Yöntem makalesi

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

DOI:

10.3791/57843

⸱

7 Eylül 2018

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B lenfositler, humoral bağışıklık içinde plasmablasts/plazma hücreleri tarafından salgılanan immünoglobulinler (Ig), Ayrıştırılan olarak da adlandırılan antikorlar, çeşitli mekanizmalar yoluyla patojenler istila karşı müthiş bir savunma sağlar. Aşı bir ana amacı hayati enfeksiyonları önlemek için koruyucu antijen spesifik antikorlar teşvik etmektir. Hem timus bağlı (TD) ve timus bağımsız (TI) antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretimi yanı sıra bellek B hücreleri yardımıyla nesil neden olabilir antijen sunan hücreler (ZPT) tarafından sağlanan. Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak farelerde karakterize için bir protokol açıklayın. Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde mayi (IP) aşılama ile hapten Birleşik modeli antijenleri TNP-KLH (şap içinde) ve TNP-polisakkarit (PBS) içinde tarafından sırasıyla elde edildi. TD bellek yanıt ikna etmek için 3 hafta sonra aynı antijen/adjuvan ile ilk aşılama TNP-KLH bir alttan yukarıya ittirmek aşı şap içinde verilir. Fare sera farklı zaman noktalarda öncesi ve sonrası aşılama hasat. Serum Ig düzeyleri toplam ve TNP özgü antikorların Ig izotip özel sandviç ve dolaylı ELISA, sırasıyla kullanarak daha sonra sayılabilir. Doğru her Ig izotip serum konsantrasyonu ölçmek için örnekleri uygun standart eğrileri doğrusal Aralık içinde sığacak şekilde seyreltilmiş gerekir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz sürekli olarak güvenilir sonuçlar yüksek özgüllük ve hassasiyet elde etmiş olursunuz. Akış Sitometresi, dalak B hücreleri ve immunohistokimyasal vitro kültür gibi diğer tamamlayıcı Yöntemler ile birlikte kullanıldığında (IHC) boyama, bu iletişim kuralını araştırmacılar antikor kapsamlı bir anlayış kazanmak izin verir Yanıt verilen bir deneysel ortamda.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B lenfositler humoral bağışıklık asıl Player'da ve memelilerde aynı zamanda immünglobulin (Ig)1,2olarak adlandırılan antikorlar, üretebilen tek hücre tipi vardır. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar patojenler Nötralizasyon, opsonizasyonla ve kompleman aktivasyonu, koruyucu bağışıklık3' e lider gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla istila karşı müthiş bir savunma sağlar. B hücreleri tarafından antikorların salgısının sadece normalde iki ayrı3sinyalleri gerektiren tam harekete geçirmek belirli B hücrelerinin sonra elde edilir. Sinyal 1 antijen (Ag) doğrudan bağlama tarafından belirli naif B hücreleri3yüzeyinde ifade B hücre reseptörü (BCR) için geçirilir. Sinyal 2 kaynağına bağlı olarak, B hücre aktivasyonu timus bağımlı (TD) veya timus bağımsız (TI)3,4bölünmüş olabilir. TD antijen yanıt olarak sinyal 2 CD154, co-stimulatory reseptör B hücreleri1,2,3ifade CD40 ligand hızlı harekete geçirmek soydaş CD4 T yardımcı (TH) hücreleri tarafından sağlanır. TI antijen yanıt olarak sinyal 2 Toll benzeri reseptörler ya nişan gelir (TLR 1 türü söz konusu olduğunda TI Ag) veya geniş BCRs ile ilişkilendirerek (tip 2 durumunda TI Ag)3,4B hücreleri. Tip 1 TI (TI-1) antijenleri TLRs, bakteriyel lipopolisakkaritler (LPS), viral RNA'ların ve mikrobiyal CpG DNA4,5gibi bir mikrobiyal ligandlar vardır. Tip 2 TI (TI-2) antijenleri son derece tekrarlayan yapıya sahip ve uzun süreli ve kalıcı birden çok BCRs4,6/ cross-linking tarafından için B hücre sinyallemesi teslim edebiliyoruz. Pnömokok polisakkaritler ve hapten Birleşik polisakkarit6,7TI-2 antijenleri ile ilgili örnekler içermektedir. TD ve TI antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretim hücreleri (ZPT) dendritik hücreler (DC)1 gibi sunulması antijen tarafından sağlanan yardımı ile neden olabilir ,2,3. Ayrıca, TD ve TI antijenleri bellek yanıtları ZPT yardımıyla ikna edebiliyoruz, ama TD antijenleri bellek B hücre üretimi3,8inducing verimlidir.

Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde hapten Birleşik modeli antijenleri 2,4,6-trinitrophenyl-anahtar deliği vantuzlu hemocyanin (TNP-KLH) ve TNP-polisakkarit (bağımsız çok dallı, mayi (IP) aşılama tarafından elde edildi ve yüksek-kütle), sırasıyla9,10,11. TD antijenleri genellikle bir adjuvan ile antikor12üretimini artırmak için kullanılır. Burada bizim iletişim kuralında, TNP-KLH şap, yaygın olarak kullanılan adjuvan aşılama çalışmaları12ile enjekte edilir. Tam ya da eksik Freund's adjuvan (CFA veya IFA), kullanılabilir adjuvan diğer örnekler monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvan) ve KSY oligodeoxynucleotides, vb13, 14. sera TNP özgü antikor sayısal kullanarak Ig izotip özgü enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)9,10, ve bağışıklama sonra fare sera farklı zaman noktalarda hasat 11.

ELISA yaygın ve Biyomedikal araştırma15,16analitik bir araç olarak tıpta bir tanı aracı olarak kullanıldığı plaka tabanlı bir tahlil olduğunu. Algılamak ve antikorlar, hormonlar, sitokinler, kemokinler ve çeşitli antijenleri, vbdahil olmak üzere analitler ölçmek için kullanılır. ELISA doğrudan, dolaylı, sandviç ve rekabetçi ELISA15,16da dahil olmak üzere, birkaç farklı biçimlerde gerçekleştirilebilir. Genel olarak, birincil bir antikor ile inkübe genellikle bir 96-şey microtiter plaka, sağlam bir yüzeye antijen immobilizasyon içerir. Kuluçka sonra ilişkisiz antikor yıkadı. Bir doğrudan ELISA, birincil antikor doğrudan hangi gibi bir sinyal algılama aracı tarafından algılanan bir görünür renk değişikliği vermeye chromogenic bir substrat ayırmak bir enzim için (genellikle horseradish peroksidaz veya alkalen fosfataz), Birleşik bir Spektrofotometre15,16. Bir enzim bağlı ikincil antikor birincil antikor bağlamak için kullanılan, buna ek olarak, o zaman bu bir dolaylı ELISA15,16kabul edilir. Dolaylı ELISA daha duyarlı15,16ise doğrudan ELISA daha hızlıdır. Bir sandviç ELISA, tabakları faiz örneklerde antijen hareketsiz için kullanılan bir "yakalama" antikor ile kaplı olan ve daha sonra yakalanan antijen bir doğrudan veya dolaylı şekilde15, başka bir "algılama" antikor tarafından tespit edilebilir 16. sandviç ELISA sunar yüksek özgüllük beri antijen iki farklı antikor-antijen tarafından algılanır. Rekabetçi bir ELISA, rekabet örnek antijen ve plaka bağlı antijen için birincil antikor bağlanma arasında kurulan ve örnek antijen konsantrasyonu substrat sinyalini azalma ölçerek sonra sayılabilir 15 , 16. rekabetçi ELISA yukarıda belirtilen doğrudan veya dolaylı biçim kullanılarak yapılır ve tek epitope15,16ile küçük antijenleri tespiti için yararlıdır.

Electrochemiluminescence (ECL) tahlil ve yüzey plasmon rezonans (SPR) tahlil17, antikorların ölçümü için alternatif teknikleri radyo-immunoassay (RIA) içerir. RIA ilk immunoassay yüksek özgüllük ve radiolabeled kimyasalları18,19kullanarak hassasiyeti ile bu önlemleri bir antijen (veya antikor) varlığını gelişmiş olmasıdır. Ancak, kaygılar radyoaktif toksisite, bertaraf maliyeti, raf ömrü ve radyoaktif malzeme ile çalışmak için özel lisans nedeniyle ELISA daha iyi bir ve20,21ortak için daha uygun bir teknik kullanır. ECL olduğunu hangi chemiluminescent reaksiyonlar istikrarlı öncüleri bir elektrot yüzeyinde büyük ölçüde reaktif türler oluşturmak için elektrik kullanarak başlatılır ve analitler miktarını ölçmek için kullanılan son derece hassas bir tahlil (antijenleri gibi veya antikorlar)22. Ancak, ECL özel bir araç gerektirir ve böylece kadar geniş ELISA23kullanılmaz. SPR olduğunu ligandlar bağlama ölçmek için kullanılan bir doğrudan tahlil (e.g., antikorlar) molekülleri immobilize (e.g., antijenleri) bir sensör üzerinde yüzey24chip. SPR etkileşimleri çok özellikle gerçek zamanlı olarak algılar ve ELISA olduğu gibi etiketli reaktifler kullanımını gerektirmez. Ancak, SPR Ayrıca özel bir ekipman gerektirir ve ELISA17daha düşük duyarlılık vardır. Alternatif yöntemleri kısıtlamaları göz önüne alındığında, ELISA amacımız bu iletişim kuralı için en uygun ve uygun teknik olduğunu. Burada, biz sandviç ELISA toplam Ig izotip düzeyleri Analizi ve antijen spesifik IG isotypes analizi için dolaylı ELISA işlemleri için nasıl kullanılacağını açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı Rutgers Üniversitesi Kurumsal hayvan Araştırma Etik Komitesi kuralları izler. Bütün fareler NIH yönergelere uygun olarak ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir hayvan iletişim kuralı altında kullanılır.

1. hazırlık fareler ve saf fare Sera topluluğu

  1. Bütün fareler bağışıklama deneyler için belirli bir patojen ücretsiz hayvan tesisi tutun.
  2. Kullanım cinsiyet eşlemeli, Genç Yetişkin (8-12 hafta yaşlı) nakavt ve littermate aynı veliler ve aşılama çalışmaları için kümesler paylaşmak fare kontrol eder.
  3. Aşılama ve Şekil 1' de gösterildiği gibi serum koleksiyonu zamanlamaları planlayın.
  4. Saf serum her fare bağışıklama önce 7 gün (-7 gün) hasat. 4. adımda aşağıda ayrıntılı olarak retro-orbital kanama ve serum hazırlama yordamları izleyin.

2. TNP-polisakkarit (TI antijen) ve TNP-KLH (TD antijen) hazırlanması

  1. İyice 0,5 mg/mL yapmak için steril PBS (pH 7,4) antijen tozlar TNP-polisakkarit stok ve 1 mg/mL TNP-KLH hisse senedi çözümleri geçiyoruz. Aliquot her antijen 0.5 mL/Tube steril microfuge tüpler içine çözüm stok ve uzun süreli depolama için-80 ° C'de aliquots tutun. Birden çok donma ve antijen aliquots tezcan kaçının.
  2. Enjeksiyon günde TNP-polisakkarit hacmi hesaplamak (50 µg/100 µL/fare) veya TNP-KLH (100 µg/100 µL/fare) enjekte edilir fareler sayısına göre gerekli. Uygun sayıda TNP-polisakkarit veya TNP-KLH aliquots (RT) Oda sıcaklığında erimek.
  3. TNP-KLH enjeksiyon için ilk final konsantrasyonu 10 mg/ml steril PBS 3 cilt ile şap adjuvan (40 mg/mL) oranında seyreltin. Şap adjuvan karışımı seyreltme önce iyi askıya alınmış olduğundan emin olun.
  4. 10 mg/mL şap adjuvan Bulamaç adım 2.3 ve çözdürülen TNP-KLH çözüm (1 mg/mL) eşit hacmi 5 mL polipropilen boru birleştirmek, iyice karıştırın ve 30 dk. bu TNP-KLH/şap mix taze enjeksiyon önce Prepare için 37 ° C'de kuluçkaya.

3. bağışıklama farelerin

  1. Mayi (IP) enjeksiyon TNP-polisakkarit veya TNP-KLH/şap 1 mL insülin şırınga Biyogüvenlik kabine ile fareler bağışıklık için gerçekleştirin. Yaklaşık 30 ° açı tercihen çeyreğinde alt sağ iç organları içine enjeksiyon önlemek için her fare iğne yerleştirin.
  2. TNP-polisakkarit ı.p. 100 µL fare başına gün 0 TI Ag bağışıklama (Şekil 1A) için enjekte et.
  3. I.p. 200 µL (taze hazırlanan adım 2.4) TNP-KLH/şap Mix fare başına gün 0 TD Ag bağışıklama için enjekte et. Alttan yukarıya ittirmek aşı olarak günde 21 enjeksiyon aynı bellek çalışmaları (Şekil 1B) için yineleyin.
  4. Enjeksiyon, ardından her fare onun kafes için dönün ve enjekte fareler belirli patojen arındırılmış durumda tutun.

4. retro-orbital kanama ve Serum hazırlık

  1. Hasat fare sera farklı zaman noktalarda: TNP-polisakkarit bağışıklama için toplamak fare sera günü -7 ve 7 (resim 1-A); TNP-KLH/şap aşılama için fare sera günü -7, 7, 14 ve 28 (Şekil 1B) toplamak.
  2. Retro-orbital için kanama, her fare ile %5 isoflurane Biyogüvenlik kabini251-2 min için anestezi. Her fare yeterli anestezi sağlamak için pedal refleks gerçekleştirin.
  3. Böylece geri dışarı yuva25göz küresi protrudes göz küresi çevresindeki deri çekerek başparmak ve işaret parmağı ile bir elinde imzalat fareyi tutun. Göz çukuru göz küresi25altında iç köşesine 45 °'in bir açıyla bir sigara heparinized Pasteur pipet veya kılcal tüp takın.
  4. Hafif aşağı doğru basınç uygulayın ve pipet veya hafifçe damar içine kırmaya ve 150-200 µL kan pipet veya tüp toplamak için tüp döndürün. Hemen bir steril 1.5 mL microfuge tüp kan aktarmak ve fareyi kurtarmak için onun kafes dönmek.
  5. Kan örnekleri RT için 1-2 h koagüle oturup izin.
  6. Pıhtılaşmış kan örnekleri, 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Açık serum kan pıhtısı üstüne yeni bir steril 1.5 mL microfuge tüp aktarın.
  7. Adımı 4,6 kalan kan pıhtısı kaldırıp açık serum toplamak için bir kez daha yineleyin.
  8. Aliquot içine steril 1.5 mL microfuge tüpler 50 µL/Tube, serum ve sera-80 ° C'de depolayın
  9. Her göz için en az iki kere bütün deneyin bled için farklı zaman noktalarda kanama göz alternatif. Kanama terminal, her fare ötenazi önce ilâ 1 mL kan toplamak. Fare ile % 5 CO2 servikal çıkığı tarafından takip ötenazi.
    Not: Dalak B hücreleri akış sitometrik analizleri ve vitro kültür çalışmaları için hasat edilebilir. Ayrıca her fare genotip doğrulamak için genomik DNA'ları splenocytes hazırlayın.

5. fare Ig izotip özel ELISA

  1. Arabellekleri ve çözümleri ELISA önce hazırlayın.
    1. Kaplin arabelleği (PBS, pH 7,4) 500 mL hazırlayın.
    2. 500 mL yıkama çözeltisi hazırlamak (PBS-T (% 0.05 arası 20), pH 7,4).
    3. 100 mL engelleme arabelleği hazırlamak (PBS, pH 7.4, içinde % 1 BSA 4 ° C'de depolanan).
    4. 1 L substrat arabelleği hazırlamak (1 M diethanolamine, pH 9,8 (H2O, 10 M HCl kullanarak ayarlanır pH 1 litre diethanolamine 97 mL) ve 0,5 mM MgCl2). Substrat arabellek gelen ışık şişe alüminyum folyo ile sarma tarafından korumak. 4 ° C'de mağaza
    5. Durmak eriyik (3 M NaOH) 100 mL hazırlayın.
  2. ELISA plakaları kat:
    1. Toplam serum Ig izotip ELISA için yakalama poliklonal keçi Anti-fare Ig izotip özgü 10 µg/mL ile 96-şey IMMUNO plakalar ceket (M, G1, G2a, G2b, G3, A veya E) Abs içinde kaplin arabellek (PBS) 100 µL/iyi yönü.
    2. TNP özgü Ig izotip ELISA için 96-şey IMMUNO pilakalar ve 10 µg/mL TNP(38)-BSA PBS içinde 100 µL/iyi, kat.
    3. Yüksek afinite TNP özgü Ig izotip ELISA için 96-şey IMMUNO pilakalar ve 10 µg/mL TNP(3)-BSA PBS içinde 100 µL/iyi26kat. 4 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya.
  3. Kaplama kuluçka sonra 2 kez 200 µL/iyi PBS-t. ile tabak yıkama Yıkama arabellek atın ve leke kuru (her tabak kağıt havlu bir yığın üzerinde baş aşağı dokunun) levhalar her yıkama sonra.
  4. Tabakları blok: 200 µL/iyi engelleme eklemek tampon (PBS % 1 BSA) kaplamalı kalıplara ve plakalar RT. 1 h için kuluçkaya
  5. Tabakları engelleme iken, Ig izotip standartları ve engelleme arabelleği serum örneklerinde ayrı, tedavi edilmemiş 96-şey plaka, 150 µL/iyi dilutions hazır olun.
    1. Başlangıç standart toplama (St01) 250 ng/mL Ig izotip standartları hazırlamak ve 7-10 1:2 seri dilutions IG standartları yapmak (St02 St07 veya St10, Şekil 2A).
    2. 1: 100 veya 1:500 seyreltme, örnekleri başlangıç seyreltme faktörü ve 3 veya 4 1:10 toplam Ig izotip için seri dilutions veya her serum örneği (Şekil 2A) TNP özgü Ig izotip için 1:5 seri dilutions yapmak fare serum hazırlamak. IgE ELISA, fare serum numuneleri, 1:2 seyreltme faktörü başlangıç seyreltme olarak hazırlamak ve her serum örneği 1:5 seri dilutions 3 olun.
  6. Engelleme sonra adım 5,4 üç kez 200 µL/iyi PBS-t ile tabak yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.
  7. 100 µL/iyi seyreltilmiş Ig izotip standartları (yakalama ve algılama Abs için uygun) ve seyreltik serum numuneleri adımından 5.5 5.6 adımda hazırlanan tabak aktarın. Standartlar ve örnekleri 4 ° C'de pilakalar gecede kuluçkaya.
  8. 3 kez ile 200 µL/iyi PBS-t tabak yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.
  9. Her plaka 100 µL/iyi bir uygun alkalen fosfataz (AP) 10 µg/mL eklemek-Konjüge izotip özgü keçi Anti-fare IG (M, G1, G2a, G2b, G3, A veya E) engelleme arabellekte seyreltilmiş Abs.
  10. AP Birleşik Abs RT. 1-2 h ile plakalar kuluçkaya IgE tespiti için plakalar için 1-2 h 37 ° C'de kuluçkaya
  11. İki tablet, 5 mg fosfataz substrat 10 ml substrat arabellek çözülerek 1 mg/mL substrat çözeltisi hazırlamak.
  12. Her plaka 5 kere ile 200 µL/PBS-t iyi yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.
  13. 100 µL/kuyuya substrat çözeltisi, her plaka ekleyin. Genellikle sadece birkaç dakika sürer RT geliştirmek tepki sağlar.
  14. 405 her plaka okuma nm Mikroplaka Okuyucu ile ilişkili yazılımı kullanarak.
    1. Tıkırtı ""Lm1"dalga boylarında ayarlamak içinayarları", "405 nm" ve "Tamam" düğmesini tıklatın.
    2. "Şablon"boş"wells,"standartlar"wells ve 96-şey plaka kuruluma göre"Bilinmeyen"wells atamak için" seçeneğini tıklatın.
    3. "Standartlar" wells için "serisi"İlk örnek"olarak"St01"küme,"Başlamak--dan"üst"seçin ve "çoğaltır" "2" olarak ayarlamak için "'ı tıklatın. "Örnek Descriptor" adlı ve "Standart değeri" giriş: "birim"olarak"ng/mL" seçin, "Başlangıç değeri" "250" olarak ayarlamak, "adım" "2" olarak ayarlayın. "Tamam" düğmesini tıklatın.
    4. "Ne zaman standart ulaştığı en konsantre bir optik yoğunluk (OD) ~ 1 plaka okumak için oku" seçeneğini tıklatın.
    5. "Dosya" menüsünü tıklayıp "dosyayı kaydetmek için"Kaydet' i tıklatın.
    6. "En yoğun standart OD405 ~ 1.5, 2 ve 2.5, sırasıyla yaklaştığında plaka tekrar okumak için,Oku"'ı tıklatın.
  15. Reaksiyon 25 µL/iyi 3 M NaOH ekleyerek durdurmak. Bir tabak için adımları 5.12-5,15 tamamlamak.
  16. Mikroplaka Okuyucu ile ilişkili yazılım kullanarak ELISA verileri çözümleyin:
    1. Okuma dosyaları Ig izotip standartlarının OD405 değerlerini denetleyin ve ayrıntılı veri analizi için standartlar iyi doğrusal dizi ile uygun bir okuma seçin.
    2. Standart eğriler çizmek için 4-parametre uygun programı seçin. Co-verimli > 0,98 iyi veri kalitesi sağlamak için gerekli olan standart eğri (R2), kontrol edin.
    3. OD405 değerleri her örneğinin giderek artan bir seyreltme faktörler azaltmak olup olmadığını kontrol edin. Tüm seyreltilmiş örnek wells konsantrasyon "Bilinmeyen" tıklayarak geri.
    4. Her örnek OD405 ile uygun bir kuyu Ig izotip standart eğri konsantrasyon hesaplaması için doğrusal aralığını seçin.
    5. Serum Ig izotip toplama formülü kullanarak her örneğinin hesaplamak: serum Ig konsantrasyon seçili iyi konsantrasyon seyreltme faktörü x =.
  17. Grafikleri çizmek ve istatistiksel analizleri uygun yazılım9,10,11kullanarak gerçekleştirebilirsiniz. Dikey scatter araziler serum Ig izotip düzeyleri aynı zamanda noktada IG yanıt-e doğru karşılaştırmak için yapmak. TD bellek yanıt çalışmaları için önce ve sonra alttan yukarıya ittirmek aşı Ig izotip yanıt-e doğru incelemek için zaman-ders yanıt eğrileri olun. Hata çubuklarını örnekleri her grubunun standart sapma (SD) göstermek için kullanın. Ig izotip yanıt farelerin iki genotip arasında karşılaştırmak için istatistiksel anlamlılık belirlemek için unpaired t test için iki-ölçütlü veri kullanın. P değeri < 0,05 olarak önemli ölçüde farklı ayarla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık sisteminin, TRAF3, TI ve TD Ig izotip yanıt-e doğru9,10,11kritik bir regülatör rollerini araştırmak için bu protokolü kullanmış. TRAF3 doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık reseptörleri TNF reseptör süper dahil olmak üzere, bir dizi sinyal iletimi, Toll benzeri reseptörler ve T hücre reseptör/CD28, diğerleri arasında27

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterizasyonu için protokol açıklayın. Bu protokol başarılı uygulama ELISA tahlil tabaklar, bağışıklama Ags, fare Ig izotip özel antikorlar ve standartlar dahil olmak üzere Tablo 1' de belirtilen malzeme kullanımı gerektirir. Doku kültürü tedavi plakaları ELISA için kullanmamak için özen gösterilmelidir. Dilutions standartları ve serum numuneleri ayrı tedavi edilmezse levha (yuvarlak-alt) yapılır ve ELISA kalıplara ekledi. Bu iletişim kuralın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada sağlık hibe R01 CA158402 Ulusal Enstitüleri (s. Xie) tarafından desteklenen ve R21 AI128264 (s. Xie), Savunma Bakanlığı'nın izni W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), bir Pilot Ödülü gelen Kanser Enstitüsü New Jersey Grant numarası P30CA072720 ile Ulusal Kanser Enstitüsü (s. Xie), Busch Biyomedikal Grant (s. Xie), Victor Stollar Bursu (A. Lalani) ve bir Anne B. ve James B. Leathem Bursu (S. Zhu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VersaMax Ayarlanabilir Mikroplaka OkuyucuMDS Analitik TeknolojilerVERSAMAXPlakaları okumak için ekipman
SOFTmax PRO 5.3 MDSAnalitik TeknolojilerSOFTmax PRO 5.3Plaka okuyucu için yazılım
GraphPad Prizma GraphPadPrismGrafik ve istatistik yazılımı
TNP-AECM-polisakkarit (FICOLL)Biyoarama TeknolojileriBağışıklama için F-1300-10A TI Ag
TNP-KLHBiyoarama TeknolojileriT-5060-5Bağışıklama için A TD Ag
TNP(38)-BSABiyoarama TeknolojileriT-5050-10 (konjugasyon oranı: 38)TNP'ye özgü ELISA için Kaplama
Ag TNP(3)-BSABiyoarama TeknolojileriT-5050-10 (konjugasyon oranı: 3)Yüksek afiniteli TNP'ye özgü Ig
Imject Şap için Kaplama AgFisher Bilimsel PI-77161Bağışıklama için şap adjuvanı
Falcon Polipropilen tüplerFisher Scientific 14-959-11ATNP-KLH / şap
BD İnsülin ŞırıngasıFisher Scientific'in inkübasyonu için 14-829-1BFarelerin i.p. enjeksiyonu için
Immuno 96 Kuyulu Plakalar, Düz TabanlıFisher Scientific 14-245-61ELISA
İşlenmemiş 96 Kuyucuklu Mikroplakalar için, Yuvarlak TabanlıVWR82050-622Standartların ve numunelerin seri seyreltmeleri için
Fosfataz substratı, 5 mg TabletlerSigmaS0942-200TABAP substrat
DietanolaminVWRIC15251690AP substrat tamponunun bir bileşeni
Keçi anti-fare IgMSouthernBiotech1020-01Fare için Ab'yi yakalayın IgM
Keçi anti-fare IgG1SouthernBiotech1070-01Fare IgG1 için Ab'yi yakalayın
Keçi anti-fare IgG2aSouthernBiotech1080-01Fare için Ab'yi yakalayın IgG2a
Keçi anti-fare IgG2bSouthernBiotech1090-01Fare için Ab'yi yakalayın IgG2b
Keçi anti-fare IgG3SouthernBiotech1100-01için Ab'yi yakalayın fare IgG3
Keçi anti-fare IgASouthernBiotech1040-01Fare IgA Keçi
anti-fare IgESouthernBiotech1110-01Fare IgE
AP-Keçi anti-fare IgMSouthernBiotech1020-04Fare IgM
AP-Keçi anti-fare IgG1Algılama Ab SouthernBiotech1070-04Fare IgG1 için Algılama Ab
AP-Keçi anti-fare IgG2aSouthernBiotech1080-04Fare IgG2a için Algılama Ab
AP-Keçi anti-fare IgG2bSouthernBiotech1090-04Fare IgG2b için Algılama Ab
AP-Keçi anti-fare IgG3SouthernBiotech1100-04Fare IgG3
AP-Keçi anti-fare IgAAlgılama Ab SouthernBiotech1040-04Fare IgA
AP-Keçi anti-fare IgESouthernBiotech1110-04Fare
IgE Fare IgM standardıBD Biosciences553472TNP'ye özgü IgM, Klon için Algılama Ab; G155-228
Fare IgG1 standardıBD Biosciences554054TNP'ye özgü IgG1, Klon  107.3
Fare IgG2a standardıBD Biosciences556651TNP'ye özgü IgG2a, Klon  G155-178
Fare IgG2b standardıBD Biosciences554055TNP'ye özgü IgG2b, Klon  49.2
Fare IgG3 standardıBD Biosciences553486KLH'ye özgü IgG3, Klon  A112-3
Fare IgA standardıBD Biosciences550924Mineral yağ kaynaklı IgA, Klon  MOPC-320
Fare IgE standardıBD Biosciences557079TNP'ye özgü IgE, Klon  C38-2
için için için Algılama Ab Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12(2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7(2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719(2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997(2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Timus Ba ml mm noglobulinFare Serum Analizizotip Spesifik ELISATNP KLH mm nizasyonuTNP polisakkarit mm nizasyonuRetro orbital Kan AlmaMikroplaka OkuyucuAk Sitometrisi

İlgili makaleler