Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

Summary

MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.

Abstract

Fransızca sitometresi Derneği (AFC) içinde başlatılan bir çalışma grubu miyeloid hastalık tanı Fransa multiparameter akış sitometresi (MFC) uygulama uyum amacıyla geliştirilmiştir. Burada sunulan protokolü üzerinde anlaşılan ve Eylül 2013 ve Kasım 2015 yılları arasında uygulanan altı Fransız tanı Laboratuarı (Üniversite Hastaneleri Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice ve Lille ve Institut Paoli-Calmettes oldu Marsilya) ve kemik iliği örnek hazırlama ve veri toplama standardizasyon izin verdi. Üç olgunlaşma veritabanı nötrofil, Monositik, ve erythroid soy "sağlıklı" donör bireyler (bireyler hematopoetik hastalık herhangi bir kanıt olmadan) kemik iliği ile geliştirilmiştir. Analiz sağlam bir yöntem her miyeloid lineage için rutin tanı kullanım için uygulanabilir olmalıdır. Yeni olgu aynı şekilde analiz ve her zamanki veritabanlarının karşı karşılaştırıldığında. Böylece, nicel ve nitel fenotipik anormallikler tespit edilmesi ve bu normal kemik iliği örnekleri verilerle karşılaştırıldığında 2SD yukarıda gösterge patolojisi düşünülmelidir. Daha yüksek değişkenlik Hibridoma teknolojilerini temel alan ve şu anda klinik tanıda kullanılan yöntemleri ile elde edilen monoklonal antikor kullanılarak elde veriler arasında büyük kısıtlamadır. Alınan veri teknik doğrulama ölçütlerini ayar MFC yardımcı programı için MDS diagnostics artırmanıza yardımcı olabilir. Bu kriterler kurulması bir veritabanıyla analiz gerektirir. Veri Analizi araştırmacı öznellik azalma bu yöntemin önemli bir avantajdır.

Introduction

Fenotipik işaretleri myeloid hücrelerin MDS başlama ve ilerleme sırasında meydana gelen displastik değişiklikler için belirli yokluğunda, olgunlaşma yolları (değiştirilmiş ifade değerlendirmesine dayanarak son yıllarda yeni bir yaklaşım önerilmiştir myeloid antijenleri olgun myeloid hücrelerin üretimi sırasında) veya kemik iliği (BM) içinde farklı hücre türleri anormal dağılımı bölmeleri^1,2hücre.

Bu makale myelodisplastik sendrom (MDS) veya diğer myeloid hematolojik hastalıklar ile ilgili BM myeloid hücre bölmeleri displastik değişiklikleri algılamak için MFC standart uygulanması için yeni bir yöntem sunar. Bu çalışma aynı zamanda MFC veri analizi için olgunlaşma veritabanları kullanmanın yardımcı programını gösterir.

Örnek hazırlama yordamı, veri toplama ve Analizi veritabanlarını kullanarak standardizasyon BM myeloid hücrelerin displastik değişiklikler ile ilgili en alakalı fenotipik anormallikler tanımlaması sağlayacak. Bu nedenle, iyi etiketli ve iyi tanınan biçimlerinin (otomatik popülasyon ayırıcı (APS) diyagramları, çubuk grafikler ve nokta araziler) dayalı istatistiksel olarak seçilen alt kümeleri sonraki analizinde kullanılan bir analizi strateji geliştirmek için gerekli olan yuvarlar. MDS sağlam fenotipik anormallikleri keşfi ile veya minimal morfolojik displazi ve sitogenetik aberrancies olmadan durumlarda tanı hafifletir miydi. İmmunophenotypic panelleri azaltılması için izin ayrımcı parametreleri tanımlaması onların uygulanabilirliği klinik patoloji laboratuarlarında izin geçerli puanları², kolaylaştırmak.

Bu yöntem sitometresi veri, öznel yorumlarını MDS tanı³' te sinyal olarak sınırlar. Bu adım işleme ve akış veri⁴analiz otomatik araçları geliştirilmesi için bir önkoşuldur.

MDS klonal hematopoetik kök hücre (HSC) bozuklukları spliceosome mutasyonlar MDS fenotip vermeye belirli epigenetik değiştiriciler ile işbirliği heterojen bir grup oluşur. Şimdi HSC mutasyonlar ile birlikte diğer mekanizmaları anormal Bağışıklık-aracılı inflamasyon ve malign HSCs ve BM stromal microenvironment arasındaki etkileşimler gibi MDS patofizyolojisi katılmaktadırlar, bilinen. Ancak, bu mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. MDS geniş klinik ve biyolojik heterojen tanı ve en uygun tedavi yelpazesi bir meydan okuma yapar. Son on yılda birden fazla çalışmalar MFC kez daha olduğunu göstermiştir içinde hafiye displazi² morfoloji ama teknik ve ekonomik kısıtlamaları daha duyarlı olun bu teknik, sonuçlar genellikle bağlı olarak standart hale getirmek zor Tercüman³deneyim. Ayrıca, nasıl MFC minimal morfolojik displazi olgularının ve sitogenetik anomali yokluğu veya hypocellular MDS, düşük patlama sayısı, olan gibi sınırda durumlarda denge MDS doğru klonal olmayan diğer BM ipucu belli değil kemik iliği yetmezliği gibi bozukluklar (i.e., aplastik anemi). Ayrıca akut miyeloid lösemi (AML) MDS sınırda durumlarda patlamalar bir fazlalığı ile ayırt etmek zor kalır. Tüm bu nedenlerden dolayı MFC MDS son tanı test klinik yönergeleri entegre değil. 2011 yılında ABD Ulusal kapsamlı kanser ağ (NCCN) CD34 + hücre yüzdesi, paroksismal nokturnal hemoglobinuria klonlar tespiti ve sitotoksik T Hücre klonlar hypocellular MDS⁵varlığı tahmini için MFC önerilir. Klinik veri immünsüpresif tedavi⁶bu hastaların iyi bir tepki göstermiştir olduğundan bu iki ikinci durum terapötik bir hedef de içerir. Uluslararası çalışma grubu (IWG) öneriler, gerekçe göstererek 2017 NCCN yönergeleri MFC tarafından anormal immunophenotyping algılama MDS tanı için ama herhangi bir özellikleri⁶yapmadan Co kriterlerin yanında listelenir. Buna ek olarak, kısa bir süre önce WHO sınıflandırma MFC bulgular yalnız MDS birincil tanısı kesin morfolojik ve/veya sitogenetik veri⁷yokluğunda kurmak için yeterli değildir öngörülüyor. Ancak, MFC olgunlaşma desenleri myeloid hücre bozukluk gösteren ve "mesafe"--dan normal bir hasta için hastalık sahası içinde belirli bir zamanda miktarının ek bir test olarak kullanılabilir.

Bu yöntem klinik laboratuvarlarında çalışan BM myeloid hücrelerin MDS veya displastik anormallikler ile diğer myeloid bozuklukları tanı iyileştirmek için MFC immunophenotyping, kullanarak displazi değerlendirilmesi ile ilgilenen geçerlidir.

Protocol

Aşağıda listelenen iletişim kuralı "Comité de koruma des Personnes tarafından" (bağımsız Etik Komitesi) onaylı Sud Est 1 Üniversite Hastanesi Saint-Etienne, Fransa'dan.

1. sitometresi ayarları

Not: Uygun olarak EuroFlow yordam "EuroFlow standart işletim Protokolü (SOP) araç kurulum ve tazminat (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php). Fransa akışı öneriler göre sitometresi ayarları yapıldı

1. Aylık araç kurulum
   1. Sitometresi üzerinde açın. Tüm sıvı seviyeleri uygun ve açık Diva 6.1.3 olduğundan emin olun. Akışkanlar başlatmasını gerçekleştirme: menü çubuğunda seçin ' sitometresi | Akışkanlar başlangıç '. Sorulduğunda 'Tamam' ı tıklatın. En az 30 dk kadar sıcak sitometresi izin.
   2. Performans denetimi - CST boncuk
      Not: Bu adımda, 12 75 mm polistren Tüp, CST boncuk ve kılıf sıvı ( Tablo malzemelerigörmek) hazırlayın.
      1. 12 x 75 mm² polistren tüp etiket 'CST'. Nazik inversiyon veya çok nazik vortexing tarafından sağlanan boncuk şişe karıştırın. Etiketli tüp ekleyin: 0,35 mL kılıf sıvı ve 1 damlası CST boncuk. Girdap tüpü yavaşça ve edinimi için devam edin. En fazla 8 saat 2-25 ° C'de için tüp hemen elde değil karanlıkta saklayabilirsiniz.
      2. Performans denetimi gerçekleştirmek: menü çubuğunda seçin ' sitometresi | CST'.
      3. CST modülü 'Kurulum' sekmesinde: Canto II olduğu gibi varsayılan 4-2 H-2V yapılandırmasını onaylamak ve ayrıca geçerli lot CST boncuklar kullanılarak oluşturulan bir temel bu yapılandırma için varolduğunu doğrulayın. Temel yoksa, CST boncuk IFU bakın. Bu temel geçmediğini onaylayın: ' Kurulum kontrol 'altında açılan menüden ' kontrol performansı ' nı seçin.
      4. 'Tüp el ile yüklemek' kontrol ve 'Çalıştır'ı tıklatın. Lot numarası görüntülenen onaylayın. Hafifçe sulandırılmış boncuk yukarıda hazırlanan ve istendiğinde, seyreltilmiş boncuk yüklemek ve 'Tamam'ı tıklatın.
      5. Performans onay tamamlandığında sitometresi performans geçtiğini doğrulayın. 'Raporu görüntüle'seçeneğini tıklatın. Eğer sonuçları did değil geçmek performans denetimi yeniden çalıştırın. Raporu performans izleme rapor tarihi ile PDF formatında kaydedin.
   3. 'Floresan Devresel_ödeme gerilim' gökkuşağı boncuk (Malzemeler tablo) ile ayarlayın.
      Not: Hedef değerleri Euroflow standart işletim prosedürü ("20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" başlıklı SOP içinde) öngörüldüğü. Bu SOP (kamu alanında; www.euroflow.org; Euroflow sitesinde mevcuttur Protokoller sekmesi).
      1. İle yeni bir deneme oluşturun ' aylık araç kurulum tarihi | Numune '.
      2. ', görme duyusuyla ilgili parametreleri ve tüpler ilgili (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) için karşılık gelen fluorochromes seçin ve istediğiniz satın alma parametrelerini kontrol edin (günlük, A, H ve / veya W). ( ' Sitometresi ayarlar ' deneme üzerinde sağ tıklayın) geçerli CST ayarlarını uygulayın. FSC parametresi için eşik 10.000 olarak ayarlayın.
      3. Sitometresi üzerinde telafisi hedef MFI ayarı gerilimleri Devresel_ödeme floresans ayarlanırken kapatmak; Bu amaçla, içinde 'Müfettiş'gidin, 'Tazminat' sekmesini devre dışı bırak tazminat unchecking ' tazminat ' etkinleştir seçeneği tarafından gidin.
      4. Tüm gerekli nokta bir cenaze dört nikah bir çalışma ' hedef MFI' oluşturmak (n = 2; FSC SSC, FITC PE karşı karşı), çubuk grafikler (n = 8; bir çubuk grafik için her floresans dedektör) ve en yüksek değerleri (MFI ve CV) her floresans kanal için referans gösterilen istatistikleri.
      5. 8-baş gökkuşağı boncuk kalibrasyon parçacıklar 1 mL distile su ve girdap kullanmadan önce 1 damla seyreltik. 8-tepe gökkuşağı boncuk çözüm 'Düşük' akış hızında kayıt olmadan elde etmek. 2-25 ˚C ilâ 8 h için tüp hemen elde değil karanlıkta saklayabilirsiniz.
      6. Kapı singlet boncuk ' nüfus P1' FSC SSC bivariate nokta Arsa karşı ve PE bivariate nokta Arsa karşı FITC 8 veya 7 tepe (en parlak pik veya sonraki aşağı doğru "20180302_7th_ başlıklı Euroflow belgesinde öngörüldüğü gibi Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") ve bu kapının nüfus P2 adlandırın.
      7. 8-tepeler gökkuşağı boncuk süspansiyon edinimi devam ve Devresel_ödeme voltaj Euroflow belge "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" göre hedef MFI değerleri ulaşmak için tüm floresans Kanalları ayarlayın.
      8. Bir kez hedef MFI değerleri 8 veya 7 tepe için ulaştı, hedef elde MFI ve karşılık gelen son Devresel_ödeme değerlerini kaydedin. 5000 olayları almak ve verileri kaydetmek.
         Not: Devresel_ödeme gerekir değerleri aşağıda adım 1.2.3 (performans kontrol - onay Devresel_ödeme değerler Rainbow boncuk ile) kullanılması.
      9. Bir yazıcı ile çalışma ' hedef MFI' ve araç ayarları ekran ve .jpg resim olarak kaydet yapma bu değerlerini kaydedin.
         Not: "Yeni" bir tüp oluşturulduğunda, bazen Devresel_ödeme değerleri beklenmedik biçimde değişir. Bunun için bir çift Devresel_ödeme kontrol esastır. Her zaman notlarınızı ' hedef MFI' değerleri ve devresel ödeme değerleri doğru olup olmadığını kontrol için Devresel_ödeme değerleri karşılaştırın!
      10. 'Uygulama ayarları'kaydedin. Tarayıcıda, ' sitometresi ayarlar 'üzerinde sağ tıklatın. Açılan menüden ' uygulama ayarları 'seçin ve kaydedin. 'Tamam'ı tıklatın. İstenirse, eşik değerleri korumak için Evet'i tıklatın.
          Not: uygulama ayarları varsayılan adı kullanarak kaydedin. Ayarları yeniden adlandırmayın.
   4. 'FCS' ve 'SSC gerilim' lysed yıkanmış kan (LWB) ayarlayın.
      Not: Bu adımda, bir sağlıklı gönüllü, lysing çözüm (Malzemeler tablo) ve çamaşır arabellek periferik kan (PB) örneği 50 µL ihtiyaç vardır.
      1. Pipets 50 PB µL içine bir tüp. 2 mL taze seyreltilmiş lysing çözeltisi ekleyin. Karışımı yavaşça ve RT., 10 min için kuluçkaya
      2. Santrifüj vasıl 540 x g5 min için.
      3. Süpernatant tüp yaklaşık 50 µL kalan cilt bırakarak hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Yavaşça karıştırın ve 2 mL süzülmüş yıkama çözeltisi ekleyin.
      4. Santrifüj vasıl 540 x g5 min için.
      5. Adımları 1.1.4.3–1.1.4.4 bir kez daha yineleyin.
      6. Filtre uygulanmış çamaşır arabelleği 250 µL ekleyin ve karışımı yavaşça.
      7. Gökkuşağı boncuk satın alma için oluşturulan deneyde yeni bir oluşturmak ' numune | Yeni çalışma sayfası ': bı parametrik SSC-A / FSC-bir grafik çizmek.
      8. Hücreleri elde, FSC SSC bivariate nokta Arsa karşı lenfosit kapı ve aşağıdaki ortalama hedef değerleri için geçişli lenfosit nüfusun ulaşmak için FSC ve SSC gerilimleri ayarlayın: FSC: 55.000 (Aralık 50.000-60.000) ve SSC: 13.000 (Aralık 11.000 –15,000).
      9. Almak ve verileri yaklaşık 10,000 olayları ile kayıt. Kapı lenfositler en kötü FSC ve SSC hedef değerlerini doğrulayın. FSC ve SSC gerilim gerekirse yeniden ayarlayabilirsiniz.
      10. Ekran yazdırma ve baskı elde edilen hedef kanal değerleri saklayın.
   5. Floresans telafisi ayarları.
      Not: Tek lekeli tazminat denetimleri sonra hedef MFI ayarlarını ayarlamanız gerekir ve FSC/SSC ayarları Gelişmiş. Bu adım, sağlıklı bir gönüllü, tazminat parçacıklar (Tablo malzeme), bir PB için çözüm lysing ve arabellek yıkama ihtiyaç vardır. Floresans tazminat matrisler ve başvuru nüfusları kurulum için kullanılan fluorochrome Birleşik antikor reaktif listesi Tablo 1' de listelenmiştir.
      1. Floresans tazminat ayarlarken kullanılan reaktif başına bir tüp etiket (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 ve APC-H7 - CD71) ve "boş/günahı" bir tüp.
      2. Damlalıklı 50 µL PB her tüpün içine veya 1 damla "olumsuz" tazminat parçacıkların + 1 damla tazminat kontrol tüpleri "olumlu" tazminat parçacıkların, Tablo 1' de yukarıda belirtilen.
      3. Uygun miktarda antikor reaktif tüp ekleyin. Filtre uygulanmış çamaşır tampon tüp başına 100 µL son hacmi ulaşmak ve karışımı yavaşça ekleyin. 15 dakika, RT, ışıktan korunan kuluçkaya.
      4. Hücreleri tüplerini sadece 2 mL taze seyreltilmiş lysing çözeltisi ekleyin ve karışımı yavaşça. RT, ışıktan korunan, 10 min için kuluçkaya.
      5. Santrifüj vasıl 540 x g5 min için.
      6. Süpernatant yaklaşık 50 µL kalan birim her tüpün içinde bırakarak hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Hafifçe karıştırın. Filtre uygulanmış çamaşır arabellek 2 mL ekleyin.
      7. 540 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
      8. Süpernatant yaklaşık 50 µL kalan birim her tüpün içinde bırakarak hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Filtre uygulanmış çamaşır tampon tüp başına 250 µL son hacmi ulaşmak ve karışımı yavaşça ekleyin.
      9. Tazminat denetimleri oluşturun.
         1. Menü çubuğundan gökkuşağı boncuk satın alma için oluşturulan deney seçin. Yeni bir oluşturmak ' numune | Tazminat kurulum | Tazminat denetimleri oluşturmak.
         2. Ortaya çıkan iletişim kutusunda, ' Include ayrı günahı denetim tüp/iyi ' onay kutusunu seçin. Genel (değil etiket özel) tazminat denetimleri oluşturmak FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500 için. Etiket özel tazminat denetimleri PE-Cy7-CD117 için APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 ve APC-H7 - CD71 oluşturun. 'Tamam'ı tıklatın.
         3. Yeni bir çalışma sayfasına bı parametrik SSC-A / FSC-bir grafik oluşturmak ve bir kapı lenfositler (P1) ve her tüpte algılanır ve olumlu zirve için bir P2 kapısı çizmek fluorochrome karşılık gelen çubuk grafik çizin. P2, olaylarda günahı denetim tüp dışında sayısı görselleştirmek için (bir grafik ve seçme ' göstermek nüfus hiyerarşi 'sağ tıklayın) sıradüzenini görüntüler.
         4. Tarayıcıda, tazminat denetimleri örneği genişletin.
         5. Girdap günahı hücreleri hazırlanan yukarıda, 3-5 s. yüklemek için sitometresi hazırlanan günahı hücrelerdeyse. Akış hızı ayarlamak 'Orta ' ve ' veri elde etmek ''ıtıklatın. FSC-A vs SSC-A nokta mezarlığına P1 kapıyı tamamen lenfosit nüfusu kapsayacak şekilde ayarlayın. P1 geçit üzerinde sağ tıklatın. 'Bütün tazminat denetimi Uygula'seçin.
         6. 'Satın alma' Dashboard, tıkırtı 'veri kaydı ' 5000 olaylar elde etmek için. Tüm tek renkli lekeli kontrol hücreleri için P2 aralığı kapısı olumlu nüfusu kapsar doğrulayın.
         7. PE-Cy7 ve APCH7 tüpler, P3 aralığı kapısı için çubuk grafik eklemek ve negatif nüfus kapsadığını ve P2 olumlu nüfusu kapsar emin olun.
         8. Tazminat hesaplayın. Menü çubuğundan seçin ' deneme | Tazminat kurulum | Tazminat hesaplamak '. Tazminat matris adı: 'Tazminatlar tarihi'. 'Bağlantı ve kaydetmek'seçin.
         9. Tazminat matris Katalog uygulama ayarları kaydetmek: tıkırtı üstünde 'sitometresi ayarları | Uygulama ayarları | Kaydet ', adı tazminat matris 'Tazminat tarihi' ve 'Tamam'ı tıklatın.
         10. Tarayıcıda, tıkırtı üstünde ' sitometresi ayarları '. Müfettiş, sağ alt köşede 'Tazminat' sekmesini Yazdır'ı tıklatın gidin.
             Not: Bu bilgiler Kataloğu'ndan alınabilir.
         11. Tazminat matris kontrolü.
             1. Bir tüp içinde tek lekeli tüp mix (APCH7 tercih).
             2. 'Tazminat doğrulama tarihi'adlı yeni bir deneme oluşturun, ekleyin yeni numune, bu deneyin ' sitometresi ayarlar ' sağ tıklayın ve seçin ' bağlantı | Bağlantısını kaldır | Uygulama ayarı ' 1.1.3.10 adımda kaydettiğiniz. Bu tüp 50.000 olaylardan yeni ayarlarla elde etmek.
             3. Yeni bir küresel çalışma uygulayın. 1 nokta çizim FSC-A/SSC-A oluşturma ve lenfosit görselleştirmek için bir kapı çizin ve (n-1) x n / 2 diğer araziler odaklı ikişer ikişer parametreleri görselleştirmek için lenfositler kapıda.
2. Günlük araç kurulum
   1. Sitometresi üzerinde açın. Tüm sıvı seviyeleri uygun ve açık Diva 6.1.3 olduğundan emin olun. Akışkanlar başlatmasını gerçekleştirme: menü çubuğunda seçin ' sitometresi | Akışkanlar başlangıç '. Sorulduğunda 'Tamam' ı tıklatın. En az 30 dk kadar sıcak sitometresi izin.
   2. Performans Check - CST boncuk: yinele adımları 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Performans Check - gökkuşağı boncuk değerlerle devresel ödeme onayı.
      1. Polistren tüp ' gökkuşağı boncuk ' olarak etiketleyin ve lot numarası olan kullanımda olup olmadığını kontrol edin. Gökkuşağı boncuk şişeyi iyice karıştırın. Gökkuşağı boncuk hazırlamak, gökkuşağı boncuk 1 damla 1 mL deiyonize suyla veya distile su ekleyin. Işıktan korumak.
         Not: edinme için devam etmek veya tüp, 2-8 ˚C edinme kadar saklayabilirsiniz.
      2. Yeni bir deneme oluşturun: ' gökkuşağı boncuk tarihi '.
      3. Tazminatlar bağlantı: doğru tıkırtı ' sitometresi ayarlar ', ' bağlantı kur 'seçin, 1.1.5.9.9 adımda oluşturduğunuz uygun tazminat matris seçin ve 'Üzerine yaz'seçin.
      4. Tazminat bağlantısını: doğru tıkırtı ' sitometresi ayarlar ', 'Daha önce bağlantılı kurulumundan bağlantıyı kaldır' seçin ve 'Tamam'ı tıklatın.
      5. ' Uygulama ayarları 'geçerli: doğru tıkırtı ' sitometresi ayarlar ', ' uygulama ayarları 'seçin, aylık Kur sırasında 1.1.3.10 adımda oluşturduğunuz ayar geçerli ve seçme 'Dengeleme değeri devam '.
      6. 'Tazminat Enable'seçimini kaldırın.
      7. Yeni bir örnek çalışma sayfası şablonu ile deneme için Rainbow boncuk oluşturun. 'Düşük' edinme tüpünde elde etmek.
      8. Boncuk satın alma sırasında sadece singlet boncuk nüfus dahil etmek için P1 geçit ayarlayın. P2 kapı sadece singlet boncuk nüfus dahil etmek FITC-A / PE-A nokta arsa üzerinde ayarlayın. 10,000 olayları kaydeder.
      9. MFI ve P2 nüfus için elde edilen CV değerler alanında Protokolü'nün hedefleri önceden tanımlanmış olup olmadığını denetleyin. Aksi takdirde, sitometresi yıkama ve işlemi yeniden başlatın. Raporu PDF biçiminde kaydedin.

2. BM numune hazırlama

Not: Protokolü hemen önce boyama işlemi yıkama hücre gerçekleştirin.

1. Birincil örneğinin 600 µL 15 mL santrifüj tüpüne pipet.
2. 10 mL, arabellek yıkama ekleyin (PBS + %0.5 BSA [> % 98 saf BSA] + %0,09 NaN₃ filtre çözümü, pH 7,4). İyi bir pipet kullanarak hücre süspansiyon karıştırın.
3. Santrifüj 540 x g (yıkama 1) de 5 min için. Süpernatant hücre Pelet bozmadan atmak.
4. 2.2 – 2.3 (2 yıkama) adımları yineleyin.
5. Hücre Pelet 400 µL, arabellek yıkama askıya alma.
6. Omurga işaretleri boyama. Polipropilen boru FACS analizi, hasta veri ve "omurga" ile tespit için birimin tümü omurga antikorların aktarın. Yıkanmış örneği (panelindeki tüm tüpler doldurmak için gerekli yıkanmış örnek hacmi) 350 µL ekleyin. İyi bir pipet kullanarak karıştırın.
   Not: omurga antikorlar yüzey membran ( Tablo 2' de gösterildiği gibi) boyama için toplam hacmini hesaplamak.
7. Pipet örnek-omurga karışımı içine 3 polipropilen borular için hasta veri ve "1 numaralı tüp" ile tespit FACS analiz için eşit miktarda "tüp numara 3". Gerekirse, çamaşır tampon tüp başına 200 µL son hacmi ulaşmak için kullanın.
   Dikkat: tüpler duvarlarında örnek herhangi bir iz bırakmamaya dikkat edin; Aksi takdirde, bu hücreler lekeli değil. Gerekirse, girdap hücreleri ve santrifüj tüpü.
8. Her tüpün antikorlar hücre yüzey işaretleyicileri (dışında omurga işaretleri) karşı belirtilen Tablo 2olarak yönetmen uygun hacmi ekleyin. İyi bir pipet kullanarak karıştırın. Işıktan korunan RT, 30 dk için kuluçkaya.
9. Çözüm lysing 2 mL ekleyin. İyi bir pipet kullanarak karıştırın. Işıktan korunan RT, 10 min için kuluçkaya.
10. Santrifüj vasıl 540 x g5 min için. Süpernatant yaklaşık 50 µL kalan birim her tüpün içinde bırakarak hücre Pelet bozmadan atmak. İyi bir pipet kullanarak karıştırın.
11. Hücre Pelet arabelleğe yıkama 2 mL ekleyin. İyi bir pipet kullanarak karıştırın.
12. 2.10-2,11 (2 yıkama) adımları yineleyin.
13. Santrifüj vasıl 540 x g5 min için. Hücre Pelet bozmadan süpernatant atın ve hücre Pelet PBS 200 µL içinde yeniden askıya alma. İyi bir pipet kullanarak karıştırın.
14. Hücreleri, tercihen, hemen boyama sonra elde etmek veya akış sitometresi ölçülen kadar en fazla 1 saat için ışık korunuyorsunuz 4 ° C'de depolayın.

3. veri toplama

1. Yeni bir deneme Diva yazılımında açın ve adı, türü örnek ve tarihi göre yeniden adlandırın.
2. 3 tüpler içeren yeni bir örnek oluşturun. Deney düzeninde her tüpün içinde kullanılan antikor belirtin.
3. ' Sitometresi ayarlar 'sağ'ı tıklatın, ' uygulama ayarlar ' ı seçin ve aylık Kur (adım 1.1.3.10) elde edilen değerler uygulayın.
4. Yeni bir küresel çalışma sayfası açın ve nokta araziler oluşturun: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. SSC-A/FSC-A nokta çizim singlet hücreleri seçmek için bir kapı oluşturma. 4 nüfus seçmek için kapıları SSC-A/CD45-BV500-A nokta çizim oluşturma: granülosit, monosit, patlamalar ve lenfositler. Bu nüfus daha önce oluşturulan nokta parsellerde proje.
5. Tazminat denetimi için yeni bir küresel çalışma 1.1.5.9.11.3 adımda anlatıldığı gibi oluşturun.
6. 'Orta' toplama ve kayıt 500.000 olaylar/tüp tüpünde elde etmek. (Tazminat ve uygun boyama değerlendirilmesi) Teknik doğrulama sonra verileri FCS3.0 dosyaları olarak dışa aktarma.

4. veri analizi

Not: kullanılan dosyalar sağlıklı bağışçılardan ve hematopoetik bir hastalık için herhangi bir delil olmadan bireylerin gibidir normal BM veritabanları oluşturmak için 11 Neutrophils_NM için 18 dosyalarından veritabanı, Monocytes_NM veritabanı için 18 resimler ve 18 14 10 NRC_NM veritabanı dosyaları. Dosyaları temsilcisi sonuçları bölümünde sunulan çeşitli teknik sorunlar ortaya atılır. Dosyaları tek tek Şekil 1A(1-3)'için nötrofil lineage (profil Neutrophils_Maturation.inp), Şekil 2 tasvir çeşitli stratejileri için uygun Infinicyt yazılım (Tablo malzemeler), kullanarak analiz edildi A monosit lineage (profil Monocytes_Maturation.inp) ve Şekil 3A(1-2) erythroid hücre lineage (profil NRC_Maturation.inp) için.

1. Strateji analiz için nötrofil -Neutrophils_NM veritabanı inşaat 
   1. Yedi gates, CD34 + CD117 + HLADR + düşük CD10 - CD13 + CD11b-Etkinlikler (Şekil 1A.1) seçilmesine olanak verecek bir kesişimini kullanarak CD34 + patlamaların nötrofil kabul edilen tanımlayın. Bu olaylar nüfus hiyerarşi ağacı 'Nötrofil' sekmesine atayabilir ve bundan sonra bu sekmeyi (mavi olarak tasvir) Bu hücreler kaldırmak için kalan Olaylar (gri) görüntüden işaretini kaldırın.
   2. İzole CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + Şekil 1' deA(2) gösterildiği gibi bir kesişimini altı kapıları kullanarak düşük nötrofil öncüleri ve onları 'Nötrofil' sekmesine atayın.
   3. Daha olgun nötrofiller dört kapı, sunan CD45dim SSCint-Merhaba CD117-HLADR-hücre ayrımcılık ve onların atama 'Nötrofil' sekmesine bir kesişimini kullanarak tanımlayın.
   4. Kalan olaylar sadece nötrofil görünür, tutmak, daha sonra ihracat bu nüfus tıklatarak işaretini kaldırın ' dosya | İhracat ' tüm gerekli parametreleri kontrol edilir ve verileri FCS dosyaları olarak kaydetmek ve doğrulanması.
   5. Tüm verilen FCS dosyaları oluşan bir birleştirilmiş dosyada ifade işaretleri için her subpopulation yoğunluğunu değerlendirerek kalite kontrolü gerçekleştirin. APS kullanarak bir cenaze dört nikah medians her dosya için ve SD eğrileri gösterildiği, her subpopulation için Kaldır (bkz: temsilcisi sonuçlar bölümünde ayrıntıları) 2SD eğrileri dışındaki durumlarda (Şekil 1B).
   6. Sonuçta elde edilen oluşan dosyasıyla "Nötrofil" görünür, APS diyagramda (Şekil 1C sol) olgunlaşma yolu çizmek ve .cyt dosyası olarak kaydedin.
      Not: Bir karşılaştırma olgunlaşma diyagramı normalleştirilmiş veritabanında temsil Neutrophils_NM veritabanında bulunan tüm dosyaları tüm parametreleri görselleştirme sağlar. Şekil 2C, sağ tarafta, sunulan çizimde tüm dosyaları Neutrophils_NM veritabanında yer gösterir (n = 11) 2'uygun SD grubunun orta ile karşılaştırıldığında.
2. Strateji monosit - Monocytes_NM veritabanı inşaat için analiz
   1. Monositik lineage hücrelerini tanımlamak (CD117 + CD64 / + Merhaba HLADR + Merhaba) bir kesişimini dört kapısı (Şekil 2A) kullanarak. Bu olaylar nüfus hiyerarşi ağacı 'Monocytic' sekmesinde atayın.
   2. Kalan olaylar yalnızca Monositik hücreleri görünür, tutmak, daha sonra ihracat bu nüfus tıklatarak işaretini kaldırın ' dosya | İhracat ' tüm gerekli parametreleri kontrol edilir ve verileri FCS dosyaları olarak kaydetmek ve doğrulanması.
   3. Tüm verilen FCS dosyaları oluşan bir birleştirilmiş dosyada ifade işaretleri için her subpopulation yoğunluğunu değerlendirerek bir kalite denetimi gerçekleştirmek sonra 2SD eğrileri (temsilcisi sonuçları bölümü ayrıntılarda) dışındaki durumlarda kaldırın (resim 2 B).
   4. "Monocytic" hücreleri görünür ile elde edilen dosyasındaki olgunlaşma yolu çizmek APS diyagram (Şekil 2C sol) ve bu .cyt dosyası olarak kaydedin.
      Not: Bir karşılaştırma olgunlaşma diyagramı normalleştirilmiş veritabanında temsil Monocytes_NM veritabanında bulunan tüm dosyaları tüm parametreleri görselleştirme sağlar. Şekil 2C, sağ tarafta, sunulan çizimde tüm dosyaları Monocytes_NM veritabanında yer gösterir (n = 10) 2'uygun SD grubunun orta ile karşılaştırıldığında.
3. Strateji çekirdekli kırmızı hücreleri (URM'leri) - NRC_NM veritabanı inşaat için analiz
   1. Erythroid kabul edilen bir kesişimini CD34 + CD117 + HLADR + düşük CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + Etkinlikler (Şekil 3A(1)) seçime izin ver yedi kapıları kullanarak CD34 + patlamaların tanımlayın. Bu olaylar nüfus hiyerarşi ağacı "NRK" sekmesine atayın ve sonra bu sekmeyi (kırmızı olarak tasvir) Bu hücreler kaldırmak için kalan Olaylar (gri) görüntüden işaretini kaldırın.
   2. Daha olgun URM'leri CD45 - ayrımcılık izin dört kapı bir kesişimini kullanarak tanımlamak / + SSClow CD36 dim + Merhaba CD71 + Merhaba CD105 +/-hücreleri. Bu olaylar "NRK" sekme (Şekil 3A(2)) atayın. Trombosit (CD36 + Merhaba SSClow hücreleri) NRK nüfus (Şekil 3A(2)) kaldırılması gerekir.
   3. Kalan olaylar sadece NRC hücreleri görünür, tutmak, daha sonra ihracat bu nüfus tıklatarak işaretini kaldırın ' dosya | İhracat ' tüm gerekli parametreleri kontrol edilir ve verileri FCS dosyaları olarak kaydetmek ve doğrulanması.
   4. Tüm verilen FCS dosyaları oluşan bir birleştirilmiş dosyada kalite kontrolü ifade işaretleri için servis taleplerini 2SD eğrileri (temsilcisi sonuçları bölümü içinde görmek) (dışında kaldırılması ardından her subpopulation yoğunluğunu değerlendirerek gerçekleştirmek Şekil 3 B).
   5. Elde edilen dosya görünür "NRK" hücrelerle, olgunlaşma yolu çizmek APS diyagram (Şekil 3C, sol) ve bu .cyt dosyası olarak kaydedin.
      Not: Bir karşılaştırma olgunlaşma diyagramı normalleştirilmiş veritabanında temsil NRC_NM veritabanında bulunan tüm dosyaları tüm parametreleri görselleştirme sağlar. Şekil 3' teC, sağ tarafta, sunulan çizimde tüm dosyaları NRC_NM veritabanında yer gösterir (n = 14) 2'uygun SD grubunun orta ile karşılaştırıldığında.
4. Olgunlaşma değerlendirilmesinde BM miyeloid bölmeleri olgunlaşma veritabanlarını kullanma
   1. Faiz soy karşılık gelen .cyt dosyasını açın (i.e., nötrofil silsilesi, Monositik lineage için Monocytes_NM_GMFF.cyt ve NRCs_NM_GMFF.cyt erythroid lineage için için Neutrophils_NM_GMFF.cyt).
   2. Faiz soy karşılık gelen sekmesinin altındaki 'Olgunlaşma' sekmesinde sağ tıklatın (' nötrofil | Monositik | NRK ') ve olgunlaşma için olgunlaşma veritabanı kurtarmak.
   3. Yeni FCS dosyasını açın ve daha önce açıklandığı gibi çözümlemesi (nötrofil, adım 4.2.1 Monositik hücreler için için 4.1.1–4.1.3 adım ve 4.3.1–4.3.2 NRC için adım).
   4. Faiz nüfusu için olgunlaşma yolu çizin.
   5. Karşılık gelen veritabanı açık belgili tanımlık 'Alet' etiket (veritabanı çözümlemesi) ve karşılık gelen olgunlaşma veritabanı ile çözümlenmesi için nüfus karşılaştırın. Veri kullanılabilir veritabanı ile uyumluluğunu kontrol edin: tam uyumluluk (yeşil üçgen); kısmi uyumluluk, çoğu durumlarda farklılıklar adına parametreleri (sarı üçgen); ve uyumsuzluk (kırmızı üçgen).
   6. Verileri beraber verilen veya kısmi beraber verilen ise, yazılım ' olgunlaşma farklar normalleştirilmiş ' Diyagram oluşturur. ' Parametre grubu olgunlaşma farklılıklar 'görselleştirmek, yeni bir diyagram 'Diyagramı' sekmesini açın, 'Olgunlaşma' tıklatın ve görüntülenmesini, tıklayın için kaç parametrelerini seçin "Tamam" ve diyagram görünür. İle diyagramda sağ tıklatın; Veri görselleştirme, veritabanı görselleştirme ve olgunlaşma diyagramı görselleştirme değişiklik yapılabilir.
   7. Yeni dosya ve veri dahil veritabanı arasındaki farklar önemini görselleştirmek için bir zoom yapılandırın ( ' olgunlaşma farklar normalleştirilmiş ' üzerinde sağ tıklatın ve 'Zoom'uygulayın).

Results

K-EDTA antikoagülan hasat 54 BM örnekleri çalışmaya dahil. MFC veri yokluğunda hastalar hakkında herhangi bir bilgi, analiz edildi. Retrospektif çalışma BM örnekleri (5 erkek ve 47.4 [35-48] 2 kadın bir Medyan yaş ile hematopoetik hastalığı (8 ve 57,9 [35-72] bir Medyan yaş ile 3 erkek) kanıtı yok ile 11 kişi ve 36 olgu çeşitli ile 7 sağlıklı bağışçılardan olduğunu gösterdi patolojik koşullar: 1 durumda anemi ve düşük kreatinin düzeyi, anemi ve yüksek kreatinin düzeyi, inflamasyon, anemi...

Discussion

BM aspiratı kalitesini final sonuçlarına etkisi olabilir. BM aspiratı hemodilution hücrelerin CSF'den olgunlaşma olmaması nedeniyle, farklı evrelerinde veya öncül hücrelerin dağıtım deforme. Muhtemelen bir toplu yöntemi lysing istihdam hemodilution akış sitometrik analizlerde için BM boğulmadan normalleştirme yardımcı olabilir. Ayrıca, BM miyeloid displazi değerlendirilmesi için kritik adımlar akış sitometresi tarafından işleme ve boyama örnek, veri toplama ve yorumu^2,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II akış sitometresi	BD Biosciences, CA, ABD	SN:	3 lazer, 4-2-2 konfigürasyonu, Filtreler ve ayna detayları: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Santrifüj	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; model numarası: 320002001	düşük hızlı santrifüj; kapasite 60 FACS tüp
10 ve mikro pipetler; L ve 200 & mikro; L
Pasteur pipetleri
15 mL Falcon tüpleri
FACS
Fare Anti-İnsan HLA-DR	BD Biosciences, CA, ABD	için	klon L243 Fare BALB/c IgG2a, & kappa; Florokrom Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, ABD	560777	klonu HI30 Fare IgG1, κ Florokrom Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, ABD	656146	klon CLB/fcGran1 Fare BALB/c IgG2a, κ Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Fare Anti-İnsan CD13	BD Biosciences, CA, ABD	347406	klonu L138 Fare BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, ABD	347222	klonu 8G12 Fare BALB/c IgG1, κ Florokrom PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Fare Anti-İnsan CD117	BD Biosciences, CA, ABD	339217	klonu 104D2 Fare BALB/c IgG1 Florokrom PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Fare Anti-İnsan CD11b	BD Biyolojik Bilimler, CA, ABD	333143	klonu D12 Fare BALB/c IgG2a, κ D12, Florokrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Fare Anti-İnsan CD10	BD Biosciences, CA, ABD	646783	klonu HI10A Fare BALB/c IgG1, κ Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Fare Anti-İnsan CD35	BD Biosciences, CA, ABD	555452	klonu E11 Fare IgG1, κ Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Fare Anti-İnsan CD64	BD Biosciences, CA, ABD	644385	klonu 10.1 Fare BALB/c IgG1, κ Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Fare Anti-İnsan CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	klonu UP-H2 Fare BALB/c IgG1, k Florokrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Fare Anti-İnsan CD14	BD Biyolojik Bilimler, CA, ABD	641394	klon MoP9 Fare BALB/c IgG2b, κ Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Fare Anti-İnsan CD36	BD Biosciences, CA, ABD	656151	klonu CLB-IVC7 Fare IgG1, κ Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, ABD	560839	klonu 266 Fare BALB/c IgG1, κ Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Fare Anti-İnsan CD33		345800	klonu P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Florokrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, ABD	655408	klonu M-A712 Fare BALB/c IgG2a, κ Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lizasyon Çözeltisi 10x Konsantre (IVD)	BD Biosciences, CA, ABD	349202
FACSFlow Sheath Sıvısı	BD Biosciences, CA, ABD	342003
FACSDiva CS& T IVD boncukları	BD Biosciences, CA, ABD	656046
GÖKKUŞAĞI KALIBRASYON PARÇACIKLARI, 8 TEPE	Cytognos, Salamanca, İspanya	SPH-RCP-30-5A	çok EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Kompanzasyon Parçacıkları Çok Renkli CompBeads (CE / IVD)	BD Biosciences, CA, ABD	Referans #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva yazılım sürümleri 6.1.2 ve 6.1.3	BD Biosciences, CA, ABD
Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri	R& D Systems, Minneapolis, ABD	5564
Sığır serum albümini ( BSA)	Sigma-Aldrich, Fransa	A9647
Sodyum azid% 99	Sigma-Aldrich, Fransa	199931
Infinicyt yazılım sürümü 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, İspanya