Yöntem makalesi

Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark

DOI:

10.3791/57934

⸱

4 Temmuz 2018

 , 
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burun potansiyel farkı test neredeyse üç yıldır kistik fibrozis (CF) tanısında yardımcı olmak için kullanılmıştır. Durumlarında yardımcı olmak, zayıflatılmış oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi. CF. uyarlayarak test etmek için bir fare için hedeflenmiş tedavi stratejileri yanıtlarını ölçmek için bir biyomarker meydan okuyor ve ilişkili bir ölüm gerektirecektir preklinik ve klinik ayarları, testi kullanılmıştır. Bu kağıt için sürekli perfüzyon burun kateter in situ korumak için gerekli anestezi yeterli derinliği açıklar. Solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için ölçülerin listeler. Ayrıca hayvan bakımı panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere test sonunda açıklar. Temsilcisi veri bir CF ve test CF ve sigara-CF arasında ayrımcılık bir vahşi tipi fare Haritayı aldı. Özet olarak, burada açıklanan protokol test ile ilgili güvenilir ölçümler spontan solunum farelerde trans-epitel klorür ve sodyum taşıyıcılar gibi azaltırken aynı hayvan birden çok test fonksiyonel durumu sağlar ölüm.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neredeyse üç yıl için elektrik potansiyel farkı (PD) ölçümleri transmembran iyon taşıyıcılar, nazal mukoza, distal airways1temsilcisi olarak ifade edilen fonksiyonel durumunu değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bir multistep dinamik test olarak2,3, nazal PD Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) ve epitel sodyum kanal (ENaC) etkinlik, fonksiyonel diseksiyon sağlar her ikisi de apikal zarı lokalize epitel hücreleri ve hava yolu yüzey hidrasyon önemli rollerde uygulamakla. Büyük klinik uygulama burun PD testinin CF, 1 dışarı-in 2500 canlı Doğum Avrupa ülkelerinde ortalama bir insidans ile beyaz nüfus en yaygın ölümcül genetik bozukluk tanısında yardımcı olmaktır. Test uzun zayıflatılmış, oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların tanısında yararlı kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi4. Daha yakın zamanlarda,5,6,7,8,9,10,11 defect temel CFTR tedavi modülasyon clinometric değerlendirilmesi ,12,13,14,15,16 burun PD klinik çalışmalarda yeni CF tedavilerin kullanımı yaptı. Preklinik ayarında test yeni CF hedef terapiler18,19,20,21bioactivity incelenmesi izin vermek için fare17 ' ye uyarlanmıştır. Farelerde, kemirgenler ve insan arasındaki burun bölgenin boyutunu türler ile ilgili anatomik farklılıkları ve ağırlıklı olarak Rodents nasofacial bölgesinden duyusal girdilerin önemli rol dayalı hassas, bir tekniktir. Eğitimli ve vasıflı operatörler, özel ekipman ve malzemeleri gerektirir.

CF ekzokrin bezleri, çok sistemik bir hastalığı olduğunu hangi kronik solunum yolu hastalığı klinik resim hakim. Hastalığı siklik adenozin monofosfattır (kampı) kodlama gen mutasyonlar neden olur-CFTR klorür kanal22düzenlenir. Bugüne kadar 2.000'den fazla CFTR mutasyonları tespit23olmuştur. CF gen, neredeyse % 90 bulundu en yaygın mutasyon24,25, Fenilalanin polipeptid zinciri protein (F508del-CFTR) 508 pozisyonda silinmesiyle karşılık gelir. CFTR proteini bir tamamen içinden küçük gürültülerinden klorür kanalıdır. CFTR diğer taşıma mekanizmaları, özellikle de ENaC26,27düzenleyen önemli kanıtlar vardır. Arızalı elektrolit taşıma azaltılmış CFTR bağımlı klorür gürültülerinden ve artan ENaC bağımlı sodyum gürültülerinden, dahil olmak üzere, CF epiteli özelliğidir. Eski kusur küçültülmüş veya kaldırılmış repolarization bir elektrokimyasal gradyan favour klorür sızma ve isoprenaline (hücre içi kampı artıran bir β-adrenergic agonist) veya forskolin (bir adenilat eklenmesi karşısında yansıtır klinik kullanım için onaylanmamış cyclase agonist,). İkincisi kusur bazal hyperpolarization nazal mukoza (daha olumsuz PD) ve amiloride, ENaC28blok bir idrar söktürücü ilaç için artan bir tepki yansıtır.

CF fare modelleri sık CF araştırmalarında kullanılan ve CF patoloji dissekan çok değerli olmuştur. Günümüzde, en az on beş modelleri açıklanan üç olan en klinik F508del mutasyon30,31,32için homozigoz29, olmuştur. Bir Rotterdam, Erasmus Üniversitesi'nde geliştirilen bu üç suş30, yaklaşık 20 yıldır Université catholique de Louvain (UCL) laboratuvar olarak kullanılmıştır. Cftrtm1Eur modeli30 CF hastalığı multiorgan Patofizyoloji çalışmaya ve yeni tedavi stratejileri18,19,20etkinliğini test etmek için çok yararlı olduğunu kanıtlamıştır, 21. Çok sayıda sorunları sırasında veya erken sonra ortaya çıkabilir (< 24 h) farelerde burun PD testi. Bu yazıda, anestezi solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için sürekli perfüzyon ve önlemleri burun kateter situ içinde tutmak için gereken yeterli derinliği açıklanmıştır. Test sonunda hayvan bakımı da, panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere tanımlanır. Özet olarak, bu yordamları güvenilir ölçümler spontan solunum fareler, azaltılmış testi ile ilgili mortalite ve aynı hayvan içinde belgili tanımlık sınav yinelenen sağlar. Temsilcisi veri burun PD testinden bir CF ve vahşi-tipi fare elde gösterilen ve tartışıldı.

Fare burun PD test protokolü üç oturumlarda bildirilmektedir: değerlendirmesi ve yönetimi öncesinde, sırasında ve sonra testi. Ön-test değerlendirmesi ve yönetimi hazırlık çift lümen burun kateter ve çözümleri sürekli burun perfüzyon için kullanılan protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Değerlendirme ve test yönetimi bölümleri sırasında deneysel kurulum ve fare kullanımı özenle kesmiştim. Son olarak, hayvan test sonunda yönetiminin tam hayvan kurtarma geliştirmek için tanımlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmalar ve yordamlar hayvan araştırma (2017/UCL/MD/015) UCL'nin ve hayvan araştırma (CEE n ° 86/609) kullanımda Avrupa Birliği Yönetmeliği ile anlaşma için Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Araştırmacılar bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63/AB sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konsey, 22 Eylül 2010 aşağıdaki hayvan deneme için nitelikli.

1. değerlendirmesi ve yönetimi ön test

  1. Çift lümen burun kateter hazırla.
    Not: Bir çift lümen kılcal tüp, bir lümen için çözümler, perfüzyon sürekli kullanılan bir burun kateter yapılır ve diğer bir ölçüm olarak kanal.
    1. Bir parça, yaklaşık 20 cm uzunluğunda, Polietilen boru (2.0 mm iç çap; 3.0 mm dış çap; orta bölümünü oluşturmak ısı Resim 1 bir) gaz (10-15 s) çekmek için yumuşak olana yakıcı Alevi olarak.
    2. İki ucu bir çok ince kılcal tüp uygun uzunluk (~ 15 cm) ve dış çap (~0.1 mm) (resim 1b) burun sonda için edinmek için ayır.
    3. Temiz ve saf etanol ile iki tür kılcal ısıtınız, onlara kaseti ile (Şekil 1c) katılmak ve birlikte cyanoacrylate tutkal kullanarak yapıştırın.
    4. Probları bir jilet veya çift lümen kateteri yaklaşık 8 cm (Şekil 1d) en uygun bir uzunluğu elde etmek için bir neşter ile aşırı uzunluğu kes gitsin.
    5. Suyu geçirgen olduklarını doğrulamak için her iki lümen yoluyla enjekte.
    6. Bir işareti bir 5 mm mesafe ucundan uygulanır.
      Not: tüm ölçümler aynı site içinde burun boşluğuna yapılır böylece burun içine mark kadar sonda eklenir.
    7. Çift lümen kateteri kuru bir kutuda saklayın.
      Not: Bu kullanılan 6 - 10 kat uygun şekilde test hemen sonra temizlenmiş olabilir.
  2. Krem karışımı hazırlayın.
    1. Karışımı yavaşça elektrolit krem ve minik hava kabarcıkları oluşumu kaçınarak doymuş 3 M KCl çözüm 1:1 oranında (birim/birim).
      Not: Krem karışımı Ag/AgCl elektrotlar, ölçme ve referans elektrot köprüler kurmak için Şekil 1' de gösterildiği gibi kullanılır.

figure-protocol-1
Resim 1 : Probes elektrotlar ve köprüleri ile. Şekilde Polietilen boru önce (a) ve Isıtma ve (b), (c), Çift lümen kateteri (d), silikon tüp bağlayıcılar (e) ve elektrotlar (f) iki kılcal damar parçalar katılmadan teyp çekerek sonra gösterilmektedir. Resim netliği için bağlayıcılar krem karışımı ile dolu değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Çözüm etiketiÇözüm açıklaması
ABazal tamponlu tuz solüsyonu
BKlorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu
C10-2 M amiloride hisse senedi çözüm
D10-3 M forskolin hisse senedi çözüm

Tablo 1: çözüm farelerde burun PD test için hazır.

TuzmMMolekül ağırlığıg/M
Sodyum klorür (NaCl)13558.447,889
Kalsiyum klorür dihydrate (CaCl2.2H2O)2.251470.331
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O)1.2203.30,244
Dipotassium fosfat (K2HPO4)2.4174.20.418
Monopotassium fosfat (KH2PO4)0,4136.10.054

Tablo 2: Kompozisyon bazal tuz solüsyonu (stok çözelti A) arabelleğe alınmış.

  1. Çözümleri hazırlayın.
    1. Deneysel iletişim kuralı (Tablo 1) için gerekli dört hisse senedi çözümleri hazırlayın.
      1. Bazal tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm A; hazırlamak Tablo 2) ve klorür-Alerjik tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm B; Tablo 3) Oda sıcaklığında saf suda tuzu karıştırarak. 1 N NaOH pH, düşük pH 1 N HCl yükseltmek için kullanarak pH 7,4 (aralığı 7.0-7,6) için ayarlayın. (275 mOsm/L) çözümünün Osmolarite kontrol edin.
      2. Etiketli cam şişe 4 ° C'de 3 aya kadar veya donmuş olarak plastik şişeler için 6 aya kadar saklayın.
      3. 10-2 M amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) amiloride hidroklorid 26,6 mg 10 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 70 ° C'de 5-10 dakika için karışım ısı Amiloride ışığa duyarlı olduğu için çözüm C karanlık bir kap içinde tutun. Etiket kapsayıcının ve 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
      4. 10-3 M forskolin çözüm (hisse senedi çözüm D) forskolin 10 mg 24.36 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 0.1 mL aliquots forskolin hisse senedi çözüm etiket ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın.
  2. Taze çözümleri A1, B1 ve B2 hazırlamak (Tablo 4).
    1. Taze çözüm A1 hazırlamak (bazal tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride) 10 mL bazal tuz çözeltisi (stok çözelti A) alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık içinde 24 h kullanın.
    2. Taze çözüm B1 hazırlamak (klorür arabelleğe alınmış çözüm artı 10-4 M amiloride) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık 24 saat içinde kullanın.
    3. Taze çözüm B2 hazırlamak (klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride ve 10-5 M forskolin) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL elde etmek ve 10-2 M 0.1 mL ekleyerek amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) ve 0.1 mL 10-3 M forskolin çözeltisi (hisse senedi çözüm D). Etiket kapsayıcının ve hazırlık 2 saat içinde kullanın.
TuzmMMolekül ağırlığıg/M
Sodyum Glukonat (Monosodyum tuz)135218.129,444
Kalsiyum glukonat (susuz toz)2.2430.40.947
Magnezyum sülfat heptahydrate (MgCl2.6H2O)1.2246.50.296
Dipotassium fosfat (K2HPO4)2.4174.20.418
Monopotassium fosfat (KH2PO4)0,4136.10.054

Tablo 3: Çözüm (hisse senedi çözüm B) klorür-Alerjik kompozisyon arabelleğe alınmış.

figure-protocol-2
Resim 2 : Nazal mukoza perfüzyon sırasında farenin konumunu. Şekilde gösterilmektedir (a) ısıtma yastığını, voltmetre (b), bir arka bacak (c), proksimal (d) ve distal (e) çıkışları peristaltik pompa, yastık (f), subkutan uzayda takılı referans elektrot ve yatak levha (g). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. değerlendirme ve Test sırasında yönetim

  1. Deneysel kurulum hazırlamak.
    1. Hipotermi sırasında ve sonra testi engellemek için ölçüm Kur (18,8 x 37,5 cm; için fizyolojik sıcaklıklarda muhafaza iki Isıtma pedleri kullanın Resim 2 bir) ve diğeri (15,5 x 15,5 cm) kutusunda hangi hayvan kurtarma test sonunda için alınacaktır.
    2. Veri yakalama için veri bellek yüksek giriş empedansı bağlı yazılımı yüklü bilgisayarda geçiş (> 1012Ω) ve yüksek çözünürlüklü (0,1 mV) Voltmetre (Şekil 2b).
    3. Elektrotlar için voltmetre bağlanır. Olumlu ölçüm elektrot burun kateter ve arka bacak, subkutan uzayda takılı kateter için olumsuz referans elektrot Şekil 2cgösterildiği gibi bağlayın.
    4. Krem karışımı içinde birlikte elektrot uçları daldırma. İlk elektrot uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, elektrotlar reddetmek (ideal olarak 0 mV).
    5. Peristaltik pompa geçiş ve pompa tüp pozisyona, Şekil 2' de gösterildiği gibi yerleştirin.
    6. Burun perfüzyon (Şekil 2d) için seçili solüsyon içeren flakon pompa tüp proksimal çıkış bağlayın. Pompa tüp distal çıkış burun kateter (Şekil 2e) perfüzyon lümen bağlayın.
    7. Burun kateterin bir lümen 10 µL pipet ucu ile elektrolit krem karışımı ile doldurun. Silikon tüp konektörüne (Şekil 1e) kateter uyum, bağlayıcı krem karışımı ile doldurun ve pozitif elektrot konektörünü (Şekil 1f) takın. Ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, köprüleri reddetmek (ideal olarak 0 mV).
    8. Burun kateter ikinci lümen taze çözüm A1 ile doldurun. A. 10'a karşılık gelen burun Kateter uzunluğu doldurmak için ters yönde peristaltik pompa solüsyon içeren flakon burun kateter ucu daldırma perfüzyon s.
      Not: Bu 10 için bazal PD değerleri kayıt imkanı sunan amiloride uygulamadan önce s. Krem karışımı içine referans elektrot (Şekil 1) bağlayıcı burun kateter ucu daldırma.
  2. Fare işleme başlayın.
    1. Anestezi mayi (IP) rota17tarafından enjekte edilir tam doz hesaplamak için fare ağırlık kaydedin.
    2. 26 G (0.45 x 10 mm) iğne kullanarak enjekte premedication intraperitoneally anestezi indüksiyon tanıtmak için: sabit doz 5 mg/mL midazolam 50 µL. İçin 5 dakika bekleyin.
    3. Anestezik karışım hazırlamak (fentanil, medetomidine, droperidol son konsantrasyonlarda 0,05, 0,40 ve 20 mg/kg vücut ağırlığı sırasıyla ve klonidin 0.375 µg sabit doz itibariyle) en iyi ve istikrarlı derinlik17 anestezi (Aşama III, uçak 2) izin . Anestezik mix hacmi intraperitoneally enjekte ve klonidin hacmi enjekte et.
      Not: 15 dk sonra fare uyuyor olmalı ve anestezi en az 30 dakika sürebilir.
    4. 3 cm 'ısıtma yastığını (Şekil 2bir) üst kısmındaki fare kafa için bir destek olarak kapsayacak geniş yastık' (Şekil 2f) yapmak için doku emici bir sayfa katlayın.
    5. Isıtma yastığını doku ('çarşaf'; emici bir levha ile kapak Resim 2 g). ısıtma yastığını sırtını fare yatıyordu. Teyp bacaklarda ve kuyruk (Şekil 2).
    6. Başvuru intravenöz kateter (Şekil 1g) hind riske subkutan alana yerleştirin. İğneyi çıkarın ve silikon tüp konektörü (Şekil 1e, 2 c) uyum.
    7. Kateter doldurun ve krem konektörle mix ve negatif elektrot (Şekil 1f) konektöre takın.
    8. Kateter ve elektrot herhangi bir öteleme önlemek için gerektiği şekilde bant ile düzeltmek. Köprüler ve referans elektrot yerleştirme sonra elektrot krem karışımı IV kateter bağlayıcı içinde burun kateter ucu daldırma tarafından ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri tekrar doğrulayın. Kayıt istikrarlı son uzaklık değeri (ideal daha az (±) 2 mV).
    9. "Nazik" bant Isıtma panelindeki emici doku ('yastık' (Şekil 2f) ve 'çarşaf'; iki parça arasında boş bir alan ile kulakları fare düzeltmek (Şekil 2g)). Vibrissae (sert kıllar burun delikleri büyüyen) gözleri dokunmadan düzeltmek.
    10. Ağız boşluğu sıvı emmek için dili yanları gösteren (Şekil 3bir) taşıyın ve filtre kağıdı ('boru'; sivri uçlu bir fitil ekleyin Şekil 3 b) yaklaşık 1 cm ağız içine. Perfused burun sıvı çalışan emmek için filtre kağıdı ('mendil'; ikinci bir parça yerleştirin Şekil 3 c) burun ucunda düzenledi.
    11. Ağız içi temas burun kateter ucu yerleştirerek epitel potansiyeli olumlu denetim değerini denetleyin.
      Not: Okuma istikrarlı ve Aralık -10 arasında olmalıdır mV ve -20 mV.
    12. İyi forseps ile ve iyi doğrudan aydınlatma altında tutarak, ince burun kateter içine bir burun deliği en fazla 4 - 6 mm burun ucu tanıtmak.
      Not: Burun PD kateter orta burun concha maksimal istikrarlı temel PD değeri17,20verir konumda yer alır.
    13. 5 dakika sonra enjeksiyon anestezik ilaçların hafifçe tarafından yaklaşık 30° hayvan baş aşağı doğru ile ısıtma yastığını eğ. Maksimal bazal PD değeri izlemek.
    14. Olduğunda istikrarlı bir yaklaşık 30 boyunca s, 10 µL sabit bir hızda nazal mukoza ventriküler Başlat / min, art arda 4 tamponlu çözümleri (A, A1, B1, B2) ile. Belgili tanımlık ilk eriyik (adım 1.3.1.1) 10 için sıvı s ve her aşağıdaki çözüm (adım 1.4) 5 min için veya sabit bir değere ulaşıncaya kadar. Geçici forskolin yanıt düşmeye başladığında forskolin (B2) ventriküler durdurmak.
    15. Veri kayıt için 1 s aralığı seçin. Perfüzyon başlangıç sırasında veri kaydetmeye başlamak. Zaman bilgisayar ekranından bir fonksiyonu olarak verileri görüntüler.
    16. Çözüm B2 ile perfüzyon sonundaki dur veri yakalama. Verilerini bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    17. Son uzaklık değeri çıkarılarak tarafından doğru veri.

figure-protocol-3
Şekil 3 : Burun kateter ve filtre kağıtları ile ısıtma yastığını üzerinde farenin konumunu yerde. Şekilde yana doğru (a), kanal (b) ve mendil (c) koymak dil gösterilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. test değerlendirmesi ve yönetimi sonrası

  1. Isıtma yastığını üzerinden fare düğmesini serbest bırakın.
  2. 'Çarşaf' ile fare burun silin (Şekil 2g).
  3. İntraperitoneally bir sabit doz nalokson, rekabetçi morfin antagonisti ve atipamezole, bir medetomidine belirli panzehir (2 mg/kg vücut ağırlığı) (4 µg) oluşan anestezik antagonisti karışımı enjekte et.
  4. Fare kurtarma kutusunda küçük ısıtma yastığını genellikle 1-2 h sonra gözlenen tam kurtarma kadar yatıyordu.
    Not: UCL laboratuvarda yaklaşık % 10 mortalite, esas olarak bronchoaspiration nazal kavite test sırasında periosteum çözümleri ile ilgili cinsiyet veya genotip bağımsız olarak görülmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CF karakteristik iyon taşıma anormallikleri göstermek için burun PD ölçümleri bir F508del-CF fare ve Brüksel kolonisi FVB/129 genetik kökenli bir vahşi tipi kontrol yukarıda açıklanan protokol sonrası gerçekleştirilen CFTRtm1Eur fareler30. En yaygın ve en ağır F508del-CFTR mutasyon23,24,25, birini barındıran bu klinik modeli en iyisi şu anda mevcut CF fare model...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt amacı çözümleri farelerde kendiliğinden nefes iyon taşıyıcılar, esas olarak CFTR ve ENaC bütünlüğünü test etmek için gereken süreyi için sürekli perfüzyon altında burun PD ölçmek için yeterli bir iletişim kuralı tarif etmektir. İletişim kuralının tüm adımları dikkatlice tam hayvan kurtarma ve kaliteli ve tekrarlanabilir veri sağlamak için optimize edilmiştir. Özellikle, kritik adımlarda anestezi değerlendirmesi ve yönetimi ve yeterli hayvan pozisyon ve bakım sırasında ve sonra testi.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Prof. J. Lebacq eleştirel yazının düzenleme için teşekkür ederiz. CFTRtm1Eur (homozigoz F508del-CFTR (FVB/129) fareler tarafından geliştirilen Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda, Avrupa Ekonomik Topluluğu Avrupa koordinasyon eylem kistik fibrozis Avrupa Birliği FP6 araştırma desteği ile LHHM-CT-2005-018932.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Portex polietilen tüp Smiths Medikal, Hythe, Kent, İngiltere CT21 6JLPortex 800/100/500; Burunprobu için kılcal tüpler hazırlamak için
Elektrot kremiParker, Fairfield, NJ, ABDElektrot köprüleri oluşturmak içinRedux krem
Ag/AgCl elektrotlarıBiyomedikal, Clinton Township, MI, ABDJNS BNT131-1,0ölçüm ve referans elektrotları
amilorid hidroklorürSigma, St Louis, MI, ABDPerfüzyon çözeltileri
forskolinSigma, St Louis, MI, ABDF6886perfüzyon çözeltileri hazırlamak için
Knick Portamess voltmetreElektronisch Me & beta; GER&AUML; te, Berlin, AlmanyaPortavo 904 pHpotansiyel farkı ölçmek için
Paraly SW 112 Yazılımı Elektronisch Ben ve beta; GER&AUML; te, Berlin, AlmanyaParaly SW112 yazılımıpotansiyel fark verilerini yakalamak için
midazolam Mylan, Hoeilaart, BelçikaDormicum 15mg/3mlanestezik premedikasyon olarak hizmet etmek için
fentanilJanssen Cilag, Berchem, BelçikaFentanil-Janssen 0.05 mg / mlanestezik ilaç
medetomidinOrion Pharma, Espoo, FinlandiyaDomitor 1 mg / mlanestezik ilaç
droperidol olarak hizmet etmek için Janssen  Cilag, Berchem, BelçikaDehidrobenzperidol 2.5 mg / mlanestezik ilaç klonidin olarak hizmet etmek için
 Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim Rhein, AlmanyaKatapressan 0.15 mg / ml,anestezik ilaç olarak hizmet etmek için
IV kateteri yansıtıyorBecton Dickinson, Sandy, UT, ABD24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-Welektrot köprüleri
forseps Güzel Bilim Araçları, Heidelberg, AlmanyaDumont #5, Nazalkateteri yerleştirmek için
nalokson Braun Medikal, Brüksel, Belçikaanestezik antagonist atipamezol olarak görev yapmak için0.4 mg / ml
;Zoetis, Bloomberg, BelçikaAntisedan,medetomedine özgü bir panzehir olarak hizmet etmek için 5 mg / ml 
Isıtma yastıkları Harvard Aparatı, Holliston, MA, ABD18,8x37,5 cm; Testsırasında ve sonrasında hipotermiyi önlemek için
Peristaltik pompa P1GE Yaşam Bilimleri, Uppsala, İsveçfareburnundaki solüsyonları perfüze etmek için
siyanoakrilat yapıştırıcıLoctite, Henkel, Dü sseldorf, Almanya Burunprobu
NaClSigma, St Louis, MI, ABDRES0926S-A7İlaç Sınıfı, USP
CaCl2.2H2OSigma, St Louis, MI, ABDM7304İlaç Sınıfı, USP
MgCl2.6H2OSigma, St Louis, MI, ABD1551128İlaç Sınıfı, USP
K2HPO4Sigma, St Louis, MI, ABD1551139İlaç Sınıfı, USP
Na glukonatSigma, St Louis, MI, ABDS2054İlaç Sınıfı, USP
Ca glukonatSigma, St Louis, MI, ABDC8231İlaç Sınıfı, USP
MgSO4.7H2OSigma, St Louis, MI, ABDRES0089M-A7İlaç Sınıfı, USP
BD iğnesi Becton Dickinson, Franklin Lakes, ABDBD 26G (0.45x10 mm)intraperitoneal enjeksiyon
2.0mm ID, 3.0 mmODhazırlamak için A7410 olarak hizmet etmek için güzel bilim araçları Narcan, 15,5x15,5 cm18111091

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5(2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kistik Fibrozis Fare Modeliift L menli Nazal KateterPeristaltik Pompa Perf zyonuAmilorid Yan t l mKlor rs z Yan tForskolin Yan t AnaliziAnestezi Uygulama ProtokolHayvan yile tirme Prosed r

İlgili makaleler