Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Pankreas adacıkları of Langerhans, insülin, dolaşan tek kaynağı diyabet eğitim araştırmacılar için kritik bir doku bulunur. Verilen herhangi bir organizma adacıkları değişken boyutu, hücre türü frekans ve mimari^1,2,3var. Vivo yapısı ve endokrin hücre kompozisyon pankreas adacıkları çalışmaya geleneksel pankreas dokusu^4,5kesit tarafından stratejisidir. Bu yana adacıkları toplam pankreas hücresel içeriği yalnızca küçük bir kısmını oluşturan, Moleküler çalışmalar izole adacıkları üzerinde gerçekleştirilir. Ex vivo adacık kültür deneyler, besin tepki testi gen modülasyon (transfection, iletim) veya deneysel tedaviler endokrin hücre hayatta kalma, yayılması ve işlev oransal mekanizmaları içine önemli fikir sağlamak ^{5 , 6}.

Ex vivo adacık deneyler kez bütün adacıklar Moleküler çalışmalar veya histolojik veya moleküler çalışmalar monolayer^5,6' yetiştirilen dağınık adacık hücre kullanarak analiz edilir. Moleküler analiz bütün adacıklar ciddi uyarı ne zaman herhangi bir tek hücre türüne yaygınlaştırılması yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar doğurabilir intermixing hücre tiplerinin tanıtır. Hücre dağılımı sonrası kültür mikroskobu için coverslips üzerine hücre türüne özgü sonucu ölçüm verir, ancak yanıt-e doğru müdahale değiştirebilir ve mimari ile ilgili sonuçları tanımlaması engellemektedir adacık mimari bozan. Ayrıca, genellikle sadece tek bir sonuç ölçülebilir; Örneğin, beta hücre çoğalması ve beta hücre ölümü aynı koşullar altında ölçmek için iki ayrı deney gerçekleştirilmesi gerekir. Bu yaklaşımlar da arası adacık değişkenliği, bir alandaki artan ilgi alanı için kör vardır. Sıralama adacık hücreleri tarafından akış sitometresi hücre türüne özgü Moleküler çalışmalar veya tek hücre RNA çalışmaları için pahalı, zaman alıcı, limited tarafından doku bolluk, mimari ortadan kaldırılması ve rutin hücre kültür analizleri için uygun değil ama zarif ^{5 , 7}. bütün-mount immunostained adacıklar confocal görüntüleme yüksek kalite mimari sağlam veri sağlar, ancak emek yoğun ve veri her örnekten elde edilen sonuçlara tek immunostaining⁸' olarak tanımlanabilir sınırlıdır.

Yüksek kalitede parafin kesitler sonrası kültür bütün adacıklar oluşturma yeteneği bu endişeleri çoğuna hitap. Yüksek maliyetli, düşük-bereket adacık doku benzersiz genetik modellerini veya insan organ bağış ya da adacıkları durum sonrası içinde VIVO veya vitro deneysel manipülasyon, değerli bulunur. Birden fazla parafin kesitler aynı adacıkları alma aynı deneyi üzerinden birden çok hücre türüne özgü, bozulmamış mimari analizleri sağlayacak.

Adacık granül kesit için oluşturmak için varolan kusurlu tekniklerdir. Histoloji optimize edilmiş özel işlem⁹' a zor olan küçük ya da parçalanmış doku örnekleri de dahil olmak üzere histolojik ve saytolojik örnekleri işlenirken kullanılan bir sulu düşük erime noktası jel olan. Bir adacık yaklaşım katıştırma adacıkları özel bir microcentrifuge tüp içinde askıya alma, malzeme cips, agar fiş almak sonra işlemek ve^10,11kesit için embed için santrifüj kapasitesi etmektir. Katılaşmış örnek tüp alttan zaman alıcı ve zor, önde gelen örnek zaman zaman parçalanma ve kişisel yaralanma riski işlemdir. Adacıkları yetersiz adacık dağıtım bölümlerde bu yöntem elde edilen önde gelen fiş ipucunda yoğunlaşmıştır. Öyle ki bir adacık-yoksul bölgesi kesit için sunulabilir katıştırma fiş yuvarlak alt zorlaştırmaktadır. Genel olarak, bu yöntem düşük verim ve elde edilen bölümlerinde olmalı adacık dağıtım yol açar.

Bu yeni yöntem adacık bölümleri hazırlanması için Basitleştirilmiş ve geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Adacıklar içinde küçük bir birim konsantre ve daha sonra tek bir düzlemde adacıkları ile küçük bir disk oluşturmak için mikroskop slayt pürüzsüz yüzeyi yerleştirilir. Histogel-adacık disk daha sonra kısaltılmış dehidratasyon ve Ksilen infiltrasyon Protokolü katıştırma parafin için işlenir. Microfuge tüp dibinde adacıkları konsantreleri, önceki yaklaşım, aynı zamanda bir karşılaştırma olarak yapılır. Bu yeni teknik adacıkları bölüm, her bölümde adacıkları dağıtımını başına verimi artırır ve adacık blok kaset aktarmak için daha az zaman alır. Bu teknik adacık biyologlar için yararlıdır veya yerel doku yapısı tek bir örneğinde birden çok sonuçlar ölçerek düşük-bereket dokusunun üretken en üst düzeye çıkarmak isteyen doku parçaları okuyan diğer bilim adamları kullanın.

Hayvanları içeren tüm yordamları UMass tıbbi okul kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi. İnsan adacık çalışmalar UMass kurumsal İnceleme Kurulu tarafından insan denekler kullanımını karıştırmayın çünkü IRB gözden geçirme veya muafiyet için değil hak kazanmak için belirlenmiştir.

1. adacık yalıtım ve kültür

1. Adacıkları yalıtmak ve kendi seçtiğiniz yöntemi kullanarak ekzokrin ve duktal doku bulaşıcı ayrı.
   Not: Bu yöntem collagenase duktal üfleme ve Ficoll ayrılık¹² (kemirgen) veya sonrası sevk irsaliyesi adacıkları entegre adacık dağıtım programı (IIDP¹³; insan) tarafından izole adacıkları kullanarak optimize edildi. Adacıkları P200 micropipette ile seçilmiş.
2. Adacık morfoloji en iyi duruma getirmek için adacıkları gecede 10 mL tam adacık Orta (RPMI %10 FBS, penisilin/streptomisin ve 5.5 mmol/L glikoz) içeren % 5 CO₂ 37 ° C'de bir oksijen odasında kurtarmak izin Bu adımı bölümler elde etmek için gerekli değildir, ancak adacıkları sonra bir iyileşme döneminde daha sağlam (bkz. Şekil 2).

2. adacık fiksasyon

1. Düşük-bağlama P200 ipucu kullanarak, bir kalibre edilmiş bir 1,5 mL düşük bağlama microfuge tüp içine bir stereomicroscope altında kullanılması yaklaşık 250 adacık eşdeğerleri (IEQ)¹³ futbolla. Düşük-bağlama ipuçları ve tüpler adacık kaybını azaltmak.
2. Adacıkları microfuge tüp altına yerleşmek izin verir. Çoğu süpernatant ile herhangi bir adacıkları değil çıkarmak için dikkat çekici bir P200 damlalıklı ipucu kaldırın.
3. PBS 1 mL ekleyin. Hızı 200 x g ulaşıncaya kadar sallanan bir kova santrifüj tüpü santrifüj kapasitesi ve spin durdurmak. Süpernatant kaldırın. PBS yıkama, iki yıkar toplam için yineleyin.
4. 500 µL % 10 formalin çözüm veya taze yapılmış % 4 paraformaldehyde ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düzeltmek. Bu yöntemde test edilen sonuçlar için bu fiksasyon Yöntemler ayırt edilemez. Daha kısa fiksasyon da mümkün olabilir; Bu fiksasyon süresi için istenen sonucu en iyi duruma getirmek için tavsiye edilir.
5. Sabitleştirici P200 bahşiş ile kaldırın.
6. PBS 1 mL ekleyin. Hızı 200 x g ulaşıncaya kadar tüp santrifüj kapasitesi ve spin durdurmak. Süpernatant kaldırın. PBS yıkama, iki yıkar toplam için yineleyin.
7. Hemen bir sonraki adıma geçin.

3. adacık disk (Şekil 1) hazırlanması

1. İlk kullanımda, 70 ° c (Örneğin, Histogel) jel eritin ve aliquots 1.5 mL microfuge tüpler uzun süreli depolama için yapmak. Aliquots yeniden kullanılmış olabilir bu yana aliquot birim önemli değildir.
2. 70 ° c (örnek başına yaklaşık 100 µL) jel microfuge tüp jel aliquot 70 ° C'ye ayarla ısı taşını içeren yerleştirerek sıcak
3. Özel mavi boncuk (her örnek için 10 µL) 1,5 mL temiz microfuge tüp içine aktarın. İyice boncuk pipetting önce resuspend.
   Not: Mavi boncuk özel düğme ve parafin blok katıştırılmış malzemenin görsel tanımlama yardımcı olan adacıkları ile karıştırılır. Mavi boncuk kullanılan sayısı sonucu için kritik değildir, ancak aşırı boncuk önlemek (> 5 x adacıkları sayısı) adacıkları bölümlerde en uygun dağıtımına olanak tanımak için.
4. Mavi boncuk ile 1 mL PBS, iki kez yıkayın. Her yıkama için boncuk vasıl 800 x g 1 dk spin. Sonra ikinci yıkama, x 10 µL PBS, burada n örnek tüpler sayısıdır (n+ 2) boncuk resuspend; Örneğin, 2 örnek tüpler için 40 µL boncuk için eklemek için PBS birim olacaktır.
5. Adacıkları (200 x g için kısa spin) içeren microfuge tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant çoğunu kaldırın. 10 µL micropipette İpucu İpucu off makas ya da bıçak ile kesme ve her örnek için temiz bir ipucu kullanarak her adacık tüp boncuk 10 µL ekleyin. (Adacıkları kaybetmemek için) birlikte kullanmayın.
6. Adacıkları ve boncuk (200 x g için kısa spin) santrifüj kapasitesi. Bir kesilmemiş 10 µL micropipette ucu ile mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.
7. Mikroskop slayt örnek kimliği için etiket. İki ya da üç örnekleri her slaytta hazırlanabilir. Yer ısıtılan jel ile ısı blok yakındaki bankta slayt. 3-5 İpuçları 20 µL düşük bağlama micropipette ipuçları bir jilet veya makas ile örnek başına kesti. İki P20 Mikropipetler birinden diğerine geçiş hızlı izin vermek için kesme ipuçları ile yükleyin.
8. İlk micropipette kullanarak, 15-20 µL sıcak jel adacıkları/boncuk microfuge tüp ekleyin; Hemen mix, bubbles kaçınmak; ve forma slayt sıvı agar/adacıkları/boncuk karışımı uygulamak bir < 1 cm çapında yuvarlak yüzey. Dış jel yüzük için alan bırakarak slaydın kenarına yakın belgili tanımlık yuvarlak yüzey yer (sonraki adım). Slayt adacıkları ve boncuk yerleşmek için bir kaç kez hafifçe dokunun.
9. İkinci bir micropipette kullanarak, sıcak jel 20 µL örnek tüp ekleyin. İlk micropipette, mix yeni jel kuvvetlendirmek başlarsa ısı bloğunda yeniden ısınma herhangi bir kalan adacıkları/boncuk ile kullanarak bu karışımı orijinal disk çevreleyen Slayta Uygula. Gerektiğinde ek önceden kesilmiş ipuçları, disk istenen boyutu ve kalınlığı kadar kullanarak yineleyin.
   Not: dış halka biraz daha kalın ise genellikle disk kullanımı kolaydır. Genellikle, 3 x 20 µL jel yeterli olur. Bu adım tüp yıkama tarafından adacıkları kaybı en aza indirir ve adacık-yoksul özel disk işleme kolaylaştırmak için disk dışarı doğru ekler.
10. Tek tek her diski hazırlamak ve dikkatli örnek sipariş çoklu diskler her slayta yerleştirerek Eğer takip.
11. 10 dakika veya jel katılaşır kadar düz bir yüzeye bir kapak ile ıslak buz slaytları yerleştirin. O kurur Eğer kapalı cam disk slayt daha zordur.
12. Etiket biyopsi işleme/doku kaset kalem, örnek başına bir ile gömme. Mavi kağıt ıslatma önlemek için slaytın arkasına kuru.
13. Künt kenarına bir jilet kullanarak, yavaşça diski camı ücretsiz için her yönde itin. Kolayca slayt, yavaş yavaş disk mavi doku kağıt üzerine mikroskop slayttan itin. Diski, düz tarafı, doğrudan kağıt üzerine yerleştirin.
14. Belgili tanımlık yuvarlak yüzey düz tutmak, hareket önlemek, katlanmış kağıt kasedi diski yerleştirin ve kaseti kapatmak için diskin çevresinde kağıt katlama. Belgili tanımlık yuvarlak yüzey temiz bir şekilde cam slayt değil, daha fazla jel eklemek ve/veya bir kaç dakika daha buz slayt dönmek.
15. PBS bir ölçek kasete daldırın. Aynı gün için en uygun morfoloji katıştırma parafin işlemde.

4. parafin katıştırma

Not: İşlem adacık jel parafin blok aşağıda açıklandığı gibi bir kısaltılmış dehidratasyon serisi kullanarak diskleri. Bu teknik bir otomatik işlemci kullanarak optimize edildi, ancak el ile işleme benzer sonuçlar üretmesi gerekir.

1. Kaset % 85 etanol içinde 15 dakika bırakın.
2. Kaset % 95 etanol içinde 15 dakika bırakın.
3. Kaset % 100 etanol içinde 15 dakika bırakın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
4. Kaset ksilen içinde 15 dakika bırakın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
5. Kaset içinde erimiş parafin 10 dakika bırakın.
6. Kaset için taze erimiş parafin 10-30 dakika aktarın.
7. Dikkatle kaset açın ve mavi kağıt paketini açmak. Edildi karşı düz kağıdın yüzeye takip edilmesi jel diski çıkarın. Disk aşağı, paralel olarak kesme yüzeyi düz (adacık içeren) yüzeyi ile küçük bir kalıp içine embed. Fişi için dikkatle kaset kaldırmak ve doğru kesme yüzeyi işaret ucu küçük bir kalıp içine embed.

5. parafin kesit ve boyama

1. Seri bölümler gerekiyorsa slaytlar ardışık olarak etiketleyin.
2. Deneyimli bir histotechnologist tarafından kesilmiş 5 µm parafin bölümü vardır. Verimi en üst düzeye çıkarmak için malzeme içeren tüm bölümler kaydedin. Genel olarak, 20 bölüm toplama malzeme çoğunun yakalama sağlar.
3. Bölümler, oda sıcaklığında saklayın. Bölümler rutin histolojik lekeleri (örn., H & E) ve (Örneğin, insülin, glukagon ve DAPI) ayirt mükellef bulunmaktadır. Fiksasyon diğer antijenleri için optimize.

Jel disk hazırlamak için adımlar resimli bir şematik resim 1' de gösterilen. Bu jel disk yöntemi sonuçları sonuçlar anlamlı miktar izin vermek için tek bir düzlemde dağıtılmış adacıkları yeterli sayıda içeren parafin bölümlerde yer. Şekil 2 bölüm başına yakalanan adacıkları sayısını göstermek için elde edilen bölümlerin düşük-büyütme görüntüleri gösterir. Genel olarak, > 35 adacıkları görünür her bölümünde 250 IEQ kullanılmıştır zaman yordamı için ve > adacıkları içeren 10 bölümler (4-5 µm) her örnekten elde. Yordam için kullanılan adacıkları artırıldığında adacıkları bölümlerde yer sayısı arttı. Ve bu yeni kavramı destekleyen farklı boyutlarda yapısal olarak farklı bölümlerde adacıkları ve veri ilginç teknikleri arası adacık farklılıklar kör yerine bölümler kullanılarak elde edilebilir. Belgili tanımlık yöntem amele aynı derecede de kemirgen adacıkları laboratuvarında (sıçan, fare) ve sevk irsaliyesi sonra tarafından IIDP alınan insan adacıkları için izole için. Sonra sonrası yalıtım kurtarma adacık orta, pürüzsüz bir yuvarlak yüzey ile bir gecede ve küresel şekli (Şekil 2A) kompakt kemirgen adacıkları belirgin bir şekilde daha fazla olduğu gibi kara delik vardı. İnsan adacık morfoloji varış gününde katıştırılmış veya adacıkları yalıtım stres sevkiyat öncesinde zaten kurtarıldı çünkü sonrası sevk irsaliyesi kurtarma sonra bir gecede, belki gömülü benzer. Microtube yöntemi bölüm, başına daha az adacıkları ile daha küçük doku bir kesit alanı vermiştir ve yoğun adacıkları ve boncuk (Şekil 2B) dolu. Şekil 2'B deki microtube görüntüleri en iyi biz bu yöntemle elde edebildik vardı; hiçbir adacıkları bölümleri ilk kümesi içinde bulunduğundan daha fazla bölümleri geri kesmek için gönderilmek üzere örnekleri vardı.

Bu teknik için yüksek kaliteli adacık bölümleri oluşturur histolojik ve ayirt boyama (Şekil 3). İnsülin ve glukagon boyama çeşitli kompozisyon ve heterojenlik adacık mimarisinin gösterdi. Bölümleri açıkça bilinen mimari farklılıklar recapitulated fare ve sıçan adacıkları beta hücre çekirdeği ile benzer mimari gösterdi, ancak beta hücreleri ile fare ve sıçan adacıkları, bol α-hücreleri oluşan insan adacıkları ile insan arasında iç içe ve çevre Alfa hücreleri. Seri bölümler elde edilebilecek; Şekil 3 panellerinde aynı H için lekeli adacık & E (solda) ve ayirt (sağda) seri bölümlerini göster.

Resim 1 . Kritik adımlar adacık jel disk yapmak için Illustration. Jel ısındı 70 ° c (A) (B)adacık/boncuk Pelet içeren düşük bağlama microfuge tüp transfer bir ısı blok içinde. Adacıkları sıcak jel resuspended ve malzeme (C-D)bir disk şeklinde yayılan bir cam slayt aktarılır. Ek temiz jel microfuge tüp aktarılır, sonra tüm kalan malzeme kaldırılır ve çepeçevre ilk adacık/boncuk-içeren disk üzerinde cam slayt (E-F)etrafında yayılmış. Buz üstünde uyuyor sonra disk transfer edilen, düz aşağı, Histoloji kağıt (G), ve işleme için bir kaset (H) yerleştirilen katlanıp takımıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Çok sayıda iyi dağıtılmış adacıkları parafin bölümleri jel disk içerir. (A) düşük büyütme panelleri (40 X, 3 x 3 görüntüleri birlikte, % 15 örtüşme ile dikişli) fare, sıçan ve insan adacık kısımlara H & E ile lekeli birçok adacıkları her bölümünde görünür olduğunu göstermektedir. Yüksek büyütme insets (200 X) temsilcisi adacıkları göster. Sol kapı aynası yalıtım (fare, sıçan) veya sevk irsaliyesi (insan); hemen sonra gömülü adacıkları bölümlerini göster doğru kapı aynası gecede kurtarma sonra kültür içinde gömülü adacıkları göster. 40 X imge içinde görülen soluk mavi daireler için gömme ve kesit sırasında görselleştirme dahil boncuk vardır. Belirli bu örneklerde C57BL/6N fare (1 yaşında) ve BBDR sıçan (4 hafta) duktal collagenase enjeksiyon ve Ficoll ayırma tarafından izole adacıkları ve IIDP alınan insan T2D adacıkları vardır. (B) 250 IEQ insan adacıkları karşılaştırma için eski microfuge tüp tekniği başına gömülü. Düşük büyütme panelleri (40 X; tek bir unstitched görüntü yakalanan tüm malzeme) ve yüksek mag insets (200 X) temsilcisi bölümleri göster. Kültür orta RPMI FBS, penisilin/streptomisin ve 5.5 mmol/L glikoz vardı. Ölçek çubukları düşük büyütme panelleri için 1000 µm vardır; ölçek çubukları yüksek büyütme panelleri için çoğu 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Temsilcisi histochemical ve seri adacık bölümler üzerinde boyama ayirt. Bölümleri fare, sıçan ve insan adacıkları gömülü sonra gecede kültür H & E için lekeli ve tarafından aydınlık alan mikroskobu görüntüsü (200 X; sol). Bitişik bir bölümü (kırmızı) insülin, glukagon için DAPI içeren ortam (mavi) takılı ve floresan mikroskopi kullanarak yansıma (yeşil), lekeli (200 X; sağ). Ölçek çubukları: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.