Tek Sensillum kayıtları Locust Palp Sensilla Basiconica için

Hayvanlar bir dizi eksojen kimyasal ipuçları anlamda chemosensory organları gelişmiştir. Böcekler, anten ve dokunacı en önemli chemosensory organları vardır. Bu organların chemosensory saç chemosensory sensilla olarak adlandırılan, çeşitli kıllar içinde chemosensory nöronlar (CSNs) tarafından innervated. CSNs chemosensory sensilla içinde kimyasal uyaranlara üzerinden sinyal iletimi için daha sonra merkezi sinir sistemleri^1,2kadar^{,3 transfer edilen elektrik potansiyelleri ile belirli kimyasal ipuçlarını tanımak} .

CSNs hızlı çeşitli chemosensory reseptörleri [Örneğin, propil reseptörleri (ORs)], ionotropic reseptörleri (IRS) ve chemosensation ^{farklı türleri ile ilişkili eksojen kimyasal cues kodlamak onların membranlar üzerinde tat reseptörleri (gr) 4,5,6}. CSNs karakterizasyonu hücresel ve moleküler mekanizmaları böcek chemoreception için aydınlatma anahtarıdır. Şimdi böcek CSNs dahil olmak üzere birçok böcek antennal sensilla karakterizasyonu⁷sinekler için tek sensillum kaydı (SSR) yaygın olarak kullanılan bir teknik, pervane⁸, böcekleri⁹, yaprak bitleri¹⁰, çekirgeler¹¹, ve karıncalar¹². Çünkü onların sensilla belirli yapıları yapmak ancak, birkaç çalışmalar bir SSR böcek dokunacı^{13,14,15,16,17}' ye, uyguladığınız bir elektrofizyolojik kayıt zor¹⁸.

Çekirge (düz kanatlılar) sürüleri kez ciddi ürün hasar ve ekonomik kayıp¹⁹neden. Dokunacı çekirge^{20,21,22,23,24}gıda seçiminde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Chemosensory sensilla iki tür bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) tarafından incelenmiştir. Genellikle, 350 sensilla chaetica ve 7-8 sensilla basiconica her kubbe locust dokunacı¹⁸gözlenir. Sensilla chaetica sensilla basiconica var ise uçucu kimyasal cues algılama bir koku alma işlevi, geçici olmayan kimyasal yardımlar anlamda tat sensilla vardır.

Locust dokunacı üzerinde sensilla basiconica (ca. 12 µm), saç yuva çapları bu sensilla chaetica daha çok daha büyük (ca. 8 µm)^18,25. Dokunacı üzerinde sensilla basiconica cuticular duvar antennal sensilla¹⁸çok kalın. Buna ek olarak, palp kubbesi sıvı içeriği son derece esnek bir manikür içinde vardır. Bu özellikleri bir elektrot ve iyi elektrofizyolojik sinyalleri bir edinimi bir nüfuz için antennal sensilla daha zor olduğu anlamına gelir. Bu yazıda, detaylı ve son derece etkili SSR Protokolü locust palp sensilla basiconica için bir video ile sunulur.

1. Araçlar ve böcek hazırlanması

1. Tungsten elektrotlar ve uyaranlara çözümleri hazırlanıyor
   1. Bir yeni tungsten tel (0,125 mm çap, 75 mm uzunluğu) bir micromanipulator içine düzeltmek ve 10 V stereomicroscope (40 X büyütme) altında yaklaşık 1 dakika için bir güç kaynağı tarafından sağlanan % 10 (w/v) Sodyum nitrit (NaNO₂) çözümde bir şırınga keskinleştirmek.
   2. Bilenmiş tungsten tel art arda % 10 NaNO₂ çözüm, 4 mm 5 V < 1 dk (Şekil 1A)'inde içine daldırma.
   3. Locust palp koku sensillum (Şekil 1B) kütikül nüfuz için iyi olana stereomicroscope altında sık bilenmiş tungsten ipucu çapını inceleyin.
   4. Uyarıcı çözümleri hazırlayın. Her kimyasal uyarıcı madde madeni yağ içinde biri oranında seyreltin. 1-nonal ve nonanoic asit, %10 dilutions oranında seyreltin. E-2-hexenal ve diehydroabietinal 10^-2, 10^-3, 10^-4ve 10^-5oranında seyreltin.
   5. Pasteur uyaranlara taşıma tüpleri hazırlayın: filtre kağıt şeritler (2 cm uzunluğunda, 0,5 cm genişlik) Pasteur tüpler içine yerleştirin, seyreltilmiş uyarıcı çözümleri (her 10 µl) filtre kağıt şeritler eklemek ve pipet ipuçları (1 ml) Pasteur tüplerini takın.
2. Böcek hazırlamak
   1. Bağıl nem oranı % 60, 28-30 ° C sıcaklık ve photoperiod 18:6 h (ışık: karanlık) kalabalık koşullarda taze buğday fidan ile arka çekirge (Locusta migratoria). 1 - için 3-bayat 5 seçin^{locust perileri biçim ve iyi makas ile kayıt yaparken herhangi bir girişimi engellemek için antenleri kaldırın} .
3. Locust üst palp tutucu hazırlanıyor
   1. Bir cam slayt (25 mm x 75 mm) üst palp tutucu (mil) temel olarak kullanın. Çift taraflı yapışkan bant ile cam slayt köşesinde bir plastik parça (1 mm içinde yükseklik, genişlik, 35 mm uzunluğu 10 mm) ekleyin ve nihayet bir cam (18 x 18 mm) plastik parça üzerine çift taraflı yapışkan bant ile düzeltmek. Kırmızı lastik bant cam üzerine küçük bir parçası bir kaymaz katman yer. Plastik parça ve kapak cam locust palp için platform oluşturmaktadır. Platform yüksekliği yaklaşık 1.5 mm olduğunu.
   2. 1.5 mm iç paralel olarak bir tungsten tel (0,125 mm çap, 36 mm uzunluğu) yüklemek kenar-in belgili tanımlık peron. Tel platformu üzerine iki ucu çift taraflı yapışkan bant ile düzeltmek.

2. Locust üst dokunacı hazırlanması

1. Bir santrifüj tüpü (1,5 ml) dikey olarak yarıya ve alt kesti. Locust hazırlanan tüpün içine yerleştirin. Ventral bölge ve maruz locust Başkanı bırakın. Montaj cam kaymak için çift taraflı yapışkan bant ile (Şekil 2A) düzeltmek.
2. Sağ üst palp platformu üzerine çek.
3. Tungsten kabloyu palp dördüncü kesim sok. Tungsten tel, 2 mm üst palp (Şekil 2A ve 2B) üzerinden her tarafında yapışkan macun koyun.

3. tek Sensillum kayıtları

1. Locust üst palp hazırlık düşük büyütmede (100 X) mikroskop altında bir yer. Palp kayıt elektrodu (Şekil 3A) dikey olana hazırlık konumunu ayarlamak.
2. Referans elektrot (tungsten elektrot) bir micromanipulator kullanarak locust göz içine yerleştirin. Micromanipulator (Şekil 3B ve 3 C) ile üst palp yakın kayıt elektrodu (tungsten elektrot) taşıyın.
3. Koku teslim aygıt üst palp (Şekil 3B) yaklaşık 1 cm için ayarlayın.
4. Kayıt yazılımı otomatik Spike 32 açın. Kayıt parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 500 µV; kayıt ölçekte 300 Hz, 200 Hz üzerinde düşük kesme filtresinde yüksek kesim; ve 10 pretrigger s.
5. Kayıt elektrot 10 x evrensel AC/DC amplifikatör bağlayın.
6. Mikroskop yüksek bir büyütme (500 X) geçin. Basiconic sensillum üzerinde üst palp Bankası kayıt elektrot yerleştirin ve kibar bir şekilde iyi spontan sivri (şekil 3D) elde etmek için kayıt elektrot ayarlayın.
7. 20 ml, sürekli hava akımı sağlamak için uyarıcı denetleyicisi açmak/s. 10 için 1 s. kaydı sinyalleri stimülasyon zaman Set 10 başlangıç s, s uyarıcı darbe başlangıcından önce.
8. 10 x evrensel AC/DC amplifikatör sinyalleri yükseltmek için kullanın. Sinyalleri IDAC 4 içine beslenir. Sinyalleri otomatik Spike 32 yazılımı ile analiz. AC sinyaller bant geçiren filtre 200-300 Hz. arasında en yüksek yalak genlikleri gelen sesler ayırt etmek için kullanın otomatik Spike 32. Nöronlar yanıt Aksiyon potansiyeli Frekanslar (sivri saniyede) artış olarak spontan Frekanslar hesaplamak. İstimal GraphPad prizma 7 istatistiksel çözümleme gerçekleştirme.

İki sensilla alt türlerinden (pb1 ve pb2) keçiboynuzu üst palp üzerinde farklı yanıt dinamikleri kimyasal odorants (% 10 1-nonal ve % 10 nonanoic asit) göre tanımlanır. Pb1 nöronlarda için 1-nonal nonanoic aside pb2 nöronlarda süre önemli ölçüde daha az 1-nonal nonanoic asit (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında tarafından aktive daha önemli ölçüde daha fazla sivri üretmek. Diehydroabietinal ve E-2-Hexenal yanıtı (POR)26açılış locust palp uyandırmak. Hangi gıda kaynağı26doğrulanmadı için katkıda bulunabilir bir bol ana bitki yeşil yaprak uçucu diehydroabietinal olduğunu. Pb1 nöronlarda son elicited sivri E-2-hexenal tarafından (Şekil 4) uyardığında pb2 olanların daha uzun. Pb1 ve pb2 nöronlarda benzer şekilde sağlam yanıt-e doğru diehydroabietinal (Şekil 4) sergi. Tüm sivri önce dönemleri 5 s ile 5 arasında ortalama değişiklikleri karşılaştırma stimülasyon 1-nonal cevaben önemli ölçüde nonanoic asit pb1, ama aksine pb2 daha yüksek olduğunu gösterir sonra s (Şekil 5). Bu iki alt türlerinden sensilla nöronlarda doz bağımlı E-2-hexenal ve diehydroabietinal cevap ve bu iki aldehitler onların yanıt desenleri (Şekil 6A ve 6B) farklı.

Şekil 1. Elektrot hazırlık. Genel bir bakış Elektrot bileme aparatı (A) Bu panel gösterir. % 10 NaNO2 (solda) içeren şırınga (sağda) elektrot netleştirmek için kullanılır. (B) Bu panel elektrot uç (a: uygun; b: uygun olmayan) yakın bir görünümünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Locust üst palp tutucu (MPH). (A)mil ve bir çekirge monte edilmiştir cam slayt üzerinde mikroskop altında konumlandırma daha önce. (B) Bu panel locust üst palp, tungsten telin bu tarafında platform üzerinde sabit bir close-up gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Tek sensillum kayıtları. (A) Bu panel Elektrofizyoloji Kur görünümünü gösterir. (B) Bu panel mikroskobunun monte locust hazırlık yakın bir görünümünü gösterir. (C) Bu görüntü 100 X büyütme oranında locust üst palp gösterir. (D) Bu görüntü palp 500 X büyütme oranında gösterir. Ok basiconic sensillum gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Locust üst palp tek sensillum kayıtları yanıt izleri. Bu panelinde, alt için 1 palp sensilla basiconica türü pb1 anlamına gelir; PB2 palp sensilla basiconica alt 2 için duruyor. Uyarıcı süresi Çubuklarõn izlerini yukarıda (1 s). Bu kayıtlar için tüm kokuları % 1'e seyreltilmiş E-2-hexenal ve diehydroabietinal, dışında % 10 dilutions kullanılmaktadır. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 26. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. Pb1 ve nonanoic asit ve 1-nonal tarafından uyarılan pb2 nöronlarda sivri Ortalama sayıda karşılaştırılması. Sivri Ortalama sayıda dönem 5 s önce ve stimülasyon sonra hesaplanır. PB1, sivri 1-nonal için yanıt nöronlar içinde ortalama sayısını artırmak bu sivri nonanoic asit için yanıt nöronlar içinde daha önemli ölçüde daha yüksek (n = 11 dokunacı; ANOVA post hoc t-testleri ile; p < 0.0001), pb2 aksine (n = 10 dokunacı; ANOVA post hoc t-testleri ile; p 0.0110 =). Hata çubuğu SEM temsil eder. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 26. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6. Nöronlar pb1 ve pb2 doz bağımlı yanıt için E-2-hexenal ve diehydroabietinal şekillerinin. (A) Bu panel gösterir nöronlar şekillerinin pb1 içinde (± SEM; n 12 dokunacı =). (B) Bu panel gösterir nöronlar şekillerinin pb2 içinde (± SEM; n 10 dokunacı =). Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 26. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.