein bağlar) protein.
   Not: Bu bağlayıcı arabelleğe üç RNA – proteinler için çalışır (SXL, U2AF⁶⁵ve PTB), faiz bir protein için standart olacak ama. Protein konsantrasyonu ampirik olarak, yaklaşık 50 %'si almak için gereken bir verilen protein hazırlık için çeşitli dilutions kullanarak tahmin RNA bağlama. Bu koşul veya K_d RNA-bağlama eğrisi en hassas bölümünü temsil eder.
4. 20-30 dk 25 ° c (veya buz) protein bağlayıcı tepki kuluçkaya.
5. Protein bağımlı RNA kesir iki yaklaşımdan birini kullanarak ilişkisiz kesir ayırmak:
   1. Nitroselüloz filtre bağlama
      1. Bağlama reaksiyon (20-100 µL) Oda sıcaklığında bir vakum manifold bağlı nitroselüloz filtre uygula.
         Not: Sadece RNA-protein kompleksi üzerinde filtre korunur ve RNA akar filtreden ilişkisiz. Filtre bağlama yaklaşım bağımlı RNA'ın yüksek kurtarma sağlar ve jel hareketlilik üst karakter tahlil için daha hızlı ve daha basit, karşılaştırılır. DEAE membran altında nitroselüloz filtre yerleştirerek ilişkisiz RNA kesir toplamak veya ilişkili kesir ile karşılaştırma için RNA ücretsiz mümkündür.
      2. Tutulan içeren nitroselüloz filtre bölümünü kesip radyoaktif RNA küçük parçalara microcentrifuge tüp içine sığacak şekilde filtre parçaları sokmak için yeterli PK arabellekte (300-500 µL içeren 10-20 µg PK) emmek ve RNA filtresinden elute 2-3 saat veya gece boyunca için.
      3. Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, yıkama, Kuru ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.
   2. Jel hareketlilik üst karakter
      1. Hazırlamak ve % 5 yerli polyacrylamide jel polimerize (60:1 Acrylamide:bis-akrilamid) 0.5 içinde filtre bağlama yöntemi alternatif olarak bağlama tepki başlamadan önce x TBE (Standart Tris-bor-EDTA arabellek).
      2. 15dk için jel 250 V (4 ° C) soğuk bir odada önceden çalıştırın.
      3. Her bağlama reaksiyon (üstte) Yukarıdaki ön çalışma jel ayrı kuyu yükleyin.
         Not: Örnek yükleme kuyu içine için yeterli gliserol protein depolama arabellek sağlar.
      4. Jel Elektroforez belirli protein ve RNA boyutu bağlı olarak 1-2 h için 250 V soğuk bir odada tarafından protein bağımlı RNA ayırın.
      5. Autoradiography tarafından RNA-protein kompleksi jel üzerinde konumunu bulun. RNA-protein kompleksi içeren jel dilim tüketim. Jel dilim kırma ve PK arabellekte nemlendirici jel dilim üzerinden RNA elute.
      6. Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, hava kuru, yıkama ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.

4. analiz Mutant nükleotit pozisyonlar algılanması için iyot i ciddi Phosphorothioate ürünlerin

1. 1 mM iyot bir 20 µL DEPC tedavi su ilâ 10 µg taşıyıcı içeren eklemek tRNA phosphorothioate birleşme yerlerinde (ilişkili ve toplam RNA'ların) RNA'ların ayırmak için. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   Not: Daha fazla iyot bölünme biraz farklı koşulları ile ilgili ayrıntılar — %7 (v/v) iodoethanol, 95 ° c 3 dk Isıtma — Gish & Eckstein 1988¹⁹' bulunabilir.
2. İ ciddi RNA sodyum asetat/etanol, ekleyerek yukarıda açıklandığı gibi çökelti. Jelleri denaturing için bir yükleme boya resuspend. Isı ve örnek tarafından % 15-20 denaturing polyacrylamide jel elektroforez RNA parçaları ayırmak için yük.
3. Polyacrylamide jel bir röntgen filmi için maruz.
4. Grup autoradiography kullanma toplam havuz ile ilişkili kesir tespit edebilir.
   Not: bir yormak kukuleta iyot ile tüm adımları gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA ayrılması için bir kama şeklindeki jel, istihdam hangi tarafından iki katına her iki çubukları alt jel plakaların kalınlığı jel alt kısmında bir ekstra inç uzunluğundaki spacer ekleyerek elde edilir. Bu şekli daha kısa RNA parçaları arasında daha fazla tek tip veya daha yakın aralığını sağlar. Alternatif olarak, bir phosphorimager algılama ve radyoaktivite Nefelometri için röntgen filmleri yerine kullanılabilir.

Sonuçlar

Doping kullanarak doygunluk mutagenesis prensibi:

Eğer sadece analiz edilecek bir konumdur bir uygun molar oranı vahşi-türü ve diğer nükleotit için tüm dört nükleotit eşit bir karışımı kullanın. Ancak, aynı anda birden fazla pozisyonları incelenir, oranı, non-vahşi türü yaban tipi nükleotit için ayarlanması gerekir, azaltılmış yani . Aksi takdirde, hangi isteniyorsa, tek oyuncu değişikliği ek olarak, ayrıca olacak şablonla...

Tartışma

Mutagenesis uzun protein bağlayıcı siteleri niteleyen kullanılmaya başlanmıştır. İlk olarak, mutantlar bir dizi inşa ve deneyleri benzeşme bağlama üzerinde onların etkilerini incelemek için bağlama içinde tek tek test. Ise standart mutagenesis yaklaşım çeşitli serileri analiz etmek için bir yol sağlar, birden çok adımı mutantlar oluşturmak ve tepkiler her mutant için bağlayıcı bir dizi performans gibi standart yaklaşım, dahil, zahmetli ve zaman alıcı ve olmayabilir özellikle uzun serileri için Doygunluk mutagenesis izin ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Üridin 5' a-tiyotrifosfat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenozin 5' a-tiyotrifosfat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Vakum manifoldu	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  25&nbşk; mm Cam Mikroanaliz Vakum Filtresi
Vakum manifoldu	Millipore	XX2702552	1225 Örnekleme Vakum Manifoldu
Nitroselüloz	Millipore	HAWP
Nitroselüloz	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Fosforliyasyon Kiti	NEB	M0508
T4 Polinükleotid Kinaz	NEB	M0201S
Proteinaz K	NEB	P8107S
T7 RNA polimeraz	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNaz inhibitörü
Cam Plakalar	Standart	Standart
Jel Elektroforez ekipmanı	Standart	Standart X-ışını
filmleri	Standart	Standart Poliakrilamid
jel çözümleri	Standart	Standart