Yöntem makalesi

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

DOI:

10.3791/57901

⸱

21 Ekim 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı, düşük çözünürlüklü ab initio manken ve yapısal bir deterjan çözündürüldükten membran proteini küçük açı Nötron saçılma kontrast-eşleştirme ile deterjan kullanarak çözümde detaylarını elde etmek gösterilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik küçük açı Nötron saçılma enstrüman High-Flux izotop reaktör, Oak Ridge National Laboratory, biyolojik malzemeler, işleme biyoyakıt ve biyo-ilham malzemeler için nanometre kapsayan soruşturma adanmış mikrometre uzunluğunda ölçekler. Burada fiziksel özelliklerini (Örneğin, boyut ve şekil) membran proteinlerinin soruşturma için sunulan yöntemleri (burada, MmIAP, Methanoculleus marisnigrigelen bir intramembrane aspartyl proteaz) micelle kurma çözümlerinde deterjanlar vardır diğerleri arasında bu küçük açı Nötron saçılma araç için oldukça uygundur. Diğer biyofiziksel karakterizasyonu teknikleri bir protein-deterjan karmaşık yapıda deterjan katkıları gidermek için kendi yetersizlik tarafından engellemiştir. Ayrıca, biyo-Deuteration laboratuvar erişim büyük ölçekli arazisi hazırlama ve protein gelişmiş saçılma sinyal proteinleri döteryum etiketli ifade için benzersiz yetenekleri sağlar. Bu süre tekniği yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlamaz, membran proteinlerinin yapısal bilgi boşluğu yakınındaki atomik çözünürlük gerek kalmadan birçok adresli alanda araştırma içerir. Örneğin, bu alanlarda oligomeric Birleşik, karmaşık oluşumu, konformasyon değişiklikleri belirlenmesi sırasında pertürbasyon ve katlama/unfolding olayları içerir. Bu araştırmalar yoluyla bu yöntemin uygulamaları kolayca gerçekleştirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran proteinlerinin tüm genler1 yaklaşık %30 tarafından kodlanmış ve hedefler modern tıbbi ilaçlar için güçlü bir çoğunluğu temsil. 2 bu proteinler hayati hücresel fonksiyonların3 ama onların bereket ve önem rağmen geniş bir dizi gerçekleştirmek — yalnızca toplam yapıları içinde araştırma Collaboratory Yapısal Biyoinformatik (RCSB) Protein için yatırılan yaklaşık % 1'i temsil Veri Bankası. 4 kısmen hidrofobik kendi doğası nedeniyle membran bağlı proteinler yapısal belirlenmesi son derece zorlu olmuştur. 5 , 6 , 7

Birçok biyofiziksel teknikleri ölçüm için çözüm monodisperse parçacıklar gerektiği, membran proteinlerinin yerli membranlar üzerinden yalıtma ve yerel membranlar çözünür bir taklit bu proteinler sabitleme bir etkin alan araştırma son olmuştur on yıl. 8 , 9 , 10 bu soruşturmalar birçok roman amfifilik derlemeler geliştirme için zar proteinleri, nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 gibi solubilize yol açmıştır ve amphipols. 16 , 17 ancak, deterjan micelles kullanımı belirli bir protein çözünürlük gereksinimlerinin karşılanması için en yaygın ve basit yaklaşımların türlerindendir. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 ne yazık ki, hiçbir tek deterjan veya deterjanlar sihirli karışımı tüm membran proteinlerinin karşılayan şimdilik; Böylece, bu koşullar her protein benzersiz gereksinimleri için ampirik olarak taranması gerekir. 26 , 27

Deterjanlar kendi kritik micelle konsantrasyon yukarıda çözümünde micelles denilen formu toplu yapıların için kendini topla. Micelles (genellikle 20-200 çeşitli) birçok deterjan monomerleri micelle çekirdek ve sulu solvent bakan bir micelle kabuk katmanda düzenlenmiş hidrofilik baş grupları oluşturan hidrofobik alkil zincirleri ile oluşur. Deterjanlar ve micelle oluşumu davranışını klasik Charles Tanford Hidrofobik etkisi,28 ve boyutları tarafından tarif edilmiştir ve micelles membran protein çalışmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar gelen şekiller olmuştur küçük açı saçılma kullanarak karakterize. 29 , 30 deterjan örgüt membran proteinlerinin hakkında da eğitim gördü ve protein-deterjan kompleksleri (PDC) oluşumu ile deterjan molekülleri protein düzgün deterjan benzer bir düzenleme çevreleyen bekleniyor micelles. 31

Bir avantaj deterjanlar kullanarak elde edilen micelle özellikleri diğer deterjanlar dahil ederek manipüle eklenir. İdeal karıştırma birçok deterjanlar sergi ve karışık micelles seçme özellikleri bile bileşenleri ve karıştırma oranı tahmin. 22 ancak, deterjan varlığı hala sorunlar biyofiziksel karakterizasyonu için genel sinyal katkıda bulunarak mevcut. Örneğin, x-ışını ve ışık saçılım teknikleri ile deterjan PDC içinde sinyal protein neredeyse ayırt edilemez. 32 tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile araştırmalar genellikle kapana kısılmış (donmuş) parçacıkları üzerinde itimat; yapısal protein ayrıntılarını hala bazı deterjanlar veya arka planına ekler deterjan yüksek konsantrasyon tarafından gizlenmiş. 33 (deterjan da dahil olmak üzere) tam PDC yapısını yorumlama doğru alternatif yaklaşımlar deterjan verilen membran protein çevresinde yeniden inşa etmeye hesaplama yöntemleri ile yapılmıştır. 34

Nötron saçılma durum için deterjan micelle içinde çekirdek-kabuk düzenlenmesi için gözlenen saçılma katkıda bir form faktörü üretir. Neyse ki, öyle ki onlar için net gözlenen saçılma katılmazlar çözüm bileşenlerini değiştirilebilir. Bu "eşleşen kontrast" işlem döteryum için arka plan (arabellek) uygun bir saçılma uzunluğu yoğunluğu sağlamak hidrojen yerine kullanarak elde edilir. Deterjan (kullanılabilir deuterated meslektaşları ile) akıllıca bir seçim ve karıştırma onların oranı dikkate alınmalıdır. Deterjan micelles için bu ikame deuterated alkil zinciri (h-kuyruk yerine d-kuyruk) sahip ama aynı kafa grubu ile bir deterjan kullanarak gerçekleştirilir. Deterjanlar iyi karışık olduğundan,35 ağırlıklı köstebek-kesir bir saçılma uzunluğu yoğunluğu onların toplamları verir ortalama iki bileşenleri (h-kuyrukları ve d-kuyrukları). Bu ortalama kontrast baş grup ile tutarlı olduğunda, tek tip toplu yapıları tam olarak gözlenen saçılma tüm katkılar kaldırmak için eşleştirilir.

Burada döteryum etiketli alkil zincirlerle kimyasal olarak özdeş deterjan molekülleri içeren ile deterjan micelles nötron karşıtlığını değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. 19 , 36 , 37 bu micelle çekirdek ve Nötron saçılma benzersiz bir yetenektir kabuk tam eşzamanlı aksine eşleşen izin verir. 35 , 38 önemli ölçüde rafine bu ayrıntı düzeyiyle, kontrast eşleşen etkinleştirebilirsiniz membran protein yapıları Aksi takdirde olanaksız çalışmalar. Ayrıca, bu karşıtlık eşleştirme yaklaşım için diğer sistemleri polimer Satım reaksiyonlar39 ve yağ-su dispersant,40 veya bicelles,41 gibi solubilizing bile diğer ajanlar gibi deterjan içeren uzun olabilir nanodiscs,42 ya da blok kopolimerler. 43 A benzer yaklaşım bu el yazması, ancak kısmi döteryum kısaltmaları alkil zinciri ve/veya kafa grubu ile tek bir deterjan tür istihdam Seviyelendirilmiş olarak son zamanlarda yayınlandı. Bu hidrojen ve döteryum deterjan boyunca rasgele dağıtımını geliştirmek için beklenen süre 37 burada anlatılan yaklaşım ikame ve iki adım için deterjan kullanılabilir pozisyonlar sınırlı sayıda karşılaştırıldığında. deterjan sentez pozlar ek zorluklar dikkate için gerekli.

İlk deneme planlama bir kalite teklif için yapılması gereken bu yana adım 1 ve 2 kez aşağıda ayrıntılı Protokolü'nün üst üste. Ancak, öneri gönderme olarak kabul edilir bu işlemin de nötron deney öncesinde başlayan olduğunu vurgulamak için ilk adım olarak. Ayrıca göre teklif gösterdi, bir önkoşul adım nötron çalışmaları ihtiyacını destekleyen örnek (saflık ve istikrar dahil) fiziksel ve biyokimyasal karakterizasyonu sahip olmaktır dikkat edilmelidir. Küçük açı Nötron saçılma (San) genel bir tartışma Bu makalenin kapsamı dışında olduğunu. Kısa ama kapsamlı giriş Malzeme karakterizasyonu Kaufmann,44 ve saçılma kapsamlı bir ders kitabı üzerinde duruldu biyolojik küçük açı çözüm tarafından son yayınlanan başvuru eser bulunmaktadır kullanılabilir. 45 daha fazla tartışma bölümünde önerilen okuma verilir. Küçük açı saçılma sözde saçılma vektör Q dağıtma işlemini açıklar merkezi miktarı olarak kullanır. Bu makalede yaygın olarak kabul gören tanım Q kullanılmaktadır = 4π sin (θ) / λ, θ gelen ve dağınık kiriş ve λ arasında yarım açı nerede dalga boyu Angström nötron radyasyonu. Diğer tanımları farklı kullanım 's gibi semboller var ' saçılma vektör ve bu faktör 2π veya nanometre Angstrom yerine kullanarak farklı olabilir için (Ayrıca bkz: Şekil 10tartışılması).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırla ve bir nötron tesis ışın zaman ve enstrüman teklifi gönder

  1. Genel Kullanıcı nötron ışın zaman erişim, gibi Oak Ridge National Laboratory (ORNL) sağlamak Nötron saçılma özellikleri belirlemek için online kaynaklarına başvurun. Nötron imkanları ve nötron araştırma dünya çapında hakkında bilgi çevrimiçi kullanılabilir. 46 bu tesisler genellikle normal görüşmeleri için teklif var unutmayın; Bu ne zaman sonraki ışın sırasında kullanılabilir belirler. Nötron çeşitli uygulamalar için kullanılır; küçük açı Nötron saçılma (San) aletleri, özellikle de biyolojik örnekleri için yetenekleri ile arayın.
  2. Nötron imkanları tarafından sağlanan kaynaklar nötron ışın zaman teklif gönderme işlemini gezinmek için kullanın. İle bir Nötron saçılma bilim adamı (kendisi için geçerli olacaktır araç ile ilişkili NSS) başvurun. Nötron tesisin teklif çağrıları, son başvuru tarihleri ve tavsiye için başvuru ile ilgili geçerli bilgileri gözden geçirin; Oak Ridge için bu çevrimiçi kullanılabilir. 47 başarılı bir gönderme için tüm yönergeleri izleyerek ışın zaman teklif gönderin.
  3. Deuterated protein gerekli (bkz: 2.2) ise, Nötron saçılma imkanları kez laboratuvarları ve uzmanlık deuterated malzemelerin üretim adanmış tarafından desteklenir. Erişim için Bio-Deuteration Lab (BDL) adlı ORNL istiyorsanız, BDL ikinci araç olarak öneri sistemi seçin. SANS önerisi için fizibilite ve bilimsel inceleme Komitesi tarafından gözden iken, BDL istekleri sadece için fizibilite ekranlı. BDL fizibilite incelemeleri ile yardımcı olmak için tahmini verim ve protein ifade protokolü açıklar tamamlanan bilgi istek formu48 gönderin (kullanılabilir çevrimiçi).
  4. Başarılı-akran sonra ışın zaman önerisi, ışın zaman deneme öncesinde ödül tarih onaylamak. Tüm örnek ve arabellek bilgileri ve formüller doğru düzgün İnceleme için teklifinde listelendiğinden emin olun. Örnek ve tampon bileşiminde değişiklikler dahil olmak üzere önerilen deneysel planın herhangi bir değişiklik bildirim tesisin gerektirir.
    Not: Değişiklikleri en kısa zamanda atanan NSS ile görüşülmelidir.

2. Protein ölçümü için nötron kontrast maç puanı ve gerekli kontrast belirleyin

  1. Bilgi toplamak (tedarikçi firmanın ürün bilgileri, online veritabanları, yayımlanmış değerleri, vb) atomik besteleri ve birimler için kontrast uyumlu deterjan sistem bileşenleri ile ilgili. Bu bilgiler bağlamında ilgi membran protein için veri ve yapısal bilgi SANS kalite elde etmek için önemlidir çözümde Nötron saçılma uzunluğu yoğunlukları (SLD) belirlemek ve böylece maç puanı (CMPs) kontrast için kullanılır bir PDC. Fiziksel özellikler ve kontrast maç puanı membran proteinlerinin biyofiziksel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar için olduğunu özetleyen bir tablo (Tablo 1) dahil.
  2. Malç web uygulamasını kullanarak nötron SLD'ler belirlemek: modüller için analiz, kontrast varyasyon veri49 (elde edilebilir online50 ücretsiz-of-charge). Kullanım Kılavuzu için bir bağlantı giriş sayfasında yer alır. Web sitesine erişmek ve eşlik eden belgeleri okuyun. Şekil 1 ve Şekil 2 kontrast modülü giriş ve çıkış genel bir bakış için iki ilgili örnekler sağlar.
    Not: SLD'ler hesaplamak için diğer Web sitelerine are elde edilebilir, National Institute of Standards ve Technology (NIST) Merkezi tarafından nötron araştırma için tutulan biri gibi. 51
    1. Kontrast modülü 'sol Gezinti Bölmesi'nde yer alan kontrast' ı tıklatarak açın. Proje başlığı için metin sağlamak ve olarak iki bileşeni (Örneğin, deterjan grubu baş ve kuyruk) aşağıda ayrıntıları girin ' alt birim 1' ve ' alt birim 2'.
    2. Moleküler formülü her bileşen 'Formül' metin kutusuna girin.
      Not: radyo düğmesini değilim ' 'Madde türü'nün altında bir moleküler formülü girmek için seçilmiş olması gerekir. Ayrıca, formül 'X' harfi kolayca değiştirilebilir hidrojen atomları belirtmek için kullanın. Eğer protein, RNA veya DNA dizileri girilebilir karşılık gelen 'P', 'R', ya da vardı ' radyo düğmesi seçilir. Bir bileşenin birden çok kopya içinde alt birimi varsa, 'Nmolecules' değeri buna göre değiştirilebilir. Pratik bir örnek 2'ye eşit Nmolecules ile girilecek bir kuyruk için formül sağlayan iki özdeş kuyrukları içeren lipid benzeri deterjanlar ile ilgilidir.
    3. Birimin kübik Angström her bileşen 'Cilt (Å3)' aşağıdaki kutuya girin. Tanford'ın formül28 uzunluk n, Vkuyruk alkil zincirler için kullanın = 27,4 + n * 26,9 yaklaşık kuyruk birim hesaplamak veya moleküler birimleri ürün bilgileri elde etmek için sağlanan veya değerleri yayınlandı Edebiyat.
    4. Ayrıntılar için arabellek bileşenleri girin. 'Numarası tür solvent içinde çözünmüş' değiştirmek için her arabellek bileşen satırları eklemek veya kaldırmak için aşağı açılan menüsünü kullanarak. Micelle oluşturmayan durumunda deterjanlar, deterjan'ın kritik micelle konsantrasyonu (CMC), ayrı arabellek bileşenleri olarak ücretsiz deterjan monomerleri içerir.
    5. 'Gönder' nötron kontrast hesaplamalar ve saçılma uzunluğu yoğunluğu ve kontrastı maç puanı yanı sıra D2O içinde verilen herhangi bir yüzdesi, bu parametrelerin belirlenmesi için formüller tablosu sağlar bir sonuçlar sayfası oluşturmak için tıklatın arabellek. Saçılma parametreleri bileşen CMPs özel önem ile gözden geçirin. Maç puanı (%10 D2içinde O) benzer ve ücretsiz micelle konsantrasyonu düşük sonra ortalama CMP olabilir kontrast eşleştirmek için kullanılan deterjan katkıları. Çoğu durumda, CMP deterjan grubu baş ve kuyruk bir çekirdek-kabuk form faktörü doğrudan yalnız protein saçılma sinyalini topluluğu obfuscates SANS veri üreten daha fazla 10-15 oranında farklılık gösterir.
  3. Deterjan baş grup ve kuyruk arasındaki kontrast değerlendirmek. Deterjan baş grubu ve alkil zinciri kuyruk CMPs olmadığın zaman uyumlu kullanılabilirlik ve döteryum yerine deterjan birleşmesiyle değiştirilmesine bile■enleri uzunluğu yoğunlukları saçılma izin verebilir. Çoğu durumda, bu karışık micelle döteryum yerine alkil zincirleri ile özdeş bir deterjan Incorporation aracılığıyla oluşturan gerektirir. Döteryum ilavesi alkil zinciri kuyrukları tarafından kurulan çekirdek saçılma uzunluğu yoğunluğu yükseltir. Baş grubu kabuğunu CMP ve alkil zinciri çekirdek CMP yaklaşık olarak eşit değerler böyle istediğiniz son nokta, bu durumda olduğunu.
    1. H-kuyrukları ve tam aksine baş gruplarla eşleşen elde d-uçlar arasında karıştırma uygun oranını belirleyerek baş grubu kabuğunu CMP için yaklaşık olarak eşit olmak CMP deterjan micelle çekirdek yükseltmek. Döteryum yerine alkil zinciri kuyruk için CMP bilgisine Bu tayini için bir önkoşuldur. N-Lauryl β-D-maltoside (demir) için piyasada bulunan bir meslektaşı ile tüm alkil zinciri hidrojen döteryum (d25-DDM) tarafından yerine kullanılabilir. 2.1. adımda vardı kuyruk özetlenen kontrast hesaplamalar tekrar ' yerine 'h-kuyruğu'.
    2. H-d-kuyruk baş grup CMP ile kontrast eşleştirmek için gerekli kuyruğuna köstebek oranını hesaplamak. Aşağıdaki formül bu tespiti ile size yardımcı olabilir:
      Cumhuriyetçi millet partisiBaşkanı Cumhuriyetçi millet partisih-kuyruk = * χh-kuyruk + CMPd-kuyruk * χd kuyruk
      CMP saçılma uzunluğu yoğunluğu ve χ birim kesir deterjan kafa, h-kuyruk ya da d-kuyruk bileşeni için orada. DDM tamponlu çözümleri d25-DDM döteryum yerine alkil zincirlerle olarak toplam deterjan (köstebek tarafından % 43) ağırlıkça % 44 birleşmesiyle %48.5 D2O baş ve kuyruk bileşenleri için tek bir CMP üretir.
  4. Döteryum ikame membran protein için derecesi göz önünde bulundurun. Protein yeterli saçılma sinyalini ölçmek için CMP protein için en az %15 D2O çözüm deterjan CMP uzak ve ölçüm koşulları olmalıdır. Sinyal bu % fark Meydanı ile artar. CMP etiketlenmemiş bir proteinin genellikle ~ %42 D2O çözüm (CMP birçok deterjan baş gruplarına benzer) ile ortaya çıkar, döteryum protein etiketleme hemen hemen her zaman bir zorunluluk olduğunu. 52

3. hızlı ve membran Protein ilgi arındırmak

  1. LB (lysogeny et suyu) orta hazırlamak ve Escherichia coli büyümek (E. coli) hücreleri hedef protein sırası için bir indüklenebilir ifade vektör yataklık.
    1. En az ortam hazırlamak. 7.0 g/L (NH4)2H2O veya D2O, yani dağıtılması4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1.6 g/L KH2PO4, 0.50 g/L diammonium hidrojen sitrat, 5.0 g/L gliserol, 1.0 mL/L % 20 w/v MgSO 4·7H2O ve 1.0 mL/L Holme izleme metaller (0.50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/M CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22.3 g/L Na2EDTA·2H2O ve 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Uygun antibiyotik hisse senedi çözümler H2O veya D2O. kullanmaya hazırlamak
    3. H2O veya D2O. kullanarak izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside hisse senedi çözümünü hazırlamak
    4. Tüm çözümler içine kuru, Steril konteyner şişe üstü Vakum kullanma ve 0,22 mikronluk gözenek boyutu filtreleriyle şırınga steril-filtre.
  2. E. coli hücrelerine ölçek-up için bir deuterated protein overexpression döteryum etiketli orta öncesinde uyum.
    1. 3 mL LB orta Lysogeny suyu (LB) agar plaka izole bir kolonisi veya dondurulmuş gliserol hisse senedi hücrelerden aşılamak. Titreyen bir kuluçka 250 RPM'de 37 ° C'de hücrelerin büyümesine veya sıcaklığı 30 ° c veya daha düşük büyüme kültür gecede kuluçka önlemek için azaltmak.
      Not: Adaptasyon yordamı çeşitli olabilir. 55 , 56 , 57
    2. Bir kez LB kültür 600 optik bir yoğunluk büyümüştür nm (OD600) ~ 1, 1:20 H2O en az orta 3 ml seyreltik ve bir OD600 ~ 1 için büyür. 1:20 tekrar 50, 75 ve %100 D2O (kadar veya istenilen D2O yüzde) içeren en az orta kullanarak dilutions.
      Not: olarak D2O içeriği artar, büyüme oranları azalacak. D2O yüzde olarak büyüme medya ve döteryum ikame protein arasındaki ilişkiyi literatürde bildirilmiştir. 58 , 59 , 60
    3. Deuterated hücre kütlesi (Şekil 3) verimini artırmak için bir biyoreaktör kültüründe büyümeye devam.
      Not: Adım adım yordamlar biyoreaktör işlemi için başka bir yerde inceledik. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Hasat ve E. coli hücre membran çıkarma ve protein arıtma için koşullar
    1. Hücreleri tarafından Santrifüjü ~ 6.000 x g ~ 30-45 için de cips min 4 ° C'de
    2. Hücre Pelet ~ 30 dakika buzda arabellekte ıslatarak yumuşatmak. Sonra yavaşça hücre Pelet arabellekte yavaşça serolojik damlalıklı veya yumuşak ~ 1 g ıslak hücre kütlesi/10 mL arabellek son bir konsantrasyon için 2D bir rocker üzerinde sallanan pipetting tarafından resuspend.
      Not: bir örnek arabellek 50 mm'dir HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit), pH 7.5, 200 mM NaCl bir proteaz inhibitörü tablet ile desteklenmiştir.
    3. Resuspended hücreleri ile 10.000 PSI, yüksek basınçlı homogenizer üzerinden üç geçer çıkış soğutma parçalayıcı.
      Not: Gerekli ölçek bağlı olarak, diğer lizis yöntemleri kullanılan (Örneğin, Fransız basın veya sonication) olabilir.
    4. Pelet hücre artıkları Santrifüjü ~ 4000-5000 x g 4 ° C'de 15 dakika at tarafından Süpernatant açıklık kadar bu adımı yineleyin.
    5. Ultracentrifuge (30-45 dk ~ 150.000 x g) süpernatant çözünen içeren önceki adım ve membran kesirler. Pelet ultrasantrifüj sonra membran kesir içerir.
    6. Membran Pelet içinde büyük bir Dounce homogenizer resuspend ve membran kesir tekrar ultrasantrifüj tarafından (adım 3.3.5) yalıtır. Gevşek ilişkili proteinler kaldırmak için en az bir kez bu adımı yineleyin.
    7. Membranlar ~ 30 dk içinde deterjan arıtma için uygun içeren bir tampon 4 ° C'de yumuşak Rock yaparak solubilize. Süspansiyon bulutlu saydam olarak döner solubilization belirgindir. Çözünmez malzeme ultrasantrifüj (30-45 dk ~ 150.000 x g) çıkarın.
      Not: Bir örnek arabellek 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole ve % 4 (w/v) DDM Ni2 + benzeşme Kromatografi tarafından arıtma olduğunu.
  4. Daha önce protonated formları için geliştirilen bir protokol sonrası protein arındırmak.
    Not: Naing ve ark. öğesini hexahistidine M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl proteaz (d-MmIAP) için bir örnek arıtma iletişim kuralı için bkz. 65 son verim oldu ~ 1 mg deuterated tüm bunların kullanıldı 5 L deuterated hücre kültür büyüme SANS deneyinde (Şekil 4).
  5. Saf protein "Son Exchange arabellek" kontrast eşleştirmek için değiştirin.
    1. 250 mM NaCl ve % %0.05 49 D2' O. DDM (%0,028 DDM ve %0.022 d25-DDM) Toplam 200 mL "Son Exchange eşleştirme, Örneğin,20 mM HEPES, pH 7.5 kontrast için doğru karışımı içeren arabellek" hazırlamak,
    2. Bir boyut dışlama sütunla equilibrate > 2 sütun cilt (CV) "Son Exchange arabelleği" olarak hızlı Protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemini kullanarak 3.5.1.
    3. Örnek enjekte sonra sütun çalıştırın ve faiz protein karşılık gelen kesirler yalıtmak.
    4. İstenen son konsantrasyonu (2-5 mg/mL) protein konsantre.
      Not: ~ 300 μL hacmi SANS için kullanılan 1 mm silindirik kuvars küvet doldurmak için gereklidir.
    5. Bir aliquot arka plan çıkarma SANS için eşleşen tamponunun saklıdır.
      Not: Aliquot doğrudan hazır arabellek veya ideal temiz elüsyon kesir FPLC Çalıştır sonunda alınabilir.

4. ışın zaman ve SANS veri toplamak için son hazırlıklarını yapmak

  1. Teklifi kabul etti ve site erişimi kabul gördü sonra atanan ışın saat öncesinde gerekli tüm eğitim tamamlayın. Bu prearrival, web tabanlı eğitim yerinde radyolojik, laboratuvar ve enstrüman özel eğitim yanı sıra içerir.
    Not: Eğitim gereksinimlerini önceden varış ilk kez kullananlar için dikte verebilir. Daha fazla bilgi çevrimiçi kullanılabilir. 66
  2. Örnekleri ve arabellekleri veri toplama için yükleyin.
    Not: Biyolojik küçük açı Nötron saçılma genel bir bakış (Bio-SANS) enstrüman örnek çevre alanı Şekil 5' te gösterilen.
    1. Örnekleri ve arabellekleri kuvars hücrelere yükleyin. Kuvars hücreleri enstrüman bilim adamı veya tesis mevcuttur. Jel-yükleme ipuçları çoğu örnek hücre dar açılış erişmek için kullanın.
    2. Işını çekim kapalı olduğundan emin olun, sonra örnek çevre bölgesi yaklaşım ve kuvars hücreleri örnek değiştirici yerleştirin. Örnek değiştirici pozisyon her örnek hücre için kaydedin.
    3. Kontrol..... .et ve ışın yolu tıkanıklığı ücretsiz olduğundan emin olun o zaman örnek çevre bölgesi bırakın ve ışın çekim açın.
      Not: Dikkatle tüm tesis kural ve yönetmelikleri takip, tüm ilanları itaat ve enstrüman bilim adamının öğüdünü tut. Örnekler kiriş kaldırıldı ve uzun süre maruz kiriş aşağıdaki özel önlemler olmadan manipüle. İle bir radyolojik kontrol teknisyeni (RCT) önce bu yordamları bakın.
  3. Tablo tarama otomatik veri toplama için yürütmek
    1. Araç özel denetim LabVIEW-esaslı bilgisayar yazılımı, spektrometre enstrüman denetim ortamı (baharat) aracılığıyla faaliyet. Araç operasyon Nötron saçılma bilim adamı tarafından sağlanan yönergeleri izleyin. Tablo tarama işlemi windows genel bakış Şekil 6' da verilmiştir.
    2. Uygun yerlerde gerekli bilgileri girdikten sonra tablo taraması yürütmek ve bir otomatik veri toplama işlemi başlayacak. 'Tablo tarama durumu' sekmesinden ilerlemesini izlemek.

5. 1 D arsa için 2B görüntü veri azaltmak

  1. Her örnek ve arabellek veri dosyasından kaydedilmiş Tarama numaraları tanımlayın. Her ölçüm benzersiz tarama numarası atanır. Bu bilgiler veri azaltma sırasında her karşılık gelen örnek ve tampon çifti belirlemek için yararlıdır.
  2. MantidPlot yazılım ve Python komut azaltma için kullanın
    1. Nötron saçılma kullanıcıları uzak analiz kümede onların verilerine erişmek için rapor tafsilât ile sağlanır. 67 uzaktan analizi küme oturum açın ve "MantidPlot" komut satırından çalıştırın. Şekil 7 ve Şekil 8 adımları yardımcı olmak için sağlanmıştır.
    2. Nötron saçılma (Bu genellikle deneme sırasında olacak) bilim adamı ile bir Kullanıcı azaltma komut dosyası alın; Bu betik Python tabanlı ve tüm gerekli kalibrasyon ve 2D saçılma dağınık yoğunluklarda 1 D komplo içine saçılma açı, I(Q) bir fonksiyonu olarak küçültme için ölçekleme ayarlamalar içerir.
    3. MantidPlot içinde sağlanan Kullanıcı azaltma komut dosyasını açın ve karşılık gelen tarama numaraları veya kimlik örnek ve tampon çiftleri için uygun listesinde yer.
    4. Dört sütunlu metin dosyası olarak azaltılmış verileri oluşturmak için komut dosyasını yürütün (sütun sıradır Q, I(Q), I(Q) hatası, Q hatası) belirtilen konumda. Uygun çalışma alanında MantidPlot sağ tıklatıp "hataları ile ilk saçılma profilleri incelenmesi için... çıkart" i seçin.

6. saçılma parçacık yapısal parametreleri için verileri analiz

  1. Azaltılmış veri dosyasını çözümleme sunucusundan güvenli FTP dosya aktarımı kullanarak yerel bir bilgisayara aktarın. Bu FileZilla veya CyberDuck gibi yazılım kullanımı ile yapılabilir. Analysis.sns.gov giriş sayfasında ilgili ek talimatlar vermesi ve analiz sunucu dosya sistemine bağlanmak için ayrıntılar sağlanmaktadır.
  2. ATSAS yazılım Süiti65,68 (tüm ATSAS suite) yükleyin. 69 tek program70 kullanılabilir ayrıca durumda yani yapısal parametreleri ve ab initio modelleri belirleme SANS verileri analiz etmek için.
    Not: Birçok seçenek SANS biomacromolecules veri analizi için kullanılabilir. 45
  3. PRIMUS71 verileri çizmek için kullanmak, ölçekleme ve çıkarma ve Guinier analiz arabellek.
    1. ATSAS 'SAS veri analizi' başlatmak uygulama ve yük azaltılmış veri dosyaları örnek ve tampon çiftine karşılık gelen.
      1. Arabellek düzgün ölçeklemek için yüksek Q adlı bir veri aralığı seçin (Q > 0,5-1Å) nerede her iki profilleri benzer ve düz ve 'Operasyon' altında bulunan 'Ölçek' düğmesini tıklatın. Bu iki düz bölgeleri üst üste öyle ki bir ölçek faktörü arabelleğe uygulanır. Dikkatli olun: örnekle eşleşmesi için arabellek yoğunluğu ölçekleme haklı makul fiziksel bir nedeni olmalı. Tutarsızlık büyükse, bir enstrüman bilim adamı arka plan çıkarma geçerli yaklaşımlar başvurun. 44 , 45 , 72
      2. Tüm noktalarını görüntülemek için veri aralığını artırın. Bu işlemi gerçekleştirmek için ' çıkar' tıklatın. Göstergedeki arabellek düşülen datafile sağ tıklayın ve daha sonraki analiz için bu dosyayı kaydedin. Şekil 9 'Operasyon' sekmesini kullanımı özetlenmektedir.
    2. Bir Guinier 'SAS veri analizi' uygulama 'Analiz' sekmesini kullanarak arabellek düşülen örnek veri analizi gerçekleştirin.
      1. Uygun dosya listede seçili olduğundan emin olun ve 'Eylemsizlik yarıçapı' tıklatın. Uygun bir Guinier gerçekleştirmek için otomatik bir girişim 'Autorg' butonuna basarak sağlanacaktır.
      2. Tüm düşük-Q veri içerir ve veri aralığı uzağa kadar Qmax Yüksek-Q puan alarak daralma başlamak için kullanılan veri aralığını genişletin * Rg sınırıdır 1.3. Kalanlar Arsa veri uygun aralığında doğrusal doğrulamak için kullanın. Uygun Guinier verimleri yaklaşık bir Rg ve0 saçılma parçacıklar için.
      3. Uygun bölge ufak değişiklikler yapmak ve bu değerler için uyum içinde kullanılan veri aralığını duyarlılığını izlemek. Şekil 10A 'Eylemsizlik yarıçapı' araç kullanımını gösterir.
  4. Olasılık dağılım fonksiyonu (P(r)) GNOM. elde 73 burada oluşturulan çıktı dosyası süreç modelleme ab initio için giriş olarak kullanılacak.
    1. Başlangıç uzaklığı Dağıtım Sihirbazı'nı veri için iyi bir uyum elde etme 'Analiz' sekmesini içinde bir kalite modeli elde etmek için esastır. Doğru uygun elde etme hakkında daha fazla bilgi için lütfen Putnam, et al. tarafından İnceleme74 bakın
      Not: GNOM programı uygun mesafe dağıtım Sihirbazı'nı ötesinde hakkında ek bilgi sağlar. Şekil 10B 'Mesafe dağıtım' aracı uygun kullanımını gösterir ve Şekil 11 yaygın hataların bazıları gösterilmektedir.
    2. VSEÇMAK molekül içinde en fazla Soygazlar mesafeyi belirlemek.
      1. Rmax zorlamak için kutusunu genişletmeyi VSEÇMAK için tahmini bir değeri = 0 ve Dmax için büyük bir değer girdikten (150 Å, örneğin). İlk x-kesme noktası P(r) arsa içinde bu tahmin verir.
      2. Bu VSEÇMAK değer ve kullanılan veri aralığını veya hastalık nöbeti içinde veri ve elde edilen P(r) eğrisi uygun GNOM optimize etmek için kullanılan puan artımlı değişiklikler yapmak.
    3. GNOM uyum rafine ve modelleme adımları izleyen ab initio için iyi uygun parametrelerle GNOM çıktı dosyalarını kaydetmek devam edin.
  5. CRYSON programını kullanarak yüksek çözünürlüklü PDB modelleri profillerden SANS simülasyonu. 75
    1. Program ve Seç seçeneğini '0' açın. PDB dosya adı açılır menüsü dosya tarayıcısı seçin. Zincir deuteration kesirler ve D2O kısmını çözücü uygun kontrast parametreleri elde etmek için belirtme dışında varsayılan ayarları kabul etmek için enter tuşuna basın.
    2. 'Y' girme ve veri dosyası açılır menüsü Dosya tarayıcısında seçerek model deneysel bir veri kümesi için uygun. Geri kalan varsayılan değerleri kabul edin ve çıkış dosyalarının PDB dosya konumunda yazılır. 'Vasileri' dosya için yüksek çözünürlüklü 3D modeli tahmin edilen saçılma profil bilgilerini içerir.

7. Ab Initio modellerden oluşturma veri SANS.

Not: DAMMIF76 ve77 ATSAS bilgisayar yazılımı maiyet içinde DAMMIN kukla atom modelleri (baraj) çıkışı, hangi P(r) veri veya olasılık hakkında bilgi içeren GNOM Benzetimli Tavlama işleminden kullanarak yeniden oluşturmak için kullanılan veya Soygazlar mesafeler saçılma parçacık içinde sıklığı. Bu programlar toplu modunda veya ATSAS-Online web sunucusunda çalışabilir.

  1. 'Analiz' sekmesinde 'SAS veri analizi', 'Dammif' düğmesinden PRIMUS şekil Sihirbazı başlatın ve bir el ile seçim parametreleri kullanın. Sihirbazın giriş Şekil 12' gösterilmektedir.
    1. Uyum (adım 6.3.2) Guinier aralığından tanımlamak ve gezinti düğmelerini kullanarak sonraki adıma geçin. P(r) Arsa (adım 6.4) uygun değerleri tanımlamak ve sonraki adıma geçin.
    2. Süreç modelleme ab initio için parametreleri sağlar. Modeli çıktı için dosya adları (Örneğin, SANSEnvelope) bir önek girin, her iki 'hızlı' ya da 'yavaş' tarz modelleme seçin, modelleri (istatistiksel anlamlılık için önerilen 17) sayısı için bir değer girin, parçacık simetri için kullanılabilen seçeneklerini seçin, anisometry ve açısal ölçeği (biliniyorsa). Kutuları DAMAVER ile ortalama modelleri için denetlenir ve DAMMIN ile son model iyileştirmek emin olun.
    3. 'Kayıt' düğmesini kullanarak işlemini başlatmak. İşlem tamamlandıktan sonra görüntüleme ve kaydetme çalışma dizini.
      Not: tipik modelleme işleminin tek bir küçük protein olarak tipik bir kişisel bilgisayar ile birkaç saat sürebilir. Dosyaları kaydettiğiniz kadar geçici dizinlerde saklanır.
  2. Yerleşimi ve final üst üste zarf içinde ATSAS SUPCOMB kullanarak ilgili yüksek çözünürlüklü modeli ile SANS. Çalışma dizini SANS zarfta uyacak yüksek çözünürlüklü PDB modeli bir kopyasını yerleştirin. Komut satırından SUPCOMB çalıştırın ilk listelenen şablon yapısı ile iki bağımsız değişken olarak PDB dosya adları kullanarak: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Not: Listelenen ikinci dosya adı superimposition şablon yapısı üzerinde son ve sahip yeni koordinatlarını eklenen bir "r" ile yeni bir dosya olarak yeniden.
  3. Ab initio modeli sonuçlar PyMOL (pymol.org), bir 3D Moleküler grafik görüntüleme programı kullanarak görselleştirmek. Şekil 13 PyMOL işlemleri genel bakış sağlar.
    Not: Biomolecules çözüm küçük açı saçılma veri yapısal modelleme için yayın kurallar vardır. 78
    1. PyMOL uygulamasını başlatmak ve görüntülenecek zarf ve SUPCOMB uyumlu yüksek çözünürlüklü yapısı SANS 3D için karşılık gelen .pdb dosyaları açın.
    2. Bu model bir yüzey olarak temsil eden SANS zarf görselleştirin. Tıklayın ' ın ' düğmesini seçin ve model ' göster: olarak: yüzey '.
    3. Yüksek çözünürlüklü protein omurga yapısı bu model bir çizgi film olarak temsil eden görselleştirin. Seçin ' ın ' düğmesinin yanındaki bu model ve seçin ' göster: olarak: çizgi film '. 'C' düğmesini seçerek bir gökkuşağı üzerinden N - için C-terminus zinciri görüntülemek ve ' tarafından Zinciri: Chainbows'.
    4. Netlik için yüzey gösterimi saydamlığını değiştirmek. 'Ayar' menü çubuğundan seçin ' şeffaflık» yüzey» %40 '.
    5. Arka plan beyaz ve opak olun. 'Görünen' menü çubuğundan seçin ' arka plan»' ve 'Bu seçeneği 'Beyaz' arka planı için bu renk işaretlemek için uncheck ve opak' seçin.
      Not: ek işlemleri ve anlamları için PyMOL-ebilmek bulunmak PyMolWiki.org.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir ışın zaman ve enstrüman öneri açıkça böylece önerilen deney geçerli bir değerlendirme yapılan değerlendirme Komitesi için gereken tüm bilgileri iletmek. Bir NSS ile iletişim çok deneyimsiz kullanıcılar için önerilir. NSS ilk fizibilite ve fizibilite, emniyet ve çok etkili bilim potansiyelini vurgulamak için kılavuz öneri gönderme değerlendirebilirsiniz. Teklife bilgiler arka plan bilgileri ve araştırma önemini bağlamının içermelidir; elde edilebilir için beklenen bilgi ve nasıl bu bil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal biyoloji araştırmacılar biomolecules çözümünde biyokimyasal ve yapısal ayrıntılarını (örneğin, toplam boyut ve şekil) edinmek için çözüm saçılma gibi tamamlayıcı yapısal teknikleri yararlanmak. SANS belirlenmesi membran proteinlerinin düşük çözünürlüklü yapıları, modern yapısal biyoloji ve biyokimya bir çekirdek odak için özellikle çekici bir tekniktir. SANS saf protein crystallographic denemeler (1 mg/örnek) karşılaştırılabilir miktarda gerektirir. Yüksek saflıkta deuterated deterjanlar membran protein çalışmala...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss ve Ryan C. Oliver ile UT-Battelle bize nötron bilim Kullanıcı programı ve biyografi desteklemek için DOE ile sözleşmeli-enstrüman Oak Ridge National Laboratory Bu makalede kullanılan, SANS.

Bu el yazması UT-Battelle, LLC, sözleşmeli DE-AC05-00OR22725 ile bize departmanı, enerji (DOE) co-yazar. ABD hükümeti korur ve Yayımcı, yayın, makale kabul ederek ABD hükümeti yayımlamak veya bu makale yayımlanmış form çoğaltmak veya izin vermek için münhasır olmayan, dünya çapında geri dönülmez Odenmis lisans korur onaylar diğerleri ABD hükümeti amaçlı bunun için. DOE DOE kamu erişim planı uyarınca araştırma federal projeleri bu sonuçlar kamu erişim sağlayacak. 82

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Office biyolojik ve çevresel araştırma desteklenen araştırma ORNL'ın merkezi yapısal Moleküler Biyoloji (CSMB) ve biyografi-bilimsel Kullanıcı imkanları bölüm, temel enerji Bilimler Office, ABD Bakanlığı tarafından desteklenen özellikleri kullanarak SANS Enerji. Membran proteinlerinin Lieberman laboratuarında yapısal çalışmalarına NIH (DK091357, GM095638) tarafından desteklenen ve NSF (0845445).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amicon Ultra MWCO 50KDa yoğunlaştırıcı EMD MilliporeUFC905096laboratuvar gereçleri
Amonyum sitrat dibazikFisher ScientificA663orta bileşenli
Amonyum sülfatEMD Millipore2150orta bileşenli
Bioflo 310 Biyoreaktör SistemiEppendorfM1287-2110ekipmanı
Kalsiyum klorür dihidratAcros423525000 orta bileşen
KarbenisilinIBI BilimselIB02025antibiyotik
KloramfenikolEMD Millipore3130antibiyotik
Kobalt (II) klorürAcrosAC21413-0050orta bileşenli
Bakır (II) sülfatAcrosAC19771-1000 Orta Bileşen
Döteryum oksitSigma-Aldrich756822orta bileşenli
Driyerit Gaz ArıtmaCihazı WA Hammond Drierite Co., Ltd.27068
EDTA, disodyum, dihidratEMD Millipore4010orta bileşenli
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3ekipmanı
ve Auml; kta Temizleyici UPC100GE Sağlık ekipman
GliserolSigma-AldrichG5516orta bileşen
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR sütunuGE Healthcare 
İmidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Demir(III) klorür hekzahidratMP BiyokimyasallarICN19404590orta bileşenli
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Magnezyum sülfat heptahidratVWR97062-134orta bileşen
Manganez (II) sülfat monohidratAcrosAC20590-5000orta bileşenli
MaxQ 6000 İnkübe / Soğutmalı ÇalkalayıcıThermo ScientificSHKE6000-7 ekipman
n-Dodesil-d25-β-D-maltopiranosidAnatraceD310T
n-Dodesil-β-D-maltopiranosidAnatraceD310A
Potasyum fosfat monobazikVWR97062-346orta bileşenli
RC 6 Plus SantrifüjThermo Scientific Sorvall46910ekipmanı
SIGMAFAST proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri, EDTA içermeyenSigma-AldrichS8830
Sodyum klorürSigma-AldrichS3014
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich795429
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichS7907orta bileşenli
Steril 25mm şırınga filtresi 0.2 mikro; m PES membranVWR28145-501laboratuvar gereçleri
0.2 & mikro ile steril tek kullanımlık şişe üstü filtre; m PES membranThermo Scientific596-4520 laboratuvar gereçleri
Superdex 200 10/300 GL GE Sağlık 
Superose-12 10/300 GL sütun GE Sağlık 
Ultrospec 10 Hücre Yoğunluk ÖlçerGE Healthcare 80211630ekipmanları
Çinko sülfat monohidratAcrosAC38980-2500 Orta Bileşen
171167011751750117517301

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Membran Proteini AnaliziD teryum Etiketli ProteinGuinier AnaliziBoyut D lama KromatografisiN tron Kontrast E le mesiSANS Veri ndirgemePyMOL G rselle tirme

İlgili makaleler