İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan genomu dört bestrophin paralogs, yani BEST1, BEST2, BEST3 ve BEST4 kodlar. BEST1, BEST1 Gen tarafından kodlanmış olan bir Ca2 +-Cl- ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) ifade kanal (CaCC) aktif. BEST1 fizyolojik ve patolojik önemi olduğunu BEST1 gen 200'den fazla farklı mutasyonların genetik olarak en az beş Retina dejeneratif bozuklukları, en iyi vitelliform gibi bir yelpazede bağlantılı olmuştur aslında tarafından vurgulanır yaşa bağlı makula distrofi (en iyi hastalığı). Bu nedenle, Biyofizik bestrophin kanal tek molekül düzeyinde anlamak çok büyük önemi tutar. Ancak, saflaştırılmış memeli iyon kanalları almak kez zor bir görev olduğunu. Burada, BacMam baculovirus Gen aktarım sistemi ve onların arıtma benzeşme ve boyutu-dışlama kromatografi ile memeli bestrophin proteinlerin ifade için bir protokol raporu. Saf protein sonraki fonksiyonel ve yapısal analizleri, lipid bilayers ve kristalografisi elektrofizyolojik kayıt gibi kullanılmak üzere potansiyeline sahiptir. Önemlisi, bu boru hattı fonksiyonlar ve diğer iyon kanal yapıları çalışmaya adapte edilebilir.
Giriş
Bestrophins iyon kanallarının bakterilerden insanlar1olarak değişen türler ile korunmuş bir aileyiz. İnsanlarda, BEST1 gen, kromozom 11q12.3 üzerinde bulunan membran proteini Bestrophin-1 (BEST1) ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) hücreleri gözleri2,3 demiri membran ifade edilen kodlar. ,4. 585 ilk ~ 350 olan türler arasında son derece korunmuş ve onun transmembran bölge içeren, aminoasitler, oluşan bir CaCC insanlar1,5,6BEST1 görür. Ayrıc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. BacMam ifade Baculoviruses üreten
- BacMam vektör18 GFP 10 tarafından izleyen bir tütün Etch virüs (TEV) proteaz tanıma dizisi ile pEG istenen memeli bestrophin protein kodlama dizisi takın O'nun etiketi-protein C terminus x.
- Geçici ifade plazmid yapıştırıcı HEK293 hücreleri19,20,21,22,23transfect. Ifade 10 X veya 20 X büyütme, 488 nm uyarma kaynak ve 510 nm Emisyon filtre (Şekil 1A) Floresan mikroskop altında GFP-füzyon proteinin de....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Geçici transfected yapışkanlı HEK293 hücrelerinde (Şekil 1A) Floresan yoğunluğu öngörülen protein ifade düzey süspansiyon HEK293-F hücrelerdeki (Şekil 1B) için iyi bir göstergedir. Hedef protein iyi ifade veya HEK293 hücrelerde sonra geçici transfection yanlış yerelleştirilmiştir değilse, bu ifade yapısı değiştirme göz önünde bulundurun için tavsiye edilir (Örn., GFP etiket konumunu değiştirme veya mutasyon/truncations y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı ifade ve gelecekteki vitro analizler için kullanılmak üzere memeli bestrophin iyon kanalları arınma için yararlı bir potansiyel açıklar. FPLC aygıt boyutu-dışlama kromatografi için gerekli olmakla birlikte, bir şırınga pompa benzeşme Kromatografi bağlama, yıkama ve eluting de dahil olmak üzere tüm adımları için yeterli olur. Bir şırınga pompa itme çözümlerinde (şırınga) üzerinden sütun için kullanırken, hava kabarcıkları sütuna iterek önlemek için bahar yan altına koymak için önemlidir. Benzeş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Bilimsel | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Gliserol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| İmidazol | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Bilimsel | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Fenilmetilsülfonil florür | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol dereceli | Anatrace | D310S | |
| DDM | anagrade Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle ortamı | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spektrofotometresi | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Yüksek basınçlı homojenizatör | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap sütunu | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 sütunu | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 santrifüj filtre üniteleri | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 santrifüj filtre üniteleri | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN prekast jel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Termal Döngüleyici | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfeksiyon reaktifi | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vektörü | Vollum Enstitüsü'ndeki Gouaux laboratuvarından elde edilmiştir |
Kaynaklar
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
