Yöntem makalesi

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

9.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.

Özet

Saf insan pluripotent kök hücreleri (N-hPSC) ile gelişmiş bir işlevsellik rejeneratif tıp alanında geniş bir etkisi olabilir. Bu iletişim kuralı, verimli bir şekilde lineage astarlanmalıdır, geleneksel insan pluripotent kök hücreler (hPSC) saf benzeri pluripotency için besleyici-Alerjik ya da besleyici bağımlı koşulları ile gelişmiş işlevsellik tutulan dönmek için hedeftir. Klasik lösemi inhibitör faktörü (LIF), GSK3β, bu kimyasal saf reversion yöntemi kullanır ve yalnızca bir tankyrase inhibitörü XAV939 ile desteklenmiş MEK/ERK inhibisyon kokteyl (LIF-2i), (LIF-3i). LIF-3i benimseyerek biyokimyasal, transkripsiyon bir istikrarlı pluripotent devlet ve insan pre-implantasyon epiblast epigenetik özellikleri geleneksel hPSC döner. Bu LIF-3i yöntemi en az hücre kültür manipülasyon gerektirir ve son derece geniş insan embriyonik kök hücre (hESC) ve transgene içermeyen insan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları repertuarında tekrarlanabilir. LIF-3i yöntemi farklılaşma önce yeniden astar bir adım gerekli değildir; N-hPSC doğrudan son derece yüksek verimlilik ile Ayrıştırılan ve karyotip korumak ve epigenomic stabiliteleri (baskılı loci dahil olmak üzere). Yöntem evrenselliğini artırmak için geleneksel hPSC ilk kültürlü protein kinaz (forskolin) ve (LIF-5I) sinyal sonic kirpi (SUS) (purmorphamine) kazara iki ek küçük moleküller ile desteklenmiş LIF-3i kokteyl içinde. Bu kısa LIF-5i adaptasyon adım önemli ölçüde geleneksel hPSC ilk klonal genişlemesi geliştirir ve onları daha sonra saf-döndürülmesi ile LIF-böylece malzeme çekme/subcloning nadir N-hPSC gerek obviating 3i toplu miktarlarda yalnız olmak izin verir koloniler daha sonra. LIF 5i stabilize hPSCs daha sonra anti-apoptotik molekülleri gerek olmadan tek başına LIF-3i içinde korunur. En önemlisi, LIF-3i reversion belirgin geleneksel hPSC geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azalan ve yönlendirilmiş farklılaşma Interline değişkenliği sık silme geliştirir bağımsız hPSC satırları arasında görülmektedir. Temsilcisi karakterizasyonu LIF 3i döndürülmesi N-hPSC, isogenic hPSC fonksiyonel karşılaştırmalar için sağlanan ve deneysel stratejiler lineage astarlanmalıdır vsvardır. saf gibi Birleşik özetlenmiştir.

Giriş

2i (MEK/ERK ve GSK3β inhibitörü) kültür sistemi ilk türdeş olmayan serum tabanlı fare embriyonik kök hücreler (mESC) kültürleri pluripotency fare Preimplantasyon epiblast1benzer bir Tekdüzen yer durumunu iyileştirmek için geliştirilmiştir. Ancak, 2i insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları2istikrarlı bakım desteklemez. Çeşitli karmaşık küçük molekül, büyüme faktörü-takıma ve transgenik yaklaşımlar son zamanlarda putatively yakalama bildirilmiştir benzer insan saf benzeri pluripotent moleküler Devletler2. Ancak, çoğu da bu yöntemler ile oluşturulan "saf gibi" Birleşik karyotip istikrarsızlık, epigenomic defektleri (Örneğin, genel kaybı ebeveyn genomik basma) sergilenen veya farklılaşma potansiyeli Engelli.

İçinde karşıtlık, GSK3β, ERK ve tankyrase sinyal Üçlü kimyasal inhibisyonu kokteyl ve lösemi inhibitör faktörü (LIF-3i) geleneksel hPSC hatları3geniş bir repertuar istikrarlı saf benzeri reversion için yeterli. LIF 3i döndürülmesi saf hPSC (N-hPSC) normal karyotypes muhafaza ve onların ifadeleri saf özel insan Preimplantasyon epiblast genlerin arttı (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i de haiz reversion hPSC moleküler ve biyokimyasal özellikleri artan fosforile STAT3 sinyal, dahil mESC gibi saf pluripotency için benzersiz bir dizi ile azalmıştır ERK fosforilasyon, küresel 5-metilsitozin CpG hypomethylation, genom çapında KSY demethylation, embriyonik kök hücre (ESC)-belirli bir gen rehberleri ve baskın distal OCT4 artırıcı kullanımı. Ayrıca, ile karşılaştırıldığında diğer saf aberrantly hypomethylated sonuçlandı reversion yöntemleri genomik loci baskılı, LIF 3i döndürülmesi N-hPSC edildi sistematik baskılı CpG desen veya kaybı DNA metiltransferaz ifade yoksun (Örneğin, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Geleneksel insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC) büyümek besleyiciler ya da E8 besleyici-Alerjik koşulları üzerinde geniş bir dizi doğrudan LIF-3i kültürünün hızlı ve dökme reversion için saf epiblast gibi devlet elde. Ancak, doğrudan LIF-3i saf reversion bazı kararsız geleneksel hPSC hatları genetik olarak farklı donör kökenden gelen doğan içsel genomik ve soy astarlanmalıdır variabilities nedeniyle verimsiz olabilir.

Böylece, belgili tanımlık yarar LIF-3i yönteminin genişletmek için kademeli optimizasyonu geliştirilmiş ve burada, sunulan bu evrensel saf reversion neredeyse herhangi bir geleneksel hESC veya hiPSC transgene içermeyen satır Fiderler, fazla yükleyiciler kültürlü sağlar. Protein kinaz (forskolin) ve sonic kirpi (SUS) (kazara iki ek küçük moleküller (LIF-5I) LIF-3i kokteylle takviyeleri geleneksel hPSC geçici ilk kültür adımda bu universalized saf reversion yöntemi kullanır purmorphamine) işaret. Geleneksel hPSC LIF-5i bir ilk geçiş onları sonraki kararlı LIF-3i reversion toplu miktarlarda uyum sağlar. İlk LIF-5i adaptasyon geleneksel hPSC E8 veya besleyiciler (önce onların sonraki kararlı, sürekli pasajda LIF-3i yalnız) yetişen ilk tek hücre klonal çoğalması önemli ölçüde artırmaktadır. Geleneksel hPSC satırları adapte ilk LIF-5i bir pasajda için sonraki toplu klonal saf yeniden dönmek hücre LIF-3i koşullarında hangi malzeme çekme ve nadir istikrarlı kolonileri ya da rutin kullanımı subcloning gereğini namussuz passaging tahammül Anti-apoptotik molekülleri veya Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörleri.

LIF-3i yöntemi başarıyla stabil genişletmek ve geniş bir repertuar korumak için istihdam edilmiştir > 30 bağımsız, genetik olarak farklı geleneksel hPSC hatlarında > 10-30 pasajlar ya enzimatik olmayan veya enzimatik ayrılma yöntemleri kullanarak ve İndüksiyon kromozom kanıtı olmadan veya epigenomic anormallikleri, baskılı gen loci, anormallikler de dahil olmak üzere. Ayrıca, sıralı LIF-5i/LIF-3i kültür kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azaltarak geleneksel hPSC satırları geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency artıran şu ana kadar bildirilmiştir tek saf reversion yöntemidir ve büyük ölçüde onların multipotent farklılaşma potansiyeli geliştirmek. LIF-3i saf reversion yöntemi siler doğasında lineage astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları farklılaşma değişkenliği Interline ve hücresel tedavi ve rejeneratif tıp uygulamasında a büyük yarar olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan yordamları hayvan bakımı yönergeleri ve Johns Hopkins okul, Tıp Enstitüsü tarafından hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı protokoller doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

1. hazırlık, fare embriyonik fibroblastlar (MEF) besleyici bağımlı Conventional (hESC orta/MEF) veya saf döndürülmesi (LIF-3i orta/MEF) hPSC kültür

  1. MEF besleyiciler içi düşük geçiş malzemeleri CF1 veya CF1 x DR4 hibrid E13.5 fare embriyo yayımlanmış protokolleri4takip hazırlamak veya satın alabilirsiniz.
    1. Cryopreserve düşük geçiş (p1-p2) MEF kültürler (uzun süreli depolama için) öncesi veya sonrası (6 ay için) ışınlama ve mağaza sıvı azot daha önce4açıklandığı gibi.
    2. Işınlatayım (5000 rad) bir γ - veya X-x-ray-irradiator kullanarak genişletilmiş MEF p5 altında toplu ve aliquots 1.5 x 10 şişe başına6 hücre kısa süreli depolama (6 aydan daha az) bir ultra düşük sıcaklık dondurucu-80 ° C'de hazırlamak.
    3. Plaka 1.2 x 10 arası6 (taze sigara cryopreserved radyasyona maruz) ve 1.5 x 106 (radyasyona maruz cryopreserved) aşağıda açıklandığı gibi besleyici kültürler, hazırlanması için bir 6-şey gelatinized plaka başına MEF.
  2. 6-şey steril doku kültürü tedavi plakaları jelatin kaplı bir biyolojik güvenlik kabin her kuyuya 1,5 mL steril % 0,1 jelatin çözeltisi ekleyerek hazırlayın.
  3. Jelatin kaplı plakalar için en az 1 h 37 ° C'de kuluçkaya veya bir laboratuvar CO2 kuluçka makinesine gece.
  4. Ertesi gün, düşük geçiş (Örneğin, P2 P4) DMSO cryopreserved ve ışınlanmış çözülme aşağıda belirtilen adımları göre (5000 rad) MEF.
    Not: Sigara ışınlanmış MEF gereken de çözdürülen, genişletilmiş ve hemen kullanım öncesinde ışınlanmış.
  5. Cryopreserved bir MEF aliquot bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin. Çözdürme, üzerine tüp etanol ile sterilize ve hemen bir Biyogüvenlik kabini (Örneğin transferi 1 mL DMSO-MEF aliquot 9 mL steril 15 mL MEF ortamda içine içinde MEF Orta (Tablo 1) ile en az 10 kat DMSO cryoprotectant seyreltik Konik).
  6. Santrifüj kapasitesi sulandırılmış MEF hücreleri 200 x g steril 15 mL konik tüpler 5 min için de.
  7. Bir Biyogüvenlik kabini, Aspire edin ve boş hücre süpernatant atmak ve hücre pelet 1-2 mL taze MEF ortamda resuspend.
  8. Yavaşça jelatin çözüm atın ve yukarıda belirtildiği şekilde yeniden MEF orta gelatinized 6-şey plaka, her şey için askıya MEF 2 mL ekleyin. Count MEF hücreleri ve plaka 1.2 x 106 (taze sigara cryopreserved radyasyona maruz) veya 1.5 x 106 (radyasyona maruz cryopreserved) bir 6-şey gelatinized plaka başına MEF.
    Not: CO2 kuluçka Biyogüvenlik kabini aktarılır tüm hücre kültür plakaları yavaşça etanol püskürtülür kağıt ile sonunu olabilir ancak doğrudan etanol yayma Wells önlemek için % 70 etanol solüsyonu ile teniminhala değil.
  9. MEF plakaları geceleme bir laboratuvar CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de eki, kullanmak için önceden izin vermek için kuluçkaya.

2. toplu kısa LIF-5i adaptasyon adım ile sonraki saf Reversion için geleneksel hPSC kültürlerin istikrar

  1. Başlangıç LIF-5i/LIF-3i reversion önce normal bir karyotip G bantlama tarafından sahip olmak için tüm geleneksel hPSC satırları doğrulamak.
    Not: LIF-3i reversion yüksek geçit geleneksel hPSC satır (Örn., P > 40-50) beri bu kültürler olabilir zaten liman astarlanmalıdır, dengeli, verimli ve toplu LIF-3i reversion, olumsuz etkileyebilir genomik anomalileri, kaçınılmalıdır Convetional hPSC satırları.
  2. Korumak ve geleneksel hPSC kültürleri ile doğrulanmış normal karyotypes bir kültür MEF-esaslı sistem (Bölüm 1'de belirtildiği gibi) veya bir besleyici-Alerjik kültür sistemi (göre araştırmacı'nın tercihi) genişletin.
    Not: Her iki besleyici bağlı hPSC/MEF cocultures (4-10 ng/mL bFGF ile desteklenmişÖrneğin, hESC Orta (Tablo 1)) veya besleyici-free (Örn., E8 5 veya mTSER 6 medya (üretici yönergelerine göre vitronectin kaplamalı plakalar) yöntemleri LIF-5i/LIF-3i/MEF sistemi (Şekil 1) kullanarak toplu saf reversion ile uyumludur. Non-enzimatik yöntemler onları reversion için hazırlanıyor önce geleneksel hPSC passaging için tercih edilir. LIF-5i ve LIF-3i medya formülasyonları antibiyotik veya antifungal ajanları içermez. Biyogüvenlik kabini kısırlık ve bakım için standart operasyon kuralları titizlikle herhangi bir bakteri veya mantar kirlenmesini önlemek için dikkat edilmesi bekleniyor.
  3. MEF-dayalı Kültür sistem için MEF besleyiciler gelatinized 6-şey plaka Bölüm 1'de geleneksel hPSC LIF 5i adapte kültürleri passaging önce en az bir gün açıklandığı şekilde hazırlayın.
  4. Sonra geleneksel hPSC kültürler ~ %50 confluency (Yani, 3-5 gün sonra ilk kaplama) ulaştınız, LIF-5i Orta (2 mL kuyusu; başına standart hESC kültür orta yerine Tablo 1).
    Not: bir Biyogüvenlik kabini içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  5. Kültür ve 2 gün içinde LIF-5i CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) için geleneksel hPSC/MEF korumak. Onların sonraki geçit ve LIF-3i istikrarlı reversion için onları adapte LIF-5i orta her gün değiştirin.
  6. Alternatif olarak, (Örneğin, E8 içinde) besleyici-Alerjik geleneksel kültürler, LIF-5i kültür hPSC sadece gece ertesi sabah passaging önce.
    Not: LIF-5i ve LIF-3i kültürler her ikisi de atmosferik (%21 O2) ya da fizyolojik (%5 O2) oksijen ile düzeyleri (% 5 CO2, nemli atmosfer) CO2 kuluçka muhafaza edilebilir.
  7. Passaging önce kültür plakaları bir Biyogüvenlik dolapta yer, LIF 5i adapte geleneksel hPSC kez PBS ile yıkama ve her şey için hücre ayrılma reaktif 1 mL ekleyin. CO2 kuluçka 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya ve yavaşça bir tek hücre süspansiyon geri Biyogüvenlik kabini içine bir pipet ile triturate.
    Not: Enzimatik olmayan ayrılma arabellekleri alternatif olarak passaging için tek hücreleri hazırlamak için kullanılabilir.
  8. HESC Orta (en azından logosuna 2 kat seyreltme) steril 15 mL konik tüpler hücre süspansiyon toplamak ve yavaşça hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından triturate.
  9. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, Aspire edin / süpernatant atma ve hücre Pelet Biyogüvenlik kabini LIF-5i ortamda 1-2 ml resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.
  10. Önceden kaplama MEF plaka PBS (6-şey plakaları bir kuyu başına 2 mL) ile iki kez yıkayın ve 1-2 x 106 hücrelerde (2 mL LIF-5i orta) 1 de PBS yıkanmış MEF plaka üzerine dağıtın.
  11. İlk kaplama yoğunlukları verimliliği replating-ebilmek var olmak son derece değişken saf yeniden dönmek, olmak üzere her bireysel hPSC satır için en iyi duruma getirme ve ayarlayın. Plaka (%5 CO2, nemli atmosfer) bir CO2 kuluçka makinesine koyun.
    Not: Anti-apoptotik reaktifler rutin kullanımı ile bu yöntem çoğu hPSC satırları için tavsiye edilmez. LIF-5i sistem zaten önemli geleneksel hPSC satırları ilk toplu klonal yeniden hassasiyette verimliliği artırır. Ancak, tek seferlik bir ROCK inhibitörü kullanımı (5-10 mikron Y-27632) daha fazla ilk LIF-5i klonal yeniden hassasiyette verimliliği bazı kararsız lineage astarlanmalıdır hPSC satırlar için ilk geçişi için eğilimi ile geleneksel hPSC kültürler artırabilir spontan farklılaşma.
  12. Besleyici-Alerjik kültürler (Örneğin, E8), doğrudan başlangıç LIF-5i adapte Disosiye geleneksel hPSC bir kuyu aktarırsanız bir MEF kaplama iyi (yani, 1:1 geçiş) ışınlanmış.
  13. Ertesi gün, yavaşça ekli olmayan hücrelerin tümünü kaldır, orta Aspire için plaka girdap (PBS yıkama isteğe bağlı) ve LIF-5i Orta 2 mL ile değiştirin. Bir Biyogüvenlik Kabin 3-5 gün için günlük veya hücreleri % 60-70 birleşmesi (Şekil 1) kadar bu adımı gerçekleştirin. Plaka (%5 CO2, nemli atmosfer) bir CO2 kuluçka makinesine koyun.

3. uzun vadeli bakım ve N-hPSC LIF-3i orta genişlemesi

  1. İlk LIF-5i adaptasyon sonraki kararlı LIF-3i kültürler her 3-4 günde bir Biyogüvenlik kabini veya kültürler % 60-70 birleşmesi (Şekil 1) duruma geldiğinde geçiş.
    Not: LIF-3i kültürler özenli bakım ve N-hPSC kültürler yüksek confluency/hücre yoğunluğu uzun süreli kültüründen ulaşmak izin gerektirir (Örn., > 4 gün) sonraki klonal yeniden hassasiyette verimliliği azaltır ve spontan teşvik farklılaşma.
  2. Bir Biyogüvenlik kabini, kültür orta atmak ve her yıkama kültürlerin yavaşça PBS 2 mL ekleyerek de LIF-5i/LIF-3i. PBS atın ve 1 mL hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya.
  3. Hücre süspansiyon toplamak, hESC orta ekleyin (ezelî inhibitörleri ya da büyüme faktörleri (Tablo 1); en az logosuna 2 kat seyreltme) tüm hPSC kurtarmak için ve yavaşça hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından triturate. Süspansiyon steril 15 mL konik tüp aktarın.
  4. 5 min için 300 gr, santrifüj kapasitesi ve Aspire edin / süpernatant atma. Hücre Pelet LIF-3i ortamda yeniden askıya alma. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.
  5. Tabağa ~ 2 x de başına 105 hücre rutin LIF-3i kültürleri passaging için gelatinized 6-şey plaka radyasyonlu MEF. LIF 5i adapte ilk kültürler için başlangıçta daha yüksek bir yoğunluk (4 x 105 hücreleri/de) LIF-3i/MEF ilk geçiş önce plaka.
  6. Yeniden plaka ve LIF 5i adapte hPSC (yukarıdaki gibi önceki gün hazırlanmış) taze PBS yıkanmış radyasyonlu MEF besleyici levha LIF-3i orta üzerine dağıtın. LIF-3i orta her gün değiştirin.
  7. Geçit N-hPSC için en az 4-7 sürekli toplu N-hPSC fonksiyonel çalışmalar veya dondurma kullanmadan LIF-3i orta önce pasajlar. N-hPSC geçişleri birinde kaydedin geleneksel ya da LIF-3i medya.
    Not: LIF-3i reversion yüksek geçiş (Örneğin > p40) soy astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları tavsiye edilmez. Geleneksel hPSC satırları en düşük olası geçit onlar are elde edilebilir vasıl dönmek için bir çaba yapılmalıdır. Ayrıca, böyle N-hPSC kültürler olabilir liman karyotypically anormal klonlar uzun süreli klonal hücre kültür seçimi nedeniyle bu yana 10 LIF-3i geçişleri daha büyük uğramıştır LIF 3i döndürülmesi hPSC kullanımı fonksiyonel çalışmalar için tavsiye edilmez. Taze LIF-5i/LIF-3i reversions düşük geçiş geleneksel hPSC satırlarının yürütülen fonksiyonel çalışmalar için Eğer N-hPSC ile stokları < LIF-3i 10 pasajlar kullanılabilir değildir.

4. dondurma ve çözme LIF 3i döndürülmesi N-hPSC

  1. Dönüştürülen N-hPSC LIF-3i, en az 5-7 pasajlar için fonksiyonel çalışmalar veya uzun vadeli dondurma kullanmak üzere önce yukarıda belirtildiği şekilde genişletin. Pasajlar geleneksel koşulları ve LIF-3i koşullarında cryopreserved her şişe üzerinde kaydedin.
    Not: Aşırı LIF 3i döndürülmesi N-fonksiyonel deneyleri kullanılmaz hPSC her geçiş, cryopreserved, ama daha düşük sonrası reversion pasajlar donma olabilir (e.g., < p3) yoksul veya son derece değişken sonrası tezcan kurtarma verimliliği neden olabilir.
  2. Bir Biyogüvenlik kabini, kültür orta Aspire edin, PBS (iyi başına 2 mL) hücrelerde yıkayın, PBS Aspire edin ve tek hücrelere hücre dekolmanı çözümü (iyi başına 1 mL) kullanarak hPSC kolonileri ayırmak. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 min için tabak koyun. Hücre dekolmanı çözümü ile LIF-3i Orta (2 kat) sulandırmak, hPSC steril 15 ml konik toplamak, hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve LIF-3i Orta (iyi-eşdeğer başına 1-2 mL) hücre Pelet resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
  3. N-hPSC LIF-3i Orta (200 x g 5 min için) santrifüj kapasitesi ve donma çözüm (Tablo 2), bir Biyogüvenlik dolapta hücrelerde en az 1 x 106 hücre/mL bir yoğunluk resuspend.
  4. Hücreleri uzun vadeli depolama kriyojenik tüpler içine aktarmak ve yavaş dondurma konteyner içine yerleştirin. Gecede-80 ° C Buzlukta dondurma örnekleri sağlar.
  5. Ertesi gün, cryovials uzun süreli depolama için sıvı azot dondurucu içine aktarın.
  6. Çözdürme için 37 ° C su banyosu ~ 2 dakika Sterilize flakon (Yani, etanol sprey) süreyle donmuş şişe yerleştirin, steril 15 ml konik hPSC aktarmak ve yavaş yavaş sulandırmak 5 mikron ile desteklenmiş hücreleri 10 kat içinde hESC Orta (Tablo 1) Rho-associated protein kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 steril biyolojik Emanet kukuIeta kabine içinde.
  7. 5 min için 200 x g , santrifüj. Bir Biyogüvenlik kabini, boş hücre süpernatant atın ve hücre Pelet LIF-3i Orta (1-2 mL) 5 mikron ROCK inhibitörü Y-27632 takıma resuspend.
    Not: Y-27632 dışlanması zavallı sonrası çözülme kurtarma verimliliği (Şekil 2) içinde sonuçlanır.
  8. LIF-3i/ROCK inhibitörü PBS yıkanmış MEF kaplama wells üzerine resuspended çözdürülen hücreleri aktarın. LIF-3i kültürler şişe başına 1 x 106 hücre yoğunluğu, cryopreserve. Her biri bu tüpleri besleyiciler bir iyi bir gelatinized 6-şey plaka üzerine çözülme.
  9. Ertesi gün, düzenli LIF-3i orta genişleme Rho kinaz inhibitörü olmadan başlatın.

5. Besleyici kaldırılması için N-hPSC örnekleri topluluğu

  1. Örnekleri LIF-3i/MEF (veya hESC/MEF geleneksel) kültürler hazırlamak için (yani, gen ekspresyonu için (Örneğin, kantitatif RT-PCR, microarrays) veya protein (Örneğin, Western blot) analizleri, LIF-3i kültürler kullanarak MEF besleyiciler üzerinden tüketmek Manyetik aktif hücre sıralama (Mac) ile anti-TRA-1-81 antikor lastikteki üreticinin protokolüne göre kaplı.
  2. Alternatif olarak, aşağıda açıklandığı gibi besleyiciler, kültürleri tüketmek için aşağıdaki basit öncesi kaplama yöntemi kullanmaktadır.
  3. Kabine bir steril biyolojik Emanet Hood, boş hücre süpernatant atmak, 2 mL steril PBS ile Pelet iyi yıka. Yapisan LIF-3i/MEF kültürler hücre dekolmanı çözümü (1 mL/de) kullanarak ayırın. Bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 5 min için kuluçkaya. HPSC steril 15 ml konik toplamak. Yıkama logosuna 2 kat içinde hESC orta, steril 15 mL konik ve 5 min için 200 x g , santrifüj transfer hücrelere.
  4. Bir Biyogüvenlik kabini, her şey LIF-3i/MEF ayrışmış hücre 2 mL LIF-3i orta yeniden askıya alma ve doğrudan yeni bir kuyu taze % 0,1 jelatin ile kaplı bir 6-şey plaka üzerine aktarın.
  5. LIF-3i/MEF hPSC hücreler bir CO2 kuluçka (%5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Yapışık olmayan hücreleri yeni bir konik tüp bir pipet ile toplamak. Yavaşça hESC Orta 2 mL her şey için ekleyin ve kalan yapışık olmayan hücreleri toplamak için girdap.
    Not: Radyoaktif MEF çoğunluğu 1 h, gelatinized plaka süspansiyon hPSC çoğunluğu bırakarak eklemek olacaktır.
  6. Birleştirmek ve 300 x g 5 dk. PBS makinaya hücreleri santrifüj kapasitesi. Ek-hücre Pelet sıvı azot Santrifüjü sonra donma, veya alternatif olarak granül aşağı akım protein veya nükleik asit Analizi (Şekil 2B) uyumlu bir lysing arabelleği yeniden askıya alabiliriz.
  7. Karakterizasyonu LIF-3i hPSC satır ile eşleşen bir geleneksel astarlanmalıdır isogenic hPSC kontrol gerçekleştirin.
    Not: kültür veya saf reversion önce eşleşen bir timepoint, ilgili denetimler arasında ve astarlanmalıdır kültürler içinde içsel değişkenlik nedeniyle hazırlanır. Detaylı iletişim kuralları ve aşağı akım immünfloresan bioimaging için malzeme akış sitometresi, Western blot, gen ekspresyonu (RT-PCR deneyleri ve microarrays), metilasyon çalışmalar (nokta leke, KSY metilasyonu Mikroarray), OCT4 proksimal ve distal artırıcı başka bir yerde ağırlığı muhabir deneyleri ve sinyal inhibitörü deneyleri3sağlanır.

6. saf reversion post: genomik bütünlük doğrulama ve saklama, ebeveyn izlerini LIF 3i döndürülmesi N-hPSC önce işlevsel deneyleri kullanımda,

  1. Başlangıç astarlanmış, geleneksel hPSC kültürler (Örneğin, Giemsa bantlı boyama analiz yayınlanan yöntemleri 7kullanarak) normal bir karyotip bulundurmaktan LIF-5i/LIF-3i reversion işlemini başlatmadan önce ekran.
    Not: Bu artefactual seçici sağkalım avantajı klonal LIF-3i koşullarda sürücü anormal genomik değişiklikler olabilir liman geleneksel hPSC nüfus ortadan kaldırmaktır.
  2. En iyi sonuçlar için taze dönmek geleneksel hPSC kültürlerin bir saf gibi devlet ile LIF-3i için birkaç hafta önce fonksiyonel çalışmalar bunların kullanımı veya farklılaşma yönetti.
    Not: Rutin 'bakım' kültür aşağıdaki saf reversion tavsiye edilmez 10'dan fazla pasajlar için LIF-3i koşullarında uzun. Rutin genişleme ve hESC ve hiPSC satırlarının bakım gerçekleştirilen geleneksel kültür sistemleri kullanarak (Örneğin, E8 veya MEF/hESC orta bFGF ile).
  3. Normal tutma 5 – 7 pasajlar LIF-3i reversion sonra karyotypes için sonrası dönüştürülen N-hPSC satırları değerlendirmek (Örn., Giemsa bantlı boyama analiz7veya başka bir yöntemi tercih ile).
  4. Tüm dönüştürülen N-hPSC satırları normal ebeveyn genomik diziniz tutma için seçim bir DNA metilasyonu Analizi tarafından değerlendirmek (Örneğin, protokolleri CpG DNA Mikroarray Analizi LIF 3i döndürülmesi N-hPSC ebeveyn diziniz sağlanmaktadır için başka bir yerde3 ) LIF-3i reversion 5 – 10 pasajlar sonra.

7. posta saf Reversion: Deneysel tasarım yönergeleri LIF 3i döndürülmesi N-hPSC kullanarak nicel yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri için

  1. Doğrudan LIF-3i N-hPSC içine kurulmuş yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri olmadan ek hücre kültür manipülasyonlar kullanmaktadır.
    Not: (N-hPSC geleneksel astarlanmalıdır koşulları yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri kullanımları önce geri dönüştürme yeniden emişliyani ) LIF-3i yöntemi ile gerekli değildir ve önerilmez.
  2. Tahlil etkileri için kontrol ve değişkenliği bireysel hPSC satırlarının fonksiyonel test Interline, çapraz-lineage özgü farklılaşma potenslerine bağımsız farklılaşma iletişim kuralları en az üç hPSC ile istihdam ederek doğrulamak için satırları elde edilen bağımsız genetik kökenden gelen (Yani, birden çok donör kaynaklı hiPSC ve hESC).
  3. Fonksiyonel karşılaştırmalar için kardeş kültürler, eşdeğer geçiş sayısı hem de paralel olarak geleneksel lineage astarlanmalıdır aynı (isogenic) hPSC satırından ve LIF 3i döndürülmesi hPSC kültürler ayarlayın. Astarlanmalıdır/saf kardeş isogenic hPSC kültürleri kendi ilgili medyada Bakımı (Örn., E8 vs. LIF-3i) ve aynı anda aynı farklılaşma protokolleri ve malzemeler, deneysel herhangi bir önyargı (Şekil 4) ortadan kaldırmak için kullanarak ayırt etmek.
  4. İsogenic saf hPSC karşılaştırma astarlanmalıdır için ayarlamak ve ilk kaplama yoğunluğunu her bireysel farklılaşma tahlil için en iyi duruma getirme.
    Not: Ayrıntılı iletişim kuralları nöral progenitör, kesin endoderm ve LIF 3i döndürülmesi N-hPSC hemato-endotel yönlendirilmiş farklılaşma için başka bir yerde 3temin edilmektedir. LIF 3i döndürülmesi N-hPSC yönlendirilmiş farklılaşma deneyleri daha geleneksel hPSC daha sağlam proliferatif ve ayırt etme kapasitesi var. N-hPSC, genellikle geleneksel hPSC daha düşük bir başlangıç kaplama konsantrasyon gerektirir ve onların geleneksel astarlanmalıdır hPSC karşıtları, enzimatik takip onların klonal yaşam geliştirmek için anti-apoptotik reaktifler kullanımını gerektirmez farklılaşma deneyleri sindirim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı verimli saf benzeri reversion LIF-3i ile hem besleyici bağlı ve besleyici bağımsız lineage astarlanmalıdır geleneksel hPSC kültürlerde (Şekil 1) en iyi duruma getirir. Detaylı iletişim kuralı, açıklanan burada, LIF-3i ya besleyici bağımlı veya besleyici-Alerjik geleneksel hPSC koşulları (Örneğin E8 orta) başlayarak sıralı uyum özetliyor.

Temsilcisi çeşitli geleneksel hESC...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

LIF-3i sistem klasik fare 2i saf reversion kokteyl1 değiştirilmiş bir sürümü insan pluripotent kök hücreler için geçerlidir. (Hangi 2i yalnız genişletilemiyor) hPSC kendini yenileme LIF-2i içinde bu kokteyl ile tankyrase inhibitörü XAV939 ilave olarak stabil. LIF-3i kültür toplu ve geleneksel hPSC verimli reversion için insan Preimplantasyon epiblast3benzeyen bir pluripotent devlet sağlar. Her ne kadar hPSC XAV939 eylem olası karmaşık mekan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yaşam teknolojileri ve Johns Hopkins Üniversitesi (JHU) arasında bir lisans sözleşmesi kapsamında, Dr. Zambidis kök hücrelerinin lisans için üniversite tarafından alınan telif pay hakkına sahiptir. Bu düzenleme şartları JHU tarafından çıkar çatışması ilkelerine uygun olarak yönetilir. Bu veri ve malzemeleri paylaşımı günlük ilkeleri yazarların bağlılık değiştirmez.

Teşekkürler

Bu eser hibe NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Yenilik Ödülü, Maryland kök hücre araştırma fonu (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk bilim Forum Ödülü ve Moseley Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716kullanımı 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276kullanımı 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315kullanımı 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42kullanımı 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695kullanımı 1:1000 (Western blot), total protein detection için
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370kullanımı 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145kullanımı 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432kullanımı 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Akullanımı 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Gkullanımı 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139kullanımı 1:1000 (Western blot), total protein detection için
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388kullanımı 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Rkullanımı a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068kullanımı 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069kullanımı 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193kullanımı 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161kullanımı 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183Vitronectin XF™ matrix için dilüent
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945ayrıca 6.2 line olarak da adlandırılır
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gsuda yeniden çözün ve otoklav ile sterilize
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009DMSO içinde 10mM olarak yeniden yapılandırın
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant

Kaynaklar

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Naif Pluripotent K k H crelerLIF 3i Y nteminsan Embriyonik K k H crelerind klenmi Pluripotent K k H crelerBesleyici H cresiz K lt rH cre Pasajlamamm nofloresan BoyamaWestern Blot AnaliziTeratoma Diferansiyasyonu

İlgili makaleler