Method Article

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

DOI:

10.3791/57819

⸱

June 29th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yineleme kümesi yöntemi kantitatif ömrü veya Caenorhabditis elegans nematodlar yaşama böylece ekran üzerinde aynı miktarda daha fazla tedaviler veya koşullar için tek bir dedektif sağlayan bir yüksek-den geçerek şekilde ölçmek için bir yaklaşımdır zaman veri kalite kaybı olmadan. Yöntem ortak ekipman C. elegans ile çalışan çoğu laboratuarlarında bulundu gerektirir ve böylece benimsemeye basittir. Yaklaşım, her bir gözlem noktada bir nüfusun bağımsız örnekleri yerine tek bir örnek zaman içinde geleneksel boyuna yöntemleriyle raporlaması merkezleri. Çok iyi bir tabak wells için sıvı ekleyerek gerektirdiği Puanlama, hangi taşımak için C. elegans uyarır ve sayısal healthspan değişimler kolaylaştırır. Yineleme kümesi yöntemi diğer önemli faydaları azaltılmış teshir edilmesi hava kirleticileri (Örneğin kalıp veya mantar), agar yüzeylere dahil en az hayvan ve sağlamlık sporadik (hala olduğunda bir hayvan ölü arama gibi yanlış Puanlama için işleme hayatta). Uygun şekilde çözümlemek ve bir yineleme kümesi stili deney verileri görselleştirmek için özel yazılım aracı da geliştirilmiştir. Geçerli yazılım yineleme kümesi için her iki yineleme kümesi ve geleneksel (Kaplan-Meier) deneyler yanı sıra için istatistiksel analiz hayatta kalma eğrileri komplo becerisi. Burada sağlanan protokoller karşılık gelen veri analizi genel bakış yanı sıra geleneksel deneysel yaklaşım ve yineleme kümesi yöntemi açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yaşlanma genetik temeli anlama doğru en dönüştürücü teknolojik gelişmeler besleme tabanlı RNAi C. elegans1belirlendi; RNAi deneysel kullanılmadan önce birçok fenotipleri yaşlanma genetik olarak uysal değildi. Besleme tabanlı RNAi dsRNA E. coli eşleşen içinde üretim ile elde bir endojen C. elegans mRNA: IPTG ya C. elegans cDNA bir ekleme veya bir kısmı arasında çift yönlü transkripsiyon indükler bir Açık okuma çerçevesi içinde bir plazmid2. C. elegans üzerine sağlam beslerken bakteriler tarafından üretilen E. coli, dsRNA SID-2 transmembran protein3üzerinden bağırsak hücreleri içine lümen taşınan ve hayvan SID-14üzerinden kalan dağıtılmış. Her hücre içinde eksojen dsRNA karmaşık Dicer tarafından siRNA, hangi yeni bir oluşturmak için tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla bir olgun mRNA ile etkileşim işlenir siRNA-mRNA dubleks. Bu çift yönlü RISC kompleksi tarafından tanınan ve böylece i ciddi endojen mRNA5aşağılayıcı. Böylece, sadece plazmid Ekle değiştirilirse tarafından bir C. elegans genom içinde neredeyse herhangi bir gen işlevini devre dışı. Kütüphaneler-koleksiyonları kapsamında yaklaşık %86 ulaşmak için bir araya getirilebilen E. coli stokları dönüştürülmüş birkaç büyük besleme tabanlı RNAi yol açtı bu keşif C. elegans genler6, bilinen 7.

Besleme tabanlı RNAi ilerlemesi beri biz bakın (WormBase içinde küratörlüğünü RNAi fenotip dernekler tarafından kanıtlanan) inaktive zaman ömrü alter 900'den fazla gen keşfi için kapsamlı filtrelerinde de C. elegans açmıştır için gerogenes olarak. Bir rol gerogenes uzun ömürlü denetimindeki çoğunluğu için besleme tabanlı RNAi sadece birkaç seminal raporları ile keşfedilmiştir ( Şekil 1A ve ek dosya 1 Ayrıntılar için bakınız). Bazı durumlarda, bu gerogenes ömrü içinde değişimin ölçülebilir bir ölçü RNAi tedavi ile sağlamak için başarısız canlılığı tek bir veya birkaç zaman puan, ölçme üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Diğer durumlarda, bu genlerin kantitatif değişikliklerin ömrü yanı sıra ek yaş ilişkili fenotipleri değerlendirildi. Örneğin, daha önce azalmış insülin/IGF-1 sinyal ile hayvanların normal ve artan ömrü için gerekliydi ve healthspan değişiklikleri sayılabilir 159 genlerin tanımlanmış. Bir veya daha fazla erken yaşlanma8ayetlerine neden olarak bu progeric bir fenotip içinde 103 gen inactivations kaynaklanır.

Bazı gerogenes 100 veya daha fazla çalışmaları ile (Örneğin daf-16, daf-2, efendim-2.1) ilişkili olan, 400'den fazla gerogenes 10 veya daha az alıntılar (Şekil 1Bve ek dosya 2) vardır. Kapsamlı besleme tabanlı RNAi ekranların vardır keşfetti ve cursorily sözde gerogenes yüzlerce ile karakterize, böylece, nasıl uzun ömürlü denetimindeki Bu genler işlevi ve bu gen ürünleri arasında genetik karşılıklı ilişkileri kötü kalır okudu. Tam boyuna analiz için yaş ilişkili fenotipleri gerogenes (Örneğin epistatic etkileşimleri, asynthetic etkileşimleri, vb) arasındaki genetik etkileşimler tanımlamak için bir önkoşuldur. Gerogenes arasında genetik karşılıklı ilişkileri daha derin bir anlayış kazanıyor Ayrıca besleme tabanlı RNAi avantajları güçlendirir bir yüksek-den geçerek nicel yöntemi gerektirir.

En yaygın vekil yaşlanma ömrü ölçüsüdür. C. elegans mortalite ölçmek için geleneksel yaklaşım bireysel hayvan ölümleri küçük grup örneğinin içinde zamanla izler. Hayvanlar nispeten az sayıda zaman içinde takip edilmektedir ve düzenli aralıklarla yavaşça bir platin tel veya kirpik, canlılık (Şekil 2A) bir göstergesi olarak hareketi ile prodded. Ortalama ve maksimum ömrü basit, doğrudan ölçümleri sağladığından bu yöntemi yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu geleneksel hangi hayvanlar ve aynı anda denetimli bir biçimde ölçülebilir koşulları sayısını sınırlar zaman alıcı ve nispeten düşük verimlilik, bir yöntemdir. Son bir simülasyon çalışması birçok C. elegans ömrü çalışmalar hayvanlar güvenilir koşullar9arasında küçük değişiklikler tespit edebilmek için yeterince büyük bir dizi tahlil değil bulundu. Ayrıca, bu geleneksel Yöntem art arda hayvanların aynı kohort hangi sırayla kirlenme, tanıtmak ve zarar verebilir veya giderek kırılgan, yaşlı hayvan öldürmek zaman içinde işleme içerir.

C. elegans ömrü ölçmek için bir alternatif "kopya kümesi" yöntem geliştirdik. Bu amaçla, Yaş senkronize, isogenic hayvanların büyük bir nüfus küçük nüfus (veya yinelemeler) bir dizi halinde ayrılır. Yeterli yineleme örnekleri her zaman noktası planlı deneyinde kapsayacak şekilde oluşturulur. Her gözlem zamanda noktada yinelemelerden herhangi birini yaşayan ölü sayısı için attı ve sansürlü hayvanlar, sonra hayvanlar bu çoğaltma içinde atılır. Böylece, beklenen yaşam süresi bir bütün olarak bir dizi bağımsız altgrupları nüfusunun çoğu düzenli olarak bitti (Şekil 2B) örneklenmiş. Çoğaltma kümeleri kullanarak işte hiçbir yinelenen dürtmeye hayvan ve potansiyel çevresel kirlenme yok tekrarlanan maruz kalma. Tek seferlik noktada gözlenen canlılık işleme en aza indirir ve en az bir büyüklük tarafından üretilen iş artırır her diğer gözlem, tamamen bağımsızdır. Bu bize RNAi yüzlerce aynı anda8,10klonlar için değişiklikleri ömrü içinde quantitate izin verdi.

C. elegans ömrü yineleme kümesi ve C. elegans uzun ömürlü Puanlama için geleneksel yöntemler üzerinden yürütmek için detaylı protokolleri mevcut burada. Benzer sonuçlar yöntemleri arasında elde edilen göstermektedir. Biz özgürce bir GPL V3 lisansı (bkz: tablo malzemelerin) sağlamak ya da bir yaklaşımla oluşturulan ömrü verilerin grafik çözümlemesini yardımcı olmak üzere geliştirilen yazılım var. "WormLife" R11' de yazılan ve Mac OS ve Linux test verileri çizmek için bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içerir. Son olarak, biz karşılaştırmak ve her yöntemi sınırlamaları kontrast ve C. elegans ömrü içinde nicel değişiklikleri ölçmek için yaklaşımlar arasında seçim yaparken dikkat edilmesi gereken diğer noktalar vurgulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. geleneksel yöntem Puanlama C. elegans uzun ömür için

  1. Reaktifler hazırlanması
    1. Genler besleme tabanlı RNAi yolu ile inaktive tanımlayın. RNAi klon ilgi içeren HT115 E. coli2 dönüştürülmüş hisse senetleri satın almak. Alternatif olarak, faiz gen cDNA L4440 plazmid multicloning siteye subclone.
      Not: HT115 dsRNA bakteri içinde bozulma önlemek için kullanılan IPTG-indüklenebilir T7 polimeraz aktivite ile bir RNase III-eksik E. coli yük olduğunu. Besleme tabanlı RNAi kullanmayın ömrü çalışmalar için ya HT115 ya da standart NGM plakaları OP50 E. coli -ebilmek var olmak kullanılmış.
    2. 3 – 6 (veya daha fazla) 6 cm RNAi plakaları sınama koşulu (ek dosya 3 tarifi için) başına hazırlayın. Birkaç ay için bakteri ile tohum önce RNAi plakaları 4 ° C'de depolayın.
    3. Dönüştürülmüş E. coli gecede (16 – 20 h, 37 ° C 180-220 devir / dakikada kuluçka sallayarak) büyümek.
      Not: HT115 E. coli ampisilin (50 mg/mL) ile LB içinde büyüdü. Standart OP50 E. coli antibiyotik dirençli değildir ve Obama büyüyor. Kültür birim bağlıdır tabak #'ta, ama genellikle LB, deneysel tasarımına bağlı olarak 8 ve 100 mL arasında.
      1. Bakteriler tarafından Santrifüjü 3000 x g için 15-20 dk benchtop santrifüj, konsantre ol. Süpernatant Aspire edin ve pelet 1'de yeniden askıya alma/10 başlangıç ses (yani 10 x) LB ampisilin HT115 için (veya ampisilin için standart OP50 olmadan) ile içinde.
      2. Aliquot 200 µL 10 x bakteri her 6 cm tabak için konsantre. 3-4 çoğaltır sınama koşulu ile kirlenme durumunda kullanılmak üzere 2 ekstra yedek tabak başı hazırlayın. Tahlil Puanlama deneyci bir renk kodu ya da benzer kodlama düzeni kullanarak deneysel koşullar için kör bu yüzden plakaları hazırlanırken, onları etiket. Kod kaydedildiğinden emin.
      3. Laminar akış tezgah gibi temiz bir ortamda tüm sıvı absorbe olmuştur kadar kuru veya kapalı plakaları bankta gecede kuru izin vermek açık plakaları izin. Tabak aşırı kurutma olmadan agar kuru olduğundan emin olmak için kurutma ederken izlemek.
        Not: tabakları aşırı kurutma agar agar yuva C. elegans neden olur çatlama yol açar. Islak agar yüzeyler de tavşan çukuru tanıtmak.
    4. Kurutulmuş plakaları indüksiyon dsRNA üretim izin vermek için oda sıcaklığında gecede (en fazla 24 s) bir solucan kutusundaki depolar. RT, 1 gün sonra plakaları 4 ° C'de 2 haftaya kadar (tabak kurumasını önlemek için) kapalı zip kilit çanta saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında yoğunlaşma üzerinden hava mantar kirleticileri tanıtımı önlemek için zip kilit torba içinde plakaları dönün.
  2. C. elegans eşitlenmesi hipoklorit tedavi ile
    Not: Ek dosya 3 M9 ve hipoklorit çözüm yemek tarifleri için bkz.
    1. Gravid Yetişkin hayvanlar M9 ile toplamak. Takılı Cam Pipet 2 x 15 mL tüpler için taşımak için kullanın.
    2. Tüpler için 30"~ 2.000 devirde spin. Nematodlar tüpün dibinde, bir havuz olup olmadığını denetleyin. Süpernatant Aspire edin. İki kez spin ve aspirasyon yinelenen M9 çözüm ile yıkayın.
    3. C. elegans 4 mL M9 yeniden askıya alma. 2 mL hipoklorit çözeltisi ekleyin. Girdap periyodik dinç sallayarak ile ~ 3 dakika, hemen. 3 dakika sonra yumurta diseksiyon mikroskop altında bir bulut bakın. Eğer yumurta 3 dk sonra serbest bırakılmamıştır girdap ilave 10-20 s.
      Not: hipoklorit tedavi zamanlama önemlidir. Ne tedavi hayatta gravid yetişkin içinde yumurtalar. ~ 3 dakika sonra gravid yetişkin açık break ve yumurta dışarı dökülme. Ancak, Eğer yumurta hipoklorit çözümde uzun yayımlanmasından sonra onlar ölecek. Gravid yetişkin hipoklorit çözümde yeterince uzun bırakılmış değil, tersine, yumurta yok çıkacak.
    4. Hızlı bir şekilde iki kez olduğu gibi adım 2.1.2 M9 çözüm ile yıkayın.
    5. C. elegans yumurta Pelet 3 mL M9 ve yeni bir 15 mL tüp transferi yeniden askıya alma. Gecede M9 çözüm döndürme 20 ° C'de 3 mL içinde yumurtadan embriyo izin
    6. L1 çözüm 3 10 µL bırakarak µL L1 hayvanlar (veya embriyo) yoğunluğunu hesaplamak x 6 cm tabak ve sayısı L1s/µL ortalama sayısını hesaplamak için L1 hayvan sayısı.
      Not: L1 hayvanlar zamanla razı olacak. Bu nedenle, L1 çözümleri düzenli olarak karışık.
    7. Plaka başına tohum 50 L1 hayvanlar. Tabak ters çevir ve bir lastik bant ile mühür. Plakalar Plastik solucan kutuya koyun. Bir büyük zip kilit çanta kutusunda kapatın. 20 ° C kuluçka taşıyın.
  3. Buna ek olarak 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) tarafından Döl üretim önleme
    1. 20 ° C'de L4 sahne kadar hayvan büyümek Hayvanlar için L4 geliştirdik senkronize olup olmadığını görmek için kontrol (adım 2.1.7) tohum sonra yaklaşık 40 h.
      Not:12 ve büyüme oranları mutant hayvanlar için oranları değil karakterize ampirik olarak test edilmesi gereken farklı sıcaklıklardaC. elegans gelişim süresi değişir.
      1. 50 160 µL eklemek için her 6 cm tabak L4 hayvanlarla x FUdR.
        Not: FUdR L4 aşamada eklemek için önemlidir. Kolaylık sağlamak için FUdR 1000 x stokları 1 g FUdR 10 mL içine çözülerek 0.2 µm filtre ve bir 10 cc şırınga ile ultrasaf H2O. filtre sterilize etmek stok FUdR olun. Aliquot ~ 1 mL steril 1,5 mL tüpler içine stokunun. Donma ve -20 ° C'de depolayın
    2. Kaplamalar, Erkek varlığı için kontrol C. elegans. Tüm erkekler kaldırın.
      Not: ömrü genellikle ölçülen Hünsa ve değil erkekler için. Dostum Hünsa eşleşmemiş hayvanlar, FUdR13varlığında bile daha kısa yaşamak. Erkekler daha küçük ve daha ince sonra Hünsa ve kolayca ayırt edici çengel kuyruk14tarafından tespit edilebilir.
    3. Kutusu zip kilit torba içine koy. 20 ° C kuluçka için dönmek.
  4. Puanlama canlılık
    1. Canlılığı günlük hayvan bir platin tel ya da kirpik ile kafasına hafifçe dokunarak puan. Ölü taşımak ve plaka (Şekil 2A) kaldırmak için başarısız hayvanlar puan. Her koşul için her gözlem süresi noktası için gözlenen kaydedin.
      Not: önyargı Puanlama riskini azaltmak için deneyci için deneysel koşullar kör kalması ve benzer sonuçlar önceki zaman puan Puanlama sırasında başvuru gerekir değil.
    2. Rüptürü, sansür hayvanlar ölmek diğer açık geliştirme kusurları, ya da gezinme kadar yan çanak: Bu hayvanlar ve kayıt numarası her zaman gözlenen işaret dikkate istatistiksel analiz için Kaldır. Ayrıca, erkekler varsa, bunları kaldırmak ve gözlenen kaydedin.
    3. Hiçbir hayvan hayatta kalmak kadar 1.4.1 her gün tekrarlayın.
      Not: E. coli çim önemli ölçüde azaltmak veya mantar plaka büyüdükçe, tüm kalan hayvanların uygun RNAi ve FUdR ile taze bir tabak transfer başlar.
  5. Veri Analizi - çizme ve istatistik
    1. Giriş veya parametrik olmayan Kaplan-Meier Tahmincisi15 ve günlük sırası ile sağkalım Analizi destekleyen yazılımı açık kaydedilen gözlem verileri16 (bkz: ek dosya 3) sınayın. Sansürlü hayvanlar eklediğinizden emin olun. Gözlendi, erkek varsa eklemeyin.
      Not: veri biçimleri yazılım arasında değişebilir, ama ayrı bir satıra gözlenen her bireysel hayvan kaydetmek için sık kullanılan bir biçimdir. Hangi olarak ölü bir hayvan gözlendi deneysel timepoint "olay" zamanı geldi. Sansür ise "etkinlik" hangi hayvan sansür timepoint. Bir alan veya sansürlü gözlemler belirtmek için onay kutusu genellikle yoktur.
    2. Kaplan-Meier hayatta kalma eğriler çizmek. Okunabilirliği artırmak için çok sayıda koşul denetlesinler Eğer tek bir arsa için altıdan koşullar'ı seçin.
      1. Görsel olarak belirgin - kayıp gözlemler, beklenmeyen kontrol sonuçları, vb veri sorunlarını denetleyin — ve istatistiksel analiz daha önce adres.
    3. İkili yapmak için yazılımınızda günlük-rank testi işlevini kullanın istatistiksel karşılaştırmalar. Sansürlü sonuçları tedavisinde kullanılabilir herhangi bir seçeneği sağ sansür veri için uygun şekilde ayarlandığından emin olun.

2. kopya Set yöntemi Puanlama C. elegans uzun ömür için

Not: geleneksel Yöntem 3 – 6 plakaları koşul başına gerekirken (1.1.2 bkz. yukarıda), yineleme kümesi yöntemi (bkz. Adım 2.2.2 aşağıda) daha birçok gerektirir. Geleneksel yöntemi bir deney (Şekil 2A) boyunca aynı tabakta hayvanlar izler. Buna ek olarak, yineleme kümesi ile hayvanlar sadece bir kez attı: böylece bir çoğaltma, her zaman bir noktada (deneme sürümü) başına attı birçok aynı çoğaltır deney başında ayarlanır (Şekil 2B).

  1. Kitaplık kurulumu.
    Not: RNAi klonlar teslim tarihinde ek ayrıntı burada, aynı anda birçok RNAi klonları, Puanlama için mükellef protokoldür yineleme kümesi olarak ele ve bir anda 100'den fazla klonlar için ölçeklendirilebilir. Koleksiyonları RNAi klonların bir 96-şey biçimi tabak içinde tutulan gliserol hisse senetleri olarak korunur. Yineleme kümesi deneyler 24-şey tabak kullanın. Her şey RNAi klonlar, farklı kimyasal tedaviler, hayvan suşları ve benzeri koleksiyonuna karşılık bir farklı test durumu var.
    1. Öyle ki aşağıdaki koşullarda sublibrary koleksiyonları RNAi klonların yerleşimini montajı:
      1. 96-şey koleksiyon içinde bir boş vektör negatif kontrol iyi A1 olduğundan emin olun.
      2. Rastgele her 24 kuyu içinde bir ek boş vektör denetimi Ekle.
      3. Öyle ki her 24-şey plaka teker rastgele negatif kontrol (Şekil 2C) ekledi 96-şey plaka 24 wells, bloklar halinde bölün.
      4. 24-Wells (Şekil 2C) her gruptaki rasgele pozitif bir denetim ekleyin.
        Not: Pozitif kontrol deneysel soruda bağlıdır. Bu artış ömrü klonlar RNAi topluluğu seyir, örneğin, daf-2(RNAi) sık sık dahil edilir. Diğer taraftan, kısaltılmış ömrü ararken, daf-16(RNAi) sık sık kullanılır.
  2. Çoğaltma kümeleri hazırlanması
    Not: gerekli çoğaltır sayısı zaman puan (Şekil 2B) en az sayıya eşittir. Bir sonsal frekans (en az 20 çoğaltma kümesi için hazırlanıyor her diğer gün Puanlama ile 40 gün çalışan bir yineleme kümesi deneme gerektirirÖrneğin Puanlama yanı sıra, deneme başlamadan önce ömrü ölçmek için ne kadar bilmek gerekir her koşul denemenin başında). ~ 5 (2.2.2 ve 2.2.2.3 aşağıya bakınız) ilave yedek ayarlar yapmak için tavsiye edilir.
    1. RNAi sublibrary taze bir damga oluşturmak için bir 96-pin plaka Çoğalıcı tarafından aşağıdaki adımları kullanarak iyi bir 96-iyi biçimde (600 µL plakaları) başına 200 µL LB + Amp aşılamak:
      1. 96 PIN plaka Çoğalıcı sırayla % 50 çamaşır suyu, ultrasaf H2O ve etanol pimleri çeker tarafından sterilize. En az 30 için dalmış pimleri tutmak çamaşır suyu ve etanol adımlar için s.  Etanol içinde daldırma sonra kısa bir süre belgili tanımlık keyif alev. Tekrar ediyorum.
        Not: tüm çamaşır suyu durulayın emin olun ve iğne çamaşır suyu paslanmaz çelik pim zarar gibi uzun süre bleach maruz bırakmayın.
      2. Dikkatli bir şekilde yapışkanlı folyo kapak donmuş 96-şey gliserol hisse senedi Kütüphane plaka ve yavaşça çıkarın ama sıkıca sterilize plaka Çoğalıcı ipuçları hala donmuş gliserol stokları kuyu eziyet. Aşılamak 200 µL LB + Amp kültürler ve geçirgen bir zar ile inoculated plaka mühür. Kültürler üzerinde benchtop gecede büyümeye izin.
      3. Plaka Çoğalıcı olduğu gibi adım 2.1.1 sterilize, dikkatlice mühür sıvı kültür plaka sonra gece büyüme kaldırmak ve ipuçları Çoğalıcı Pins bırakın. İpuçları bile baskı pimleri yavaşça, yeterli alan bitişik noktalar arasında kalan sağlanması küçük dairesel bir hareket ile plaka üzerinden bir dikdörtgen LB amp + tet agar plaka ve transfer bakteri için geçerlidir. Koloniler gecede 37 ° C'de agar plaka üzerinde büyümeye izin Bkz. ek dosya 3 LB + Amp/Tet hazırlanması için plakalar.
      4. Kullanılmadan önce agar plaka 4 ° c (kapak tarafı aşağı), ters parafin filmde sarılı saklayın.
        Not: kolonileri kapağı yan depolama çapraz-RNAi klonlar kirletmek yoğunlaşma sağlayacak! RNAi klonlar IPTG indüksiyon değişken zaman uzunlukları için sonra dsRNA inducing içinde etkinliğini korumak gibi kolonileri E. coli bağlı olarak belirli RNAi klonlar, 4 ° C'de 2 – 8 hafta boyunca saklanır. İçin küçük topluluklar RNAi klonların, RNAi verimliliği ampirik RT-qPCR tarafından nakavt onaylamak için tespit edilmelidir.
    2. 24-şey plakaları deneme bir deneme için gerekli en az sayıda hesaplamak: (yineleme kümesinin başına # plakaları) x (beklenen # zaman puan). Bir kaç ekstra çoğaltma kümeleri kirlenme (2B rakam) gibi konuların işlenmesinde dahil olduğundan emin olun.
      Not: RNAi klonlar toplam sayısı yinelemeler her zaman noktası (Şekil 2C) için bir dizi yapmak için 24-şey tabak sayısını belirleyin.
      1. 24-şey kaplamalar, 1.1.2 (ek dosya 3 tarifi için) atladıkça hazırlayın. Tabak tahlil Puanlama deneyci bir renk kodu ya da benzer kodlama düzeni kullanarak deneysel koşullar için kör olur, böylece onları hazırlarken etiketleyin.
      2. Bir küme 1,5 mL LB + Amp kültürler (2.2.2 bakınız) her 10 kopyalar için aşılamak. 96 de derin-şey tabak tabak Çoğalıcı (olduğu gibi 2.1.3) ve bakteri kolonileri 2.1.4 (Şekil 2C, sol) üzerinden kullanarak kültürlerde aşılamak. Solunabilir membran ile mühür, 20 h (37 ° C) sallayarak ile büyümek.
      3. 6-şey çok kanallı pipet (Şekil 2C, şu) aralığı ayarlanabilir uç ile kullanarak her plaka için bir gecede kültür 120 µL tohum. Tüm sıvı absorbe olmuştur kadar laminar akış mahallede ortaya çıkardı plakaları kuru. Aşırı kuru değil. Tabak gecede, oda sıcaklığında saklayın.
  3. C. elegans hipoklorit tedavi kullanarak eşitleme
    1. Hayvan deney için gerekli en az sayıda hesaplamak: L1s gerekli minimum sayısı = (15-20 hayvanlar/iyi) (24 kuyu/plaka) (tabak/yineleme kümesinin X)(Y replica sets).
      Not: yineleme kümesi yöntemi geleneksel yöntemden daha fazla hayvan gerektirir. Bir 10 cm tabak gravid kurtlardan tam 20.000-50.000 L1 hayvanlar gravid yetişkin yoğunluğuna bağlı olarak sağlar. Benzer şekilde, yirmi 6 cm tabak ~ 30.000 L1 hayvanlar verim. Hayvanlar gerekli en az sayıda iki katına bir yumurta hazırlama hazırlamak planlıyoruz. Nüfus hazırlık hasret Eğer yeniden besleme veya yeni bir tabağa yığın ve gıda proceding17,18önce en az üç kuşak izin. Geri kalan L1s dondurmak emin olun.
    2. Elde etmek için geleneksel yöntem olduğu gibi 1.2-1.2.6 adımları izlemeniz L1 hayvanlar senkronize. 15-20 L1 hayvanlar her iyi bir 6-şey aralığı ayarlanabilir pipet ve reaktif depo, 1.2.7 için benzer kullanarak içine tohum. Düzenli olarak çözüm önlemek hayvanların yerleşme L1 karıştırın.
  4. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) eklenmesiyle Döl üretim önlenmesi
    1. Adım 1.3.1 izleyin.  Steril 50 x FUdR hisse senedi hazırlamak (bkz. Adım 1.3.1.1).
    2. Hayvanlar ulaşmak L4, 50 25 µL eklediğinizde x FUDR 24-iyi her şey için plaka 6-kanal aralığı ayarlanabilir pipet kullanarak.
  5. Skor canlılığı
    1. Çoğalt plakaların bir set kaldırmak ve wells M9 çözüm, şey, başına kayıt toplam hayvanlar ile sel ve sonra yavaşça dokunmatik olmayan hareketli hayvanlar bir solucan çekme (Şekil 2B) ile kafa. Taşımak başarısız hayvanlar ölü attı. Tabak gol atma. Günlük kayıt canlılığı.
      Not: rüptürü, gösteri brüt morfolojik kusurlar, geliştirmek başarısız oldu veya iyi tarafında Gezilen her iki ölü ve toplam değeri çıkararak sansür için hayvanlardır.
      1. Her şey, her zaman bir noktada ayrı olarak diğer değerlerden içinde sansür hayvanlar kaydedin.
      2. Yemek var mı veya kontamine kuyuları puan edinildi değil (Örneğin mantar ya da çamur); Böyle wells sansürlü olarak kabul edilir. Bütün hayvanlar morfolojik veya gelişimsel kusurlar görüntülerseniz, Ayrıca, bir de sansür. Bu RNAi klon/iyi bu noktada zaman için sansür bir olay kaydeder.
      3. Çoğalt bir tabak Puanlama sonra atın. Yeni bir çoğaltma Puanlama bütün wells genelinde tüm hayvan ölene kadar her gün ayarla devam edin. Önyargı Puanlama riskini azaltmak için deneyci için deneysel koşullar kör kalması ve benzer sonuçlar önceki zaman puan Puanlama sırasında başvuru gerekir değil.
      4. Bir kuyu içinde bütün hayvanlar vardı bir belirli zamanda noktada ölü, o zaman o günkü skorlama, incelerseniz bütün hayvanlar ölü için iki ardışık zaman puan için gol olup olmadığını bir şey göz önüne alındığında. Eğer öyleyse, canlılığı Puanlama artık o kadar iyi sonraki zaman puan için gereklidir.
      5. Ek bağımsız deneme denemeler yapmak. Art arda denemeler sonuçlarını Ayrıca bu önceki çalışmalarda belirtildiği deneme sayısı ile izlemek.

3. grafik verileri

Not: yineleme kümesi ile bir eğri uygun yöntemi ortalama ve maksimum ömrü yaklaşık için uygulanır. C. elegans mortalite değerlendirmek için parametreleri logit eğrisi19uygun.  Çoğu hayatta kalma araçları logit eğri uydurma desteklemeyen gibi yeni bir program (yineleme kümesi için); logit eğriler çizmek için geliştirilmiştir Kaplan-Meier eğrileri (geleneksel yöntem için) de desteklenir.

  1. Yazılım ile başlamak. Güncel sürümü ( Malzeme kısımbakın) için yayın zip dosyasını indirin. ZIP dosyasını bir klasöre ayıklayın. Belgili tanımlık hulâsa ağıl "readme" dosyasında ek yükleme yönergeleri için bkz:.
  1. Çizdirme arabirimi başlatın. "Kod" dizininin konumunu bulmak içinde belgili tanımlık ağıl--dan belgili tanımlık fermuar eğe hulâsa (Örneğin  "/ Kullanıcılar/UserName /Desktop/WormLife/kod").
    1. Sadece tespit için klasör yolu yerine R konsolda aşağıdaki komutları girin. Sıkıştırma girmek ya da her satırı girildikten sonra dönmek: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi varsayılan ekran yukarı getiren yeni bir pencerede yüklemek arabirim için bekleyin. Arka planda R izin.
  2. Verileri virgülle ayrılmış değerler (CSV) veya sekmeyle ayrılmış değerler (TSV) dosyaları olarak biçimlendirme. Sütunlar ve adları, çözümleme türüne bağımlı belirtin. Ek dosya 4 (yineleme kümesi) ve ek dosya 5 (geleneksel/Kaplan-Meier) önceden biçimlendirilmiş örnek veriler için bkz.
    Not: veri zorlanma/tedavi her zaman noktası deneme başına başına yani bir satır bir "uzun" biçiminde belirtilmesi gerekir. CSV dosyaları platformlar arasında en iyi uyumluluk için tavsiye edilir.
    1. Atlanan veya sansür gözlemler için karşılık gelen satırları kaldırın. Veri alınırken bir hata neden olarak eksik veya sayısal olmayan değerler, olmaması için kontrol edin.
    2. Geleneksel Kaplan-Meier tarzı analiz için bağımsız denemeler-Arsa verilerden havuz değil onları ayrı ayrı. Yineleme kümesi analiz için birden çok deneme verilerden havuz ve daha sonra "TrialView" işlevini kullanarak araştırmak (bkz. 6.3.3.4).
  3. Çizdirme arabirimini kullanarak
    1. Bir veri dosyası ("Dosya" menüsünün altındaki "alma") iletişim kutusunu kullanarak. ".Csv" dosyaları açmak için içinde belgili tanımlık damla aşağı ".csv" dosya türünü değiştirme (".txt/.tsv" varsayılandır), veri dosyası ile klasöre gidin. Burada dosya yineleme kümesi örnek veri (ek dosya 4).
      Not: bir veri kümesi zaten açık olduğunda bir dosya alma akım olarak dataset yerini alacak.
    2. Seçili dosya (Şekil S1A yineleme kümesi için) sütunları tanımlayan aracılığıyla yürüyor alma sihirbazını başlatmak için almak için bir dosya seçin. Giriş verileri bir yineleme kümesi deneye karşılık geliyorsa, "Logit" çalışma türünü seçin.
      Not: Alma iş akışı yineleme kümesi (Şekil S1A) ve geleneksel (Kaplan-Meier) (Şekil S1B) arasında farklıdır.
    3. "Verileri çizmek". Veri çizme başlamak için "satır ekle" seçin. (Bir koşullar kümesi için bir satır karşılık gelir. Deneyler ile yardımcı olacak özellikler nerede birçok koşulları test edildi) vardır.
      1. Denetim koşulları-örnek veri N2 (WT) L4440 ile söz konusu olduğunda Arsa (boş vektör) RNAi uygun. "Satır ekle" "Grafik" menüsü altına satır Ekle Sihirbazı'nı başlatmak için seçin: satırını temsil ettiği için koşulu çizim ve Grafik parametreleri seçin.
        1. Eğri bir farklı durum için el ile eklemek 3.3.3.1 adımlarını yineleyin
        2. Rengini değiştirmek veya sembol için bir çizgi çizmek için "grafik menü" altında "Satırı değiştirin" seçin.
        3. Ezelî takas tüm satırları bir satır kaldırmak için "Satır Sil" "grafik menüsünde" altında seçin.
        4. Tüm satırları geçerli komplo temizlemek için "grafik menüsünde" altında "Çizgi işaretini kaldırın" seçin.
        5. Otomatik olarak seçilen en fazla x ekseni (zaman) değeri geçersiz kılmak için "Set X Ölçeği" "grafik menüsündeki" kullanın.
          Not: (hayatta kalan Kesir) y ekseni her zaman artırımlarıyla % %20 0 ' (alt) % 100 (üstte) görüntüler. X ekseni her zaman 5 artışlarla görüntülenir. Eksen etiketlerini Arsa görüntüleri kaydettikten sonra etiketlemede esnekliğe çizilen değil.
      2. Görüntülenmekte olan arsa JPEG formatlı görüntüleri kaydetmek için "Dosya menüsünden"; "Komplo Kaydet" seçeneğini kullanın Sadece geçerli Arsa kaydedilir.
      3. Birçok farklı koşulları için bireysel araziler bir deneyde oluşturmak için yazılım, tanımlama ve bir "dizi" komplo sağlar.
        Not: Serisi konsepti uygulanması ile büyük deneyler çalışırken etkili olmasını sağlar.
        1. Boş arsa çalışma alanı ile başlayarak, tüm araziler (3.3.3.1 bakınız) dizi genelinde tutarlı olacak şekilde denetim koşulları karşılık gelen satırları ekleyin.
        2. "Define serisi" serisiyle grafikler menüde tanımlayın. İlk seride görüntülemek için satır karşılık gelen bir koşul seçin; tek seçilebilir. Grafik parametreleri (çizgi renk ve arsa sembolü) satırında 3.3.3.1 için seçin.
        3. Araziler için farklı test koşulları gözden geçirin. "Serisi çizgi" görüntüsünü ana arsa penceresinin yanı sıra üst menü çubuğu (Şekil 3A-C) iki tarafta bulunan sol/sağ ok düğmelerini kullanarak koşulları arasında geçiş yapın.
          Not: seçilen Serisi hattı bir daha önce eklenmiş denetim/başvuru satır olarak aynı koşul ise, yeni satır yer paylaşımlı görünebilir.
        4. Belirli diğer işlevleri kullanılabilir (kaydetmek serisi çizer ve Trialview-görün 3.3.3.4 için ikinci) yapmak için serisi tanımlayın. Bir dizi tanımladıktan sonra "Dosya" menüsünden "Serisi araziler Kaydet" seçeneği serisi yeni bir klasördeki her arsa için bireysel Arsa görüntü dosyaları kaydetmek için kullanın.
      4. Trialview — bağımsız denemelerin bir yineleme kümesi deney sonuçlarından görselleştirme. Eğer birden fazla denemeler bir veya daha fazla örnek gruplar için çalıştırılan, bireysel çalışmalar verilerden ve tüm denemeler bağımsız denemeler (bkz: 3D şekil) arasında tutarlılığı ayrı ayrı değerlendirmek için havuza alınan verilerden arsa.
        1. Bir serisi 3.3.3.3 içinde açıklandığı gibi ayarlayın. Farklı denemeler farklı bir resimdeki "değişen" örnek gruplarının her biri için belirtilen başvuru/kontrol örnekleri için ilgili denemeler üzerinde çizilir.
        2. TrialView görüntüleri kaydetmek için veri menüsünde "Baskı TrialViews için" git; bir JPEG resmi çıkış serideki her arsa için olacaktır.
          Not: Örnek sonuçları Şekil 3D bir durumda iki deneme ile içindir.
    4. Ortalama ömrü veriler, yineleme kümesi için Özet Tablo. Görsel veri makul uyum sağlamak için eğrileri incelemek, o zaman seçme ''Özet Tablo "ortalama yaşam süresi değerleri (% 50 hayatta kalma logit eğri üzerinde zaman) her örnek türü. için bir tabloyu kaydetmek için veri menüsünden seçeneğini
  4. Yineleme kümesi yöntemi ile üretilen verileri istatistiksel değerlendirilmesi
    1. Bir yineleme kümesi deneme iki grup arasında istatistiksel analiz için değiştirin ve yayın zip dosyası içinde sağlanan bir R komut dosyasını çalıştırın (bkz: "WormLife istatistiksel analiz şablon komut. R").
      Not: R yeterlilik komut dosyasını çalıştırmak için gerekli değildir. Ek belgeler dosyasındaki mevcuttur. Komut dosyası örneği yineleme kümesi veri analizi için hazırdır. Kullanıcı tarafından oluşturulan veri uygun biçimde (bkz. ek dosya 4) da analiz edilebilir.
      1. Komut dosyası R (R GUI veya RStudio) açın.
        Not: Bu komut dosyasını çalıştıran olmadan görüntüler.
      2. Bilgisayarınızda konum eşleşmesi için gereken dosyaları konumlarını değiştirin.
        Not: Bu dosya yolları "tam" olması gerekir (yani klasörler dahil olmak üzere tam dosya konumu içermelidir).
        1. "WlDir" (dizininin konumunu), "veri dosyası" (analiz etmek için yineleme kümesi veri dosyası), "compFile" (uygulanabilirse çalışmasına karşılaştırma belirtimi) ve "outputPath" (konum sonuç dosyalarını yazılacağı için (dosya/klasör konumlarını) yollarını değiştirme için).
      3. Analiz edilecek dosyanın içindeki sütun adlarının örnek dosyadan farklı sütun adları "Belirt sütunlar veri dosyasındaki" bölümünde ayarlayın. Her parametre için bir sütun belirtin. Eğer birden fazla suşları bir eğitim var, ama hiçbir RNAi (veya başka bir tedavi) boş girdiler veya aynı veri dosyasıyla (Örneğin "no_treatment", vb) tüm satırlar için bir sütun ekleyin.
      4. "CompFile" parametresini ayarlayın. "CompFile" parametresi NA için ayarlarsanız, tüm olası ikili karşılaştırmalar gruplarının çalıştırılacak.
        Not: Bir grup zorlanma/genotip ve tedavi, hangi birleştirilmiş ve "strain_treatment" görüntülenen kombinasyonu tarafından tanımlanır. Birçok grup ile daha büyük çalışmalar için bir CSV dosyasına karşılaştırmalar belirten sağlanabilir. "Comps_rsm_example.csv" örnek dosyasına bakın.
      5. Monte Carlo yeniden örnekleme için yineleme sayısını ayarla ("k.resamp", varsayılan değer ise 1000).
        Not: P-değeri 0 çok az yineleme gerçekleştirildiğinde iade edilebilir; Bu gibi durumlarda rapor için uygun olan "p < 0,01" (Eğer k.resamp = 100), veya "p < 0,001" (Eğer k.resamp = 1.000), vb
      6. Komut dosyasını çalıştırın: RStudio "kaynak" düğmesini (düzenleme penceresinin sağ üst) veya R GUI "düzen" menüsünden "kaynak belge". (Yürütme biraz zaman alabilir.)
      7. R "meşgul" göstergesi artık görüntülendiğinde, çıkış Açık Dizin-orada-ecek var olmak (medyan sağkalım, p-değerleri, % ortalama ömrü değişim) her karşılaştırma sonuçlarını içeren bir tablo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir yeni metodoloji geliştirme yeni yöntemi kabul edilen önceki yaklaşımlar sonuçlarından recapitulates ve bir alan içinde standardına uyan zorunludur. Biz yineleme kümesi ve C. elegans ömrü raporlaması için geleneksel yöntemlerle benzer sonuçları20üretmek daha önce ampirik olarak göstermiştir. Genellikle 20 ° C'de tutulan vahşi-türü C. elegans (N2) live biz geleneksel (Şekil 4A, siyah çizgi) ve yineleme küme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her iki geleneksel ve yineleme kümesi yöntemleri kronolojik olarak yaşlı hayvanlar eşitlenmesi gerekir. Biz hayvanlar nerede sadece döllenmiş yumurta gravid yetişkin ile tedavi hayatta hipoklorit tedavi gravid yetişkinlerin kullanarak eşitler bir yöntem içerir. Bu embriyo sıvı süspansiyon yumurtadan ve gelişimsel olarak ilk larva aşamasında (L1) tutukla. L1 hayvanlar yiyecek (Örneğin E. coli ifade dsRNA bir gen ilgi için) üzerine tohum sonra hayvanlar geliştirme devam. L1 hayvanlar tarafından gravid yet...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması açıklanan bu eser tarafından sağlanan için finansman: Rochester Üniversitesi Office Provost ve Tıp Fakültesi ve diş hekimliği Dekanlık yolu ile Sağlık Bilimleri merkez için Hesaplamalı yenilik (HSCCI); Ellison tıbbi Vakfı yeni akademisyenler yaşlanma Bursu (AG-NS-0681-10) fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IPTG (izopropil beta-D-1-tigalaktopiranosid)Altın Bio12481C100
FuDR (5-Floro-2 '-deoksiuridin)Alfa AesarL16497
24 Kuyulu Kültür PlakalarıGreiner Bio-One# 662102
Dikdörtgen işlenmemiş tek kuyulu plaka, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 &; mikro; L 96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One#786261
2 mL 96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One#780286
Hava geçirgen plaka contasıVWR60941-086
96 pinli plaka çoğaltıcıNunc250520
bacto-peptoneVWR90000-368
bakteriyolojik agarAffymetrix/USB10906
HT115 bakterilerindeki C. elegans RNAi klon kütüphanesi- AhringerKaynak BiyobilimC. elegans RNAi Koleksiyonu (Ahringer)Ayrıca bakınız Kamath ve diğerleri, Nature 2003.
HT115 bakterilerinde C. elegans RNAi klon kütüphanesi- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Kaynağı (Vidal)Ayrıcabakınız Rual ve diğerleri, Genom Araştırmaları 2004. Bu kütüphane aynı zamanda Dharmacon'dan da edinilebilir.
WormLife- Replika Set Hayatta Kalma Analizi YazılımıSamuelson LabN/A
https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 Boş Vektör PlazmidAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prizmahttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854(1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278(2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964(2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Replica Set MethodC elegans LifespanHigh throughput ScreeningFeeding based RNAiSurvival Curve AnalysisMulti well Plate AssayFUdR TreatmentL1 Animal SeedingPlate ReplicatorData Analysis Software

Related Articles