Yöntem makalesi

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

DOI:

10.3791/57831

⸱

25 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Division of Molecular Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunophenotypic karakterizasyonu ve moleküler analiz uzun heterojenite betimlemek ve farklı hücre popülasyonlarının tanımlamak için kullanılmıştır. FACS doğal olarak moleküler analiz ancak uygulamasından önce hedef hücreleri kez prospektif toplu olarak yalıtılır bir tek hücreli tahlil böylece tek hücreli çözünürlük kaybediyor. Tek hücreli gen ifade analizi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının tek tek hücreleri arasında moleküler farklılıkları anlamak için bir araç sağlar. Toplu hücre analizi farklı hücre tipi bir overrepresentation önyargıları ve nadir hücrelerindeki sinyallerin occlusions biyolojik önemi ile sonuçlanır. Orta hücre yüzey marker ifade içeren hücreleri de yakalanır iken, tek hücreli gen ifade analizi için birleştiğinde Dizin FACS sıralama kullanarak, nüfus tek hücreli çözünürlük kaybı olmadan araştırılması değerlendirilmesi etkinleştirme sürekli yüzey marker ifade alaka. Burada, tek hücreli Ters transkripsiyon birleştiren bir yaklaşımı açıklamak kantitatif PCR (RT-qPCR) ve FACS dizini aynı anda moleküler ayırdetmek için sıralama ve immunophenotypic heterojenlik hücre popülasyonlarının içinde.

Hücre hücre çeşitleri için read ilgili sorunlar tarafından şaşırmış değil iken tek hücreli RNA sıralama yöntemleri aksine, düşük-bereket transkript sağlam ölçümleri ile daha az bırakan, için qPCR ile belirli hedef amplifikasyon kullanımı sağlar Derinlik. Dizin sıralama tek-hücre lizis içine bu yöntemi arabellek doğrudan Ayrıca, tarafından cDNA sentezi ve belirli hedef öncesi amplifikasyon moleküler imzalarla sonradan türetilmiş hücre yüzeyine korelasyon gelince bir adım de gerçekleştirilecek sağlar Marker ifade. Açıklanan yaklaşım hematopoetik tek-hücreleri araştırmak, ama aynı zamanda başarılı bir şekilde diğer hücre türleri kullanılmıştır için geliştirilmiştir.

Sonuç olarak, tatlı ayrı altgrupları sonraki potansiyel yalıtım için protokolleri geliştirmek için bir panel mRNA ifade imkanı ile önceden seçilmiş genlerin hassas ölçüm için burada açıklanan yaklaşım sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her bireysel kan hücresi nerede kök hücre sonunda ölümcül belirli taşıyan son efektör hücrelere ayırt etmek giderek taahhüt ara ataları bir dizi üstüne tepe formu hücresel bir hiyerarşi içinde bulunan inanılıyor biyolojik fonksiyonlar1. Kök hücre sistemleri nasıl düzenlendiği hakkındaki bilginin çok hematopoetik sistem, prospektif çok kök hücre veya çeşitli ataları2 için zenginleştirilmiş farklı hematopoetik nüfus izole yeteneği büyük ölçüde nedeniyle oluşturulan FACS sıralama tarafından. Bu nüfusun çoğu için bu işlevsel olarak veya tatlı,3,4profil oluşturma gen ekspresyonu ile ağırlıklı olarak çözümlenmesi için izin verdi. Ancak ne zaman gen ekspresyonu hücreleri arasında toplu nüfus bireysel farklılıklar analiz ortalama ve5kaybettim. Böylece, hücre küçük alt kümeleri nüfus6inferred biyolojik işlev için hesap Eğer hücre hücre çeşitleri türdeş olmayan hücre kesirler içinde algılamak için iş göremezlik anlayışımız kritik biyolojik süreçlerin yıkmak, 7. Tersine, gen ifade imzalar tek hücreli çözünürlükte incelenmesi heterojenite betimlemek ve overrepresented hücreleri8kümelerine gölgede bırakan etkilerden kaçınmak imkanı sunuyoruz.

Bugüne kadar tek hücreli gen ifade analizi için birçok iletişim kuralları geliştirilmiştir; Her bir yaklaşım ile kendi uyarılar sahip. İlk yöntem RNA floresan situ hibridizasyon (RNA-balık), hangi transkript sınırlı sayıda ölçer ama RNA yerelleştirme9,11soruşturma için sağlar benzersizdir oldu. Erken yöntemleri tek veya çok az tutanaklar da vardı algılamak için PCR ve qPCR kullanarak12geliştirdi. Ancak, bu son zamanlarda aynı anda tutanaklar ile qPCR arasında yer alan yüzlerce hücre başına yüzlerce ifade analiz ve böylece yüksek boyutlu heterojen analiz kullanmak için izin verebilirsiniz Havacilik tabanlı yöntemler tarafından yerini almış gen panelleri10,13önceden belirlenir. Bunlar teorik olarak tüm transcriptome bir hücrenin ölçebilir ve böylece heterojenite analiz10' a, bir keşif boyut eklemek gibi son zamanlarda RNA-dayandırılmış yaygın tek hücre analiz için kullanılan teknolojiler haline 14. Multiplexed qPCR analiz ve tek hücreli RNA sıralamanın farklı özelliklere sahip, bu nedenle yanı sıra hedef popülasyon hücre sayısı sorulan soru üzerine yöntemden birini kullanarak için mantığı bağlıdır. Ne zaman bilinmeyen hücre veya büyük popülasyonlarda incelenmiştir yüksek işlem hacmi ve düşük maliyetli tek hücreli RNA sıralama tarafsız, araştırmacı özellikleri ile birlikte hücre başına arzu edilir. Ancak, tek hücreli RNA sıralama aynı zamanda yüksek bol transkript transkript düşük bereket ile terkinin için eğilimli olmakla birlikte daha sık sıralama karşı önyargılı. Bu çoğu zaman ince veya teknik gürültü15dakika sonra gizli önemli moleküler sinyaller ortaya çıkarmak için bioinformatic analiz yüksek talepleri koyar oldukça karmaşık veri yol açabilir. Böylece, iyi karakterize dokular için tek hücreli qPCR analizi ile işlevsel olarak önemli gen veya moleküler işaretleyiciler için seçili astar panelleri heterojen belirlemek için hassas, kolay bir yaklaşım hizmet verebilir önceden belirlenen bir nüfus. Ancak, bu kıyasla unutulmamalıdır tek hücreli RNA-seq için hücre başına maliyet tek hücreli qPCR yöntemleri için genellikle yüksektir. Burada, tek hücreli RT-qPCR (düzeltilmiş Teles J. ve ark. bir araya getiren bir yaklaşımı açıklamak 16), FACS dizinine nüfus içinde moleküler ve immunophenotypic heterojenlik karakterize17 ve Biyoinformatik Analizi18 için aynı anda sıralama.

Bu yaklaşımda, faiz hücre nüfusu lekeli ve tek hücre lizis arabellekte 96-şey PCR tabak içine doğrudan FACS tarafından sıralanır. Aynı anda, hücre yüzey işaretleyicileri ek kümesi ifade düzeyde FACS-sıralama, Dizin sıralama olarak adlandırılan bir yöntemi sırasında tek her hücre için kaydedilir. Lysed hücre malzemesi daha sonra güçlendirilmiş ve genler seçili bir dizi gen ekspresyonu RT-qPCR bir mikrosıvısal platformu kullanarak analiz. Bu strateji bireysel her hücrenin hücre yüzeyine marker ifade sıralanmış tek hücreli hem de aynı anda karakterizasyonu moleküler analizi sağlar. Dizin oluşturulmuş sıralı veri işaretleyicilerini ifade için hücre tatlı farklı alt kümelerini doğrudan eşleme tarafından altgrupları onların potansiyel yalıtımı için kullanılan belirli bir immunophenotype bağlanabilir. Yöntem özetlenen Şekil 1' deki adım adım. Aksi takdirde ince gen ifade sinyalleri tıkamanın alakasız bol genlerin ölçüm kaçınmanızı sağlar beri bir önceden belirlenmiş gen panel daha fazla hedeflenen gen ekspresyonu, daha yüksek bir çözünürlük için katkıda bulunur. Ayrıca, belirli hedef amplifikasyon, bir adım geriye doğru transkripsiyon ve amplifikasyon transkripsiyon faktörleri ya da non-poli-adenylated RNA'ların gibi düşük ifade edilen tutanaklar, sağlam ölçüm için sağlar. Önemlisi, qPCR yöntemler belirli malign hastalıklar19araştırılması önemlidir füzyon protein mRNA ölçüm için olanak sağlar. Son olarak, genler odaklı sayısı incelenmiş, düşük bırakma oranları, ve tek hücreli RNA-devamı gibi daha yüksek boyutlu yöntemleri arasındaki hücreleri yapmak bu yöntem kolayca analiz sınırlı teknik farklar kıyasla Protokolü takip ederek, tüm deney, hücreleri analiz sonuçları, üç gün içinde bu hassas, yüksek-den geçerek tek hücreli gen ifade analizi için basit ve hızlı bir yöntem yapım sıralama üzerinden gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. lizis plakaları hazırlanması

  1. Bir RNA/DNA ücretsiz Bank kullanarak hazırlamak yeterli lizis arabellek % 10 ilave, 96 kuyuları için 390 µL nükleaz boş su, % 10 17 µL karıştırılarak NP-40, 2.8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT ve 5.3 µL RNAse inhibitörü (bkz: Malzemeler tablo). Girdap ve spin aşağı.
  2. Her şey 96 iyi PCR plaka lizis arabelleğe 4 µL dağıtmak ve yapıştırıcı film ile plakalarının. Spin aşağı tüplere sıvı alt plakaların toplamak. Buz tabakalarına (maksimum 24 h) sıralama hücre kadar tutun.

2. hücre sıralama için hazırlık hücre

  1. Hücreleri (burada, CD34 zenginleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre) deney için uygun sayıda çözülme. 1 x 106 yaklaşık üç 96-şey plakaları tek-hücre kontrolleri ile sıralamak için uygun hücrelerdir.
  2. Çözdürülen hücreleri 15 mL konik tüp nakletmek ve 1 mL FBS her 30 eklemek 8 mL toplam hacmi ulaşılana kadar s. 4 ° C'de 10 dakika için 350 x g de bir santrifüj hücrelerde spin ve süpernatant kaldırın.
  3. 8 mL arabellek boyama hücrelerde resuspend (% 2 ile PBS FBS) ve santrifüj kapasitesi 350 x g 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant kaldırın.
  4. 200 µL boyama resuspend hücreler tampon ve hücre kontrol lekeler için kaldırma.
  5. Floresan bir denetimler (FMOs) her fluorophore için eksi 50 hücrelerde bir kısmını boyama yapmak arabellek boyama µL. Bu örnekte, 6 microcentrifuge tüpleri 20.000 hücreleri ile FMOSs kullanılır. Hücre sayısı araştırıldı nüfus bağlı olarak ayarlanması gerektiğini unutmayın. Tüm antikorlar örnek leke bir her tüp dışında olduğu gibi aynı konsantrasyonu ekleyin.
  6. Her fluorophore için tek lekeleri 50 µL arabellek için kullanılan her fluorophore hücrelerde bir kısmını boyama yapmak. Bu örnekte 6 microcentrifuge tüpleri 20.000 hücreleri ile kullanılır. Hedef her antikor için denetimler için kullanılan hücre tarafından ifade edilmesi gerektiğini unutmayınız. Her antikor olduğu gibi örnek leke bireysel tüpler aynı konsantrasyonu ekleyin. Ayrıca 20.000 günahı hücreler içinde 50 µL bir günahı denetimi olarak tutmak.
  7. Hücre örneğe uygun onların konsantrasyonu antikorlar ekleyin. Kullanılan bir 1/100 konsantrasyonu, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 ve Lineage Mix CD34-FITC Buradasınız: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, ve CD235a-PECy5 1/1000.
  8. Karanlıkta buzda 30 dk antikor içeren hücreleri kuluçkaya.
  9. Hücreleri 3 mL arabellek boyama ile yıkayın. Hücreleri, 350 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
  10. Hücreleri resuspend ve 2,9 arasındaki adımları yineleyin.
  11. Resuspend 500 µL örnek ve FMOs 100 µL arabellek ile 1/100 7AAD ve Filtre hücreleri tek hücre süspansiyon almak için 50 µm filtreden boyama.

3. hücre sıralama

  1. FACS makine ayarlandığından emin olun yukarı doğru açılan gecikme ve sitometresi kurulum ve ile (CST) izleme uygun hücre sıralanır emin olmak için üreticinin talimatlarına göre son zamanlarda gerçekleştirilmiş. En iyi olay hızı 800 ila 2000 olaylar/s arasında ise hematopoetik hücreler için 4 85 mikron meme ve maksimum hızı kullanılması, önerilir.
  2. Floresans tazminat gerçekleştirerek için spektral örtüşme düzeltin ve gates FMO denetimleri veya iç negatif kontrol göre ayarla.
  3. Reanalysis hedef nüfusunun 100 µL leke arabelleği ile yeni bir microcentrifuge tüp içine en az 100 hedef hücreleri sıralayarak gerçekleştirin. FACS sıralanmış örnek kaydı tarafından sıralanmış hücreleri analiz ve onlar sıralama geçit sonunda emin olun.
  4. Kurulum tek hücre plaka 96 iyi plaka iyi A1 düşüş merkezleme tarafından sıralama. Merkezli değil, Bütün wells her şey merkezi bir hücrede alacaksınız emin olmak için boş bir 96 iyi levha kenarındaki tüm kuyu içine 50-100 6 µm parçacıklar sıralamak.
  5. Mümkünse, hücrelerin sıralanır emin olmak için ek bir denetim tek-hücreleri vitro büyüme için sıralama tarafından eklenebilir. Hematopoetik hücrelerin içinde 100 µl SFEM % 1 penisilin streptomisin, 100 ng/mL ile U-alt 96 iyi levha FLT3L, TPO ve SCF yetiştirilir. Bir mikroskop kullanarak hücre colonies için kültür 3 gün sonra her şey analiz.
  6. Yapıştırıcı film plakalar kaldırın. Faiz (burada Lin CD34 + CD38-hücreleri) 92 96 wells, dışarı içine tek bir hücre tür etkinleştirmek Dizin-faiz (burada CD45RA, CD49f ve CD90) diğer işaretler tek her hücre için immunophenotypic profili kaydetmek için yazılım sıralama FACS ayırma.
  7. PCR güçlendirme doğrusallık denetimleri için sırasıyla 10 ve 20 hücreler iki kuyu sıralayın. Wells H1 ve H2 genellikle kullanılır.
  8. Hayır-şablon kontrol eder, genellikle kuyu H3 ve H4 olmadan herhangi bir hücre iki kuyu tutun.
  9. NET yapıştırıcı film ile plakalarının ve 300 x g kuru buza buz gibi ek önce 1 dk. için de tabak spin.
  10. -80 ° C'de donmuş plakaları depolamak
    Not: Güvenli durdurma noktası. Sıralanmış ve lysed hücreleri uzun süreli depolama için-80 ° C'de tutulabilir.

4. Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon

  1. Astar mix temizlik gen astar ve astar çivili-kontrol için RNA, 1,5 mL RNAse ücretsiz tüp bir RNA/DNA ücretsiz banka dahil olmak üzere her astar çiftinin 2 µL ekleyerek tüm 96 gen hedefler için hazır olun. Daha az 96 primerler kullanılarak, nükleaz boş su eksik astar için eşdeğer hacmi ekleyin. Astar ayrı olarak istenilen gen paneli maç emredildi.
  2. Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon 632.5 µL 2 x reaksiyon mix, 101,2 µL ekleyerek karıştırın Taq/SuperscriptIII, 151.8 µL astar mix ve 0.7 µL denetim RNA çivili. Bu adım bir DNA ücretsiz banka preform. Karıştırmak yanında vortexing ve toplamak sıvı tüp alt aşağı spin. Örnek için ek kadar buz üzerinde tutun.
  3. Yapmak Hayır-Ters transkripsiyon kontrolü mix karıştırma 2 reaksiyon mix x 27,5 µL, 1.76 µL Taq enzim, 6.6 µL astar mix ve nükleaz boş su 2.64 µL tarafından dört kuyuları için. Denetim RNA spike. Bir DNA ücretsiz bankta bu adımı gerçekleştirin. Girdap ve spin toplamak sıvı tüp ve buz kadar ek devam dibinde örnek aşağı.
  4. Lysate buz tabakalarına çözülme. Önceden hazırlanmış Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon mix 8,75 µL doğrusallık ve no-şablonu denetimler de dahil olmak üzere 92 wells için ekleyin. Hayır-Ters transkripsiyon kontrolü Mix 8,75 µL dört kalan wells için ekleyin. NET yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plakalarının.
  5. Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon PCR makinesi preamp programı göre plaka çalıştırarak preform; Adım 1:50 ° C 60 dk için adım 2: 95 ° C 2 min için adım 3: 95 ° C 15 s, adım 4: 60 ° C 4 dk, yineleme için adım 3-4 24 kez ve nihayet sonsuza kadar adım 5: 8 ° C.
  6. PCR tamamlandıktan sonra plaka kısa süreli depolama için 8 ° C ile -20 ° C uzun süreli depolama için tutun.
    Not: Güvenli durdurma noktası. Güçlendirilmiş malzeme kısa süreli depolama için 8 ° C'de ve uzun süreli depolama için-20 ° C'de tutulabilir.

5. örnek ve tahlil plakaları için hazırlanması Multiplex mikrosıvısal gen ifade Analizi

  1. Pipetting 3 tarafından plaka yükleme tahlil hazırlamak µL tahlil yükleme reaktif 96 iyi plaka her şey için. 3 µL her astar plaka yükleme tahlil bireysel wells ekleyin.
  2. Yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plaka mühür.
  3. Seyreltme plaka nükleaz pipetting 8 µL tarafından ücretsiz su 96 iyi plaka tüm kuyu hazırlamak. 2 µL güçlendirilmiş örnek 1:5 son seyreltme yapma seyreltme plakasına ekleyin.
  4. Mühür plaka ile yapıştırıcı ince tabaka, mix 10 için vortexing levha tarafından s ve sonunda alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin.
  5. Örnek yükleme mix master Mix 352 µL dikkatle örnek yükleme reaktif 35.2 µL ile karıştırılarak hazır olun. Örnek yükleme plaka karıştırmak için her şey 96 iyi plaka yükleme aliquoting 3.3 µL hazırlayın.
  6. 2.7 µL seyreltilmiş örnekten plaka yükleme örnek her kuyunun içine ekleyin.
  7. Yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plaka mühür.

6. yükleme mikrosıvısal çip

  1. Yeni 96 x 96 mikrosıvısal çip al. Alıcılar onları kapaklı bir şırınga üzerinde onlar hareket edebilir emin olmak için alay tarafından hazırlayın.
  2. Kabarcıklar şırınga kaldırın. Şırıngaların tam birim süre belgili tanımlık küçük parça 45 derece devirme ve Vana basarak her kapak için ekleyin. Çip IFC denetleyicisiyle Başbakan.
  3. Her plaka yükleme tahlil Wells her tahlil giriş 4.25 µL ile yükleyin. Bubbles kaçınmak. Kabarcıklar kuyuda görünüyorsa, bunları bir pipet ucu ile kaldırın.
  4. Her plaka yükleme örnek Wells her örnek giriş 4.25 µL ile yüklemeye devam, kabarcıklar önlemek ve kabarcıklar görünür, onları pipet ucu ile kaldırın.
  5. Çip ile IFC denetleyicisi yükleyin.
  6. Çip bile görünüyor ve tüm odaları yüklenmiş olan kontrol edin. Toz çip yüzeyden bant ile dokunarak kaldırın. Çip multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu çalıştırın.

7. Chip Multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu üzerinde çalışan

  1. Çip multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu yükledikten sonra örnek adını verin.
  2. ROX pasif boya ayarlayın. Tek sonda ve FAM-MGB floresans ayarlayın. 96 x 96 Standart v2 iletişim kuralı olarak kullanın. Çalışma başlatmak.
  3. Ne zaman koşmak kaldır çip tamamlanmıştır.

8. ön Analizi çip Çalıştır

  1. Verileri gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı yükle.
  2. Gen adlarını hem de hücre hücre ve gen düzenleri bir sekmeyle ayrılmış dosya yapıştırarak yük.
  3. Resim görünümü açın ve ROX boya seçin. Bütün wells ROX pasif boya var mı diye kontrol edin.
  4. Tüm amplifikasyon araziler ok, hiçbir sivri ( Şekil 3Eiçin benzer) ile pürüzsüz amplifikasyon eğrisi ile bakarsanız araştırmak.
  5. Tüm tek-hücreleri çivili denetimi tüm düzgün yüklenmiş emin olmak için RNA ifade olduğundan emin olun.
  6. Tüm hücreleri temizlik gen ifadesi var ve böylece düzgün sıralanmış emin olun.
  7. 10 ve 20 hücre doğrusallık denetimleri doğrusal amplifikasyon doğrulamak için yaklaşık 1 CT fark olduğundan emin olun.
  8. Kuzey kontrol örnekleri ifade olup olmadığını kontrol edin. İfade içinde Kuzey algılanırsa probları sonraki çalışmaları için genomik DNA algılamaz probları değiştirmeyi düşünün.
  9. Verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için csv dosyalarında verin.

9. tek hücreli analiz SCExV

Not: Bir aracı tanıtmak için mevcut20 tanıtım filmidir. Burada, protokol tanıttı denetimlerini kullanarak analiz yapmak nasıl kısa bir öneri sunulur.

  1. SCexV Web sitesi20' ye bağlayın.
  2. Dışa aktarılan CSV dosyaları yükleyin.
  3. Çivili bileşenini denetim RNA pozitif kontrol olarak seçti. Bir denetim RNA CT 25 yukarıda olan herhangi bir hücreyi kaldırın. Denetimin RNA medyan ifade verilerinize normalleştirmek.
  4. Tıklatın "burada analiz ->". Kuzey, notemplate, 10 ve 20 hücre denetimleri dışlama hücre seçeneğini kaldırın.
  5. Küme hücre kümeleri beklenen sayısı ile tercih kümeleme yaklaşımla. Analiz değerleri vermek.

10. Dizin sıralama Analizi

  1. FACS analiz yazılımı açın ve dizini oluşturulmuş örnekleri yükleyin.
  2. Komut dosyası Düzenleyicisi'ni açın ve kullanılabilir kod Çalıştır Quinn J. vd. 21
  3. FACS analiz yazılımı bir kapı her tek hücreler için yapılmış olmalıdır göre düzeni Düzenleyicisi'ni açın ve gruplandırma SCexV ("Sample_complete_Data.xls" adlı dosyayı kullanılabilir) üzerinden göre hücreleri renk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hızlı, kolay gerçekleştirilen ve son derece güvenilir açıklanan protokolüdür. Deneysel set-up bir bakış Şekil 1' de sunulmuştur. Tek-hücrelerin belirli hedef amplifikasyon, gen ifade ölçümleri ve ön analizler için sıralama gelen tüm iletişim kuralı, üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Bir örnek 96 astar ve ya bir kronik miyeloid lösemi (CML) hastadan 96 hücreleri veya 96 hücrelerden yaşlı eşlemeli sağlıklı kullanarak tek hücreli gen ifade analizi ön analiz ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, tek hücreli gen ifade analizi çeşitli hücre popülasyonları23heterojen tanımlamak için değerli bir ek haline gelmiştir. Ancak bu yöntemler hücre hücre sıralama derinlikleri ve damla-çıkışları tarafından karmaşık RNA sıralama teknolojileri gelişiyle teorik olarak bir olasılık bir hücrenin tüm transcriptome ölçmek için sağlar. Tek hücreli qPCR teklifler kritik genler nerede hücrelerin tümünü yüzlerce ifade hassas ve sağlam bir analizini kabul edilir benzer şekilde, teknik gürültü azaltm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser tıbbi araştırma, İsveçli çocukluk kanseri Vakfı, Söderberg Vakfı Ragnar ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı için hibe İsveçli Kanser Derneği, İsveçli Araştırma Konseyi, İsveç toplum tarafından desteklenmektedir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Klon: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Klon: 3G8
CD56 PECY5 Biolegend304608Klon: MEM-188
CD19 PECY5 Biolegend302210Klon: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Klon: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Klon: HIT3a
CD123 PECY5 Biolegend306008Klon: 6H6
CD235A PECY5BD İlaç559944Klonu GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Klonu: 561
CD38 APCBiolegend303510Klon: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Klon: 5E10
CD45RA BV421BD biyobilim560362Klonu: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Klon: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96 kuyulu u-alt PlakaVWR10861-564
SFEMKök hücre teknolojileri9650
Penisilin streptomisinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tüpü 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tüpüSarstedt72.690.001
CST boncuklarıBD
Accudrop BoncukBD3452496 & M parçacıkları 
Yapışkan film ŞeffafThermo scientific AB-1170
Yapışkan film FolyoTermo bilimsel AB-0626
96 kuyulu PCR plakasıAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tüpAxygenMCT-150-LC
T100 PCR döngüleyiciBioRad186-1096
%10 NP40Termo bilimsel 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitörü
CellsDirect Tek Adımlı qRT-PCR KitiInvitrogen11753-100
Neuclease içermeyen suInvitrogen11753-100CellsDirect kitinden
2x CellsDirectkitindenInvitrogen11753-100
SuperScript III RT / Platinum Taq KarışımıInvitrogen11753-100CellsDirect kitinden
Platinum  Tak  DNA polimerazinvitrojen10966026
TaqMan hücrelerinden BT'ye kontrol kitiİnvitrojen4386995
Xeno RNA kontrolüTaqMan hücrelerinden CT'ye kontrol kitindeninvitrojen4386995
20x kseno RNA kontrolü Taqman gen ekspresyon testiTaqMan hücrelerinden CT'ye kontrol kitindeninvitrojen4386995
96.96 Örnek/yükleme kiti ve mdash; 10 IFCFluidigmBMK-M10-96.96
96.96'dan2x Test Yükleme ReaktifiFluidigm
20x GE Numune Yükleme ReaktifiFluidigm96.96'dan Numune/Yükleme Kiti
Kontrol hattı sıvısı 96.96'danFluidigm
TaqMan Gen Ekspresyon Master MixUygulamalı Biyosistemler4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dinamik Dizi IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStar TreeStar
Fluidigm gerçek zamanlı PCR analiziFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher bilimselHs00356766_g1
ACEThermofisher bilimselHs00174179_m1
AHRThermofisher bilimselHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher bilimselHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher bilimselHs03024541_ft
BMI1Thermofisher bilimselHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher bilimselHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher bilimselHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher bilimselHs01084593_g1
CCNCThermofisher bilimselHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher bilimselHs01026535_g1
CCNFThermofisher bilimselHs00171049_m1
CCR9Thermofisher bilimselHs01890924_s1
CD10. MMEThermofisher bilimselHs00153510_m1
CD11aThermofisher bilimselHs00158218_m1
CD11c.ITAXThermofisher bilimselHs00174217_m1
CD123. IL3RAThermofisher bilimselHs00608141_m1
CD133. PROM1Thermofisher bilimselHs01009250_m1
CD151Thermofisher bilimselHs00911635_g1
CD220. INSRThermofisher bilimselHs00961554_m1
CD24. HSAThermofisher bilimselHs03044178_g1
NCOR1Thermofisher bilimselHs01094540_m1
CD26. DPP4Thermofisher bilimselHs00175210_m1
CD274Thermofisher bilimselHs01125301_m1
CD276Thermofisher bilimselHs00987207_m1
CD32. FCGR2BThermofisher bilimselHs01634996_s1
CD33Thermofisher bilimselHs01076281_m1
CD34Thermofisher bilimselHs00990732_m1
CD344. FZD4Thermofisher bilimselHs00201853_m1
CD352. SLAMF6Thermofisher bilimselHs01559920_m1
CD38Thermofisher bilimselHs01120071_m1
CD4Thermofisher bilimselHs01058407_m1
CD41. ITGA2BThermofisher bilimselHs01116228_m1
CD49f.ITGA6Thermofisher bilimselHs01041011_m1
CD56. NCAM1Thermofisher bilimselHs00941830_m1
CD9Thermofisher bilimselHs00233521_m1
CD97Thermofisher bilimselHs00173542_m1
CD99Thermofisher bilimselHs00908458_m1
CDK6Thermofisher bilimselHs01026371_m1
CDKN1AThermofisher bilimselHs00355782_m1
CDKN1BThermofisher bilimselHs01597588_m1
CDKN1CThermofisher bilimselHs00175938_m1
CEBPaThermofisher bilimselHs00269972_s1
CSF2RAThermofisher bilimsel
CSF3RAThermofisher bilimselHs01114427_m1
E2A. TCF3Thermofisher bilimselHs00413032_m1
EBF1Thermofisher bilimselHs01092694_m1
ENGThermofisher bilimselHs00923996_m1
EPORThermofisher bilimselHs00959427_m1
ERGThermofisher bilimselHs01554629_m1
FLI1Thermofisher bilimselHs00956711_m1
FLT3Thermofisher bilimselHs00174690_m1
FOXO1Thermofisher bilimselHs01054576_m1
GAPDHThermofisher bilimselHs02758991_g1
GATA2Thermofisher bilimsel
GATA3Thermofisher bilimselHs00231122_m1
GFI1Thermofisher bilimselHs00382207_m1
HES1Thermofisher bilimselHs01118947_g1
HLFThermofisher bilimselHs00171406_m1
HMGA2Thermofisher bilimselHs00171569_m1
HOXA5Thermofisher bilimselHs00430330_m1
HOXB4Thermofisher bilimselHs00256884_m1
ID2Thermofisher bilimselHs04187239_m1
IGF2BP1Thermofisher bilimselHs00198023_m1
IGF2BP2Thermofisher bilimselHs01118009_m1
IKZF1Thermofisher bilimselHs00172991_m1
IL1RAPThermofisher bilimselHs00895050_m1
IL2RGThermofisher bilimselHs00953624_m1
IRF8Thermofisher bilimselHs00175238_m1
ITGB7Thermofisher bilimselHs01565750_m1
KITIThermofisher bilimsel
Hs00174029_m1 Lin28BThermofisher bilimselHs01013729_m1
LMO2Thermofisher bilimselHs00153473_m1
LYL1Thermofisher bilimselHs01089802_g1
Meis1Thermofisher bilimselHs01017441_m1
mKi67Thermofisher bilimselHs01032443_m1
MPLThermofisher bilimselHs00180489_m1
MPOThermofisher bilimselHs00924296_m1
NFIBThermofisher bilimselHs01029175_m1
Notch1Thermofisher bilimselHs01062011_m1
PtenThermofisher bilimselHs02621230_s1
RAG2Thermofisher bilimselHs01851142_s1
RPS18Thermofisher bilimselHs01375212_g1
RUNX1Thermofisher bilimselHs00231079_m1
Spi1Thermofisher bilimselHs02786711_m1
Steril.IgHThermofisher bilimselHs00378435_m1
TAL1Thermofisher bilimselHs01097987_m1
THY1Thermofisher bilimselHs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2Thermofisher bilimselHs00958618_m1
VWFThermofisher bilimselHs00169795_m1
642412 Reaksiyon Karışımı Numune/Yükleme Kiti Örnek/Yükleme Kiti, , , , CSF1r Thermofisher bilimsel Hs00911250_m1 Hs00531296_g1 GATA1 Thermofisher bilimsel Hs00231112_m1 Hs00231119_m1 Shisa2 Thermofisher bilimsel Hs01590823_m1

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27(2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019(2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57(2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63(2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096(2013).
  15. Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921(2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320(2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
  21. Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
  22. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  23. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  24. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  25. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  26. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692(2017).
  27. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  28. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
  29. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre Gen EkspresyonuFACS ndeksli S ralamaK k H cre HeterojenitesiRT qPCR AnaliziAk SitometrisiH cre Y zey Mark rleriMikroak kan Gen EkspresyonuTemel Bile en AnaliziProspektif zolasyon

İlgili makaleler