Yöntem makalesi

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

DOI:

10.3791/57971

⸱

27 Temmuz 2018

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplu autophagy sitoplazma büyük bölümlerini haciz autophagosomes olarak adlandırdığı çift/multi-membrane yapılar ile karakterizedir. Bu işlem izlemek için basit bir protokol burada açıklanmıştır. Ayrıca, tipik sonuçları ve deneysel doğrulama yönteminin çeşitli kültürlü memeli hücreleri autophagy indükleyici koşullarda temin edilmektedir. Toplu autophagy sırasında sitozol ve böylece aynı zamanda diğer autophagic kargo yanında çözünen sitozolik protein autophagosomes çekilmek. Karaciğer bir istikrarlı ve son derece seçici olarak sigara autophagosomes gizlediği bol, çözünür sitozolik enzim var. Karaciğer haciz miktarını bu nedenle toplu autophagic haciz miktarını yansıtır. Verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde karaciğer haciz hücreleri belirlemek için çalışan sayımız sitozolik karaciğer, ölçüm enzimatik sedimentable faaliyete ardından etkili sedimentable ayıran bir electrodisruption tabanlı ayırma iletişim kuralı Bütün hücre örnekleri karşı kesirler. Autophagic haciz sedimentable karaciğer içinde bu işlem görmüş hücreleri tedavi edilmezse hücrelerdeki oranı çıkarılarak belirlenir. Karaciğer haciz tahlil bu ya haciz probları veya yarı kantitatif proteaz ektopik ifade dahil diğer yöntemleri karşı endojen kargo autophagic haciz nicel bir ölçü verir avantajdır koruma analizleri autophagy işaretleri veya reseptörleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autophagy (Yunanca "kendi kendine yemek" için) hücre içi malzeme katmaninin/lizozomal bozulması için evrimsel korunmuş bir süreçtir. Autophagy Maya ve insanlar için önemli olan autophagy ile ilgili ("ATG") genlerin keşfi üzerine ve gerçekleşme bu autophagy insan sağlığı ve hastalıkları (2016 yılında Nobel Tıp veya Fizyoloji için tarafından kabul önemli bir rol oynar Yoshinori Ohsumi), autophagy hızla hücre biyoloji1,2en yoğun okudu işlemlerden biri haline gelmiştir.

(Bundan sonra "autophagy" anılacaktır) Macroautophagy genişleme karakterize ve katlama hücre içi membran cisternae ("phagophores"), etkili bir şekilde çekilmek en kapalı, çift veya çoklu membrane yapılar ("autophagosomes") sitoplazma geri enwrapped malzemesi. Organellerin ile autophagosomes füzyonu, iç autophagosomal membran ve münzevi kargo bozulmuş ve geri dönüşümlü. Autophagosomes rasgele (non-selektif autophagy) ve seçici (seçici autophagy) görgü sitoplazmik malzeme çekilmek olabilir. Toplu autophagy büyük olasılıkla a karıştırmak-in non-selektif ve seçici autophagy temsil eder.

1960 ve 70 's ("morfolojik dönemi" autophagy araştırma) autophagic haciz ultrastructural analizler esas olarak değerlendirildi. 1980 yılında ve başında 1990 ("biyokimyasal dönemi") başına Seglen ve iş arkadaşları — kim okudu birincil fare tetkikine autophagy — kantitatif autophagic haciz aktivitesi3ölçmek için ilk yöntemleri geliştirilmiştir. Bu deneyleri kullanarak, Seglen tanımlanan ve lizozomal autophagic yolu4,5farklı adımları ile karakterize, keşfetti ve amphisome6 (endosome-autophagosome füzyon ürün) icat ve ilk için protein fosforilasyon autophagy yönetmelik7rolünü açıklar. Ancak, ATGs ("moleküler dönemi") 1990'ın keşfi ve bir memeli ATG8 protein ilk karakterizasyonu sonra Mikrotubul ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3) 20008, ATG proteinler için işaretleyici olarak kullanımı autophagic süreci hızla popülerlik kazandı ve büyük ve daha zahmetli biyokimyasal Yöntemler geride. Aslında, son 18 yıldır, Batı leke ve floresan mikroskopi analizleri LC3 farkla en popüler hale gelmiştir (ve birçok sadece durumda) autophagy memeli hücrelerinde okuyan anlamına gelir. Bu yöntemler tarafından gerçekleştirilebilecek göreceli kolaylığı avantajdır. Bunu bir sepeti bileşeni (LC3) yerine gerçek autophagic kargo okuyor dezavantajdır. Devletler ve/veya LC3 akı karşı haciz yolu ile ve akı kargo arasındaki ilişki son derece belirsiz olduğundan oldukça ciddi bir dezavantaj, budur. Aslında, biz toplu kargo akı koşullar altında yüksek düzeyde muhafaza edilmesi göstermiştir hücreleri9konjuge LC3 varlığı rağmen hiçbir LC3 akı olduğu. Ayrıca, bu toplu autophagy verimli LC3 tükenmesi tarafından etkilenmez ve bu nedenle büyük olasılıkla LC3 bağımsız9gösterdi. Bu bulgu da Parkin bağlı mitophagy (mitokondri seçici autophagy) LC310,11 bağımsız olduğunu belirtmek LC3 knock-out çalışmalar10,11tarafından daha sonra doğrulanmıştır .

Özet olarak, açık bir işte deneyleri için kargo tabanlı autophagic etkinliğini izlemek gerekir. En iyi şekilde bu tür deneyleri geniş uygulanabilir, iyi tanımlanmış ve gerçekleştirmek kolay olmalıdır. Son birkaç yıl içinde biz 1980 's12' başına Seglen tarafından geliştirilmiş ve sitozolik karaciğer aktarmak sedimentable, autophagic çarpıtması içeren hücreye ölçme üzerinde dayanır karaciğer haciz tahlil özel bir ilgi almış kesirler. Karaciğer phagophores sitoplazmik kargo enwrap yükleyen kolayca ortak münzevi bir istikrarlı, çözünür sitozolik protein var. Haciz karaciğer, bu nedenle autophagic haciz genel bir ölçüsüdür. Karaciğer lizozomal autophagic yolu12tarafından özel olarak düşer. Böylece, huzurunda lizozomal bozulması inhibitörleri, Örneğin, bafilomycin A1 (Baf)13, deneysel tedavi etkileri doğrudan autophagic haciz etkinliğinde değişiklikleri yansıtmak. Bozulma inhibitörleri yokluğunda, karaciğer tutma ve yıkımı net etkisi ölçülebilir.

Karaciğer haciz tahlil geniş uygulanabilir, çünkü karaciğer son derece ve ubiquitously tüm hücre tiplerinde ifade edilir ve karaciğer düzeyleri doğru bir enzimatik tahlil14,15tarafından sayısal. Ancak, orijinal protokol12 — birincil fare tetkikine kurulan — oldukça zaman alıcı ve malzeme gibi bir ısmarlama elektrik deşarj kapasitör başlayan yüksek bir miktar gerekli. Step-wise bir şekilde yavaş yavaş kolay ve çok yönlü bir yöntem tahlil dönüştürdü. İlk olarak, özgün iletişim kuralını kullanmak üzere memeli hücre hatları16uyarlanmıştır. İkinci olarak, Yöntem önemli ölçüde downscaled3,9yaşındaydım. Üçüncü, zahmetli yoğunluğu hava yastığı da dahil olmak üzere17adım, protokol birkaç adımda elendi. Bu aynı anda bir daha da bir 10 cm tabak örnek16 başına 12-şey plaka (yaklaşık 15-fold daha az başlangıçyani, örnek başına tek bir kuyu kullanmaya kullanarak özgün başlangıç noktasından Yöntem downscaling etkin malzeme)17. Dördüncü olarak, özel yapım elektrik deşarj kapasitör17yerini alabilir bir ticari Elektroporasyon aparatı tespit edilmiştir.

Burada bizim en güncel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında daha önce yayımlanmış17 yönteminin bazı daha fazla basitleştirme içerir karaciğer haciz testin sunulur. Ayrıca, farklı hücre türleri bir dizi elde edilen tipik sonuçlar kümesi gösterilir ve önemlisi, farmakolojik hem de genetik nakavt ve nakavt yaklaşımları kullanarak yöntemi deneysel doğrulamaları birkaç satırlık sağlanmaktadır. İçin genel bir akış düzeni tüm iletişim kuralı bkz: Şekil 1.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre tohum ve tedavi

  1. Kültür 75 cm2 doku kültürü şişe oksijen kuluçka söz konusu hücre türü için tercih edilen kültür ortamı kullanarak 37 ° C'de % 5 CO2 yapışık hücreleri. Hücreleri bir birleşmesi yakınındaki hücre katmanı ulaşana kadar büyümeye izin.
    Not etmek Kullanma ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) LNCaP, HEK293, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), BJ, takıma RPMI 1640 orta MCF-7 ve RPE-1 hücreleri.
    1. 3 mL 37 ° C fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), pH 7.4 hücrelerle yıkayın. PBS yerine 3 mL %0.25 (w/v) tripsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) ve hücreleri (2-5 dk) ayırmak kadar oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.
    2. Müstakil hücreleri ile 7 mL kültür % 10 içeren orta resuspend FBS. 10 µL hücre süspansiyon aliquot ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir microcentrifuge tüp 0,5-20 µL pipet ucu kullanarak. Hemen bir sayım odası slayt doldurmak için aynı pipet ucu kullanın ve bir otomatik hücre Counter hücreleri saymak.
  2. Uygun bir hazırlamak seyreltme (aşağıdaki nota bakın) adım 1.1.2 kullanarak hücre süspansiyon kültür orta içeren FBS ve tohum seyreltilmiş hücre süspansiyon 12-iyi doku kültürü plaka (yüzey alanı ~3.8 cm2) kullanarak her şey aseptik 1 mL tekniği. İstenen hücre yoğunluğu ulaşana kadar Örneğin,








  1. figure-protocol-1

  2. figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletişim kuralını kullanarak açıklanan burada, birkaç farklı memeli hücre satır, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, dahil olmak üzere toplu autophagic haciz etkinliğinde MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ ve LNCaP hücreleri ölçülür. Haciz (tam, besin açısından zengin ortamda) Bazal koşullar altında değerlendirilen veya hücrelerin içinde akut serum ve amino asitler (bir bona fide autophagy indükleyici koşulu

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetle, burada açıklanan protokol memeli hücreleri toplu autophagic haciz etkinliğini izlemek için güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem temsil eder. Orijinal yöntemi12,16için karşılaştırıldığında, biz gereksiz adımları bir dizi kaldırıldı, kalan adımları birkaç Basitleştirilmiş ve önemli downscaling tanıttı. Sonuç olarak, protokol maliyet ve zaman-verimliliği ile ilgili olarak, büyük ölçüde artırıldı ve örnekleri aynı miktarda şimdi özgün protokolü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser mali Araştırma Konseyi Norveç, Oslo Üniversitesi, Anders Jahre Vakfı, Nansen Vakfı ve Henrik Homan anısına mirası tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Noboru Mizushima ATG5 için teşekkür ederim +/ + MEFs ve ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu ATG7 için +/ + MEFs ve ATG7/MEFs ve Dr. Shizuo Akira ATG9A için +/ + MEFs ve ATG9A/MEFs. Biz Frank Sætre teknik yardım ve Dr başına O. Seglen için yapıcı metodolojik tartışmalar için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri Eppendorf211-2130 ve 211-2120
12 kuyulu plakalar Falcon353043
Accumax  hücre ayırma çözümüYenilikçi Hücre TeknolojileriA7089Alikotları -20 °C'de tutun; C yıllarca ve buzdolabında birkaç ay
Bafilomisin A1EnzoBML-CM110-0100DMSO
BJ hücrelerindeATCCCRL-2522geçişte kullanım < 30
Sığır serum albümini (BSA)VWR422361V
Burker sayma odasıFisher Scientific139-658585
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıThermoFisher ScientficC10228
Kontes II Otomatik Hücre SayacıThermoFisher ScientficAMQAX1000
Burker sayma odasıiçin kapak camıFisher Scientific139-658586
Kriter Tris-HCl Jel, 4– %20, 26 kuyulu, 15 ve mikro; U, 13,3 cm x 8,7 cm (G x U) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle'ün dengeli tuz çözeltisi (EBSS)Gibco24010-043conatainler %0.1 glikoz
EDTASigma-AldrichE7889
Elektroporasyon küveti (4 mm)Bio-Rad1652088
Üstel bozunma dalgası elektroporatörüBTX Harvard Aparat  EMC 630
Fetal sığır serumu (FBS)SigmaF7524RPMI 1640 orta HEK293 hücrelerinde% 10 nihai konsantrasyon
ATCCCRL-1573
İmidazolSigma-Aldrich5675065 mM'lik bir çözelti otoklavlayın ve aylarca buzdolabında saklayın
İnkübatör; Autoflow IR Doğrudan Isı CO2 inkübatörüNuAireNU-5510E
Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher13778150
LNCaP hücreleriATCCCRL-1740geçişte kullanım < 30
3-Metil Adenin (3MA)Sigma-AldrichM9281-20 ° C.  Stoku 65 °C'ye ısıtın; 10 dakika boyunca C ve 10 mM son konsantrasyonda kullanın
Buzdolabına Dayanıklı MikrosantrifüjBeckman Coulter Yaşam Bilimleri368831
Yumuşak mod fonksiyonlu Buzdolabına DayanıklıMikrosantrifüj Eppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 hidroklorür (ULKi)Sigma-AldrichSML0702ULK kinaz aktivitesini inhibe eder. DMSO'da çözün.
MaxMat Multianalyzer cihazıErba DiagnosticsPL-II
MCF7 hücreleriATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermoFisher31985062
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco20012-019
Pipet uçları 3 (0,5-20 &mikro; L)VWR732-2223Thermo Fischer ART Bariyer uçları
Pipet uçları (1-200 ve mikro; L)VWR732-2207 & nbsp;Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları
Pipet uçları (100-1.000 & mikro; L)VWR732-2355 ve nbsp;Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları
PipetlerThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kiti
Poli-D-lizinSigma-AldrichP6407-10X5MGSteril H2O'da 1 mg/mL stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm -20 ° C'de stabildir; C en az 1 yıl.
PirüvatMerck-Millipore1066190050
RPE-1 hücreleri (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Fosfoinositid 3-kinaz sınıf III'ü (PIK3C3) inhibe eder. DMSO'da çözün.
Susturucu Seçimi Negatif Kontrol #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Susturucu Seçimi ATG9 hedefleme siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Susturucu Seçimi FIP200 hedefleme siRNA (siFIP200)ThermoFisher/Ambions18995
Susturucu Seçimi ULK1 hedefleme siRNA (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Susturucu Seçimi ULK2 hedefli siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Susturucu Seçimi GABARAP hedeflemeli siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Susturucu Seçimi GABARAPL1 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Susturucu Seçimi GABARAPL2 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Sodyum fosfat monobazik dihidrat (NaH2PO4 ve boğa; 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Sodyum fosfat dibazik dihidrat (Na2< / sub>HPO4 & boğa 2H2< / sub>O ) Prolabo28014.291
SükrozVWR443816TSuda% 10 nihai konsantrasyon; 0.45 ve mikrodan süzün; m filtre edin ve aylarca buzdolabında saklayın
ThapsigarginSigma-AldrichT9033SERCA ER Ca2+ pompasını engeller. DMSO'da çözün.
Triton X-405 ve nbsp;Sigma-AldrichX405%1 final
Tripan Mavi leke %0,4Moleküler ProblarT10282
Tripsin-EDTA (%0,25 w/v Tripsin)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP2287%0,01 final
çözün ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Electrodisruption FractionationSedimentable LDH MeasurementAutophagosome FormationCell Culture ProtocolBafilomycin A1 TreatmentATG Gene KnockoutLDH Enzymatic AssayAutophagy Monitoring Method

İlgili makaleler