Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

8.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57982

⸱

22 Ekim 2018

 , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Özet

RNA polimeraz II transkripsiyon genel kusurları kararlı durum RNA analiz transcriptomic çalışmaları tarafından göz ardı edilebilir. Nitekim, mRNA sentezi genel azalma mRNA bozulması normal kararlı durum düzeyleri geri yüklemek için eşzamanlı bir düşüş telafi edilebilir olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, genom çapında miktar mRNA sentezi mRNA decay, dan bağımsız olarak en iyi doğrudan RNA polimeraz II transkripsiyon etkinlik yansımasıdır. Burada, Sigara perturbing metabolik Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) içinde yeni doğmakta olan RNA'ların etiketlerine göre kullanarak bir yöntem tartışmak. Özellikle, hücreleri urasil analog, 4 thiouracil ile 6 dk kültürlü ve etiketli yeni transkripsiyonu RNA'ların saflaştırılmış ve tüm bireysel mRNA sentezi oranları belirlemek için sayılabilir. Ayrıca, kullanarak etiketli Schizosaccharomyces pombe hücreleri dahili standart farklı S. cerevisiae mRNA sentezi verir gibi suşları. Bu iletişim kuralını kullanan ve dinamik bir kinetik modeli ile veri uydurma, karşılık gelen mRNA decay oranları tespit edilebilir.

Giriş

Hücreleri endojen ve eksojen cues, dinamik değişiklik kendi gen ifade programı aracılığıyla yanıt. Son yıllarda, farklı koşullarda transcriptome değişiklikleri kesin ve kapsamlı açıklaması genom çapında metodolojileri muazzam bir gelişme sağlar. Çoğu transcriptomic çalışmalarda Mikroarray hibridizasyon veya yüksek üretilen iş sıralama toplam kararlı durum RNA kesir düzeylerinden RNA ölçmek için kullanılır. Transkripsiyon değişiklikleri belirli bir pertürbasyon altında belirli bir gen ifade değişikliklerle veya up - veya downregulated genler geniş bir yelpazede olası sonuçları geniş bir görüntüleyebilirsiniz. Gen ifadesinin ince ayarlı bir denge sonucudur — veya kararlı durum — tarafından RNA polimerazlar RNA sentezi ve RNA düzeyleri etkileyen diğer işlemler arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon, onun üç farklı aşamada (başlatma, uzama ve sonlandırma) dahil olmak üzere mRNA işleme, sitoplazmik ihracat, çeviri ve bozulma ile son derece ve girift ilişkilidir.

Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda mRNA sentezi ve çürüme eşleşmiş mekanizmalarının olduğunu gösterdi ve transkripsiyon etkileri mutasyon üzerine veya bir çekim gücü altında toplam kararlı durum RNA miktarının ne zaman göz ardı edilebilir olduğunu gösterdi. Birincisi, her zaman kararlı durum düzeyleri mRNA analizleri transkripsiyon değişimler tespiti mRNA'ların half-life üzerinde bağlıdır. Bir kez pertürbasyon tanıttı, mRNA'ların uzun yarı-ömrü olan kararlı durum düzeyleri daha az bu kısa yarı-ömrü olan mRNA'ların daha etkilenecektir. Bu nedenle, RNA sentezi değişiklikleri tespit şiddetle longer-lived mRNA türler analizini transkripsiyon hızı dinamik değişiklikler ortaya çıkarmak başarısız olabilir iken kısa ömürlü transkript lehine önyargılı olduğunu. İkinci olarak, çeşitli raporlar ve hem de Maya memeliler, transkripsiyon küresel değişimler mRNA kararlı durum düzeyde analiz ederken göz ardı, göstermiştir. Bu mRNA sentezi ve yıkımı mRNA tampon kaynaklanan bağlantı mekanizmaları nedeniyle muhtemeldir. Bu bozulma, yeni kopya etmek mRNA analizi ile gelen edilişi mRNA sentezi ölçmek için yeni protokoller geliştirme istenir. Son yıllarda, birkaç alternatif, küresel çalıştırma sıralama (GRO-seq)1ve sıralama (NET-seq)2,3yerli uzama transkript de dahil olmak üzere sunulmuştur. Burada, başlangıçta memeli hücreleri4,5,6 ' geliştirilen ve Maya7,8,9,10' auyarlanmış bir protokol bulunuyorlar, bir thiolated nükleozit veya temel analog ile etiketleme RNA dayanır, 11, 4-thiouridine (4sU) veya 4-thiouracil (4tU), anılan sıraya göre.

Bu yöntem özellikle yeni transkripsiyonu RNA hangi RNA hücrelerden arındırır darbe etiketli hücre homeostazı hemen hemen hiçbir girişim ile 4sU ile vardır. Sonra hücreleri 4sU için sunulan, bu nedenle, hızla 4sU-trifosfat için fosforile ve transkripsiyonu RNA'ların içinde dahil uptaken, moleküldür. Bir kez darbe etiketli, toplam Hücresel RNA (RNA kararlı durum düzeylere karşılık gelen) ayıklamak mümkündür ve daha sonra 4sU etiketli RNA kesir thiol-özellikle bu değişiklik, bir disülfür bağ oluşumu için biotin arasında önde gelen ve Yeni transkripsiyonu RNA4,5. Ancak, 4sU sadece insan equilibrative nükleozit ışınlama (hENT1), tomurcuklanma veya fisyon mayası hemen onun kullanımını engelleme gibi bir nükleozit taşıyıcı ifade hücreleri tarafından uptaken olabilir. Bir hENT1 S. pombe veya S. cerevisiaeifade olabilir iken, daha kolay bir yaklaşım, Maya hücreleri 4tU, ifade bir nükleozit ışınlama10, , gerek kalmadan kadar sürebilir bu yana değiştirilen temel 4tU kullanılarak elde edilebilir 11 , 12 , 13. Aslında, 4tU metabolizma enzim urasil phosphoribosyltransferase (UPRT) faaliyet gerektirir. Maya ama değil memeliler, dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda UPRT urasil Üridin monofosfattır için geri dönüşüm pirimidin kurtarma yolu için esastır.

Transcriptomic çalışmalarda önemli bir önyargı paralel olarak analiz farklı örnekleri arasında normalleştirme tarafından tanıttı olabilir. Gerçekten de, birçok temaslara faktör transcriptome mutant ve vahşi-türü suşları karşılaştırmalı analizi etkileyebilir: hücre lizis, verimliliğini farklılıkları ayıklama ve RNA ve Mikroarray analizleri için tarayıcı kalibrasyon'deki kurtarma , diğerleri arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon küresel etkileri beklenen yukarıda da açıklandığı gibi bu tür varyasyonları özellikle yanıltıcı olabilir. Doğru bir şekilde farklı örnekleri arasında mRNA sentezi oranlarını karşılaştırmak için zarif bir ortalama bir iç standart olarak uzaktan ilgili fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe kullanarak tasarlanmıştır. Bunun için sabit sayıda S. pombe etiketli hücreleri S. cerevisiae örnekleri, hücre lizis ve RNA ayıklama10önce vahşi-türü ya mutasyona uğramış hücreler eklenir. Daha sonra S. pombe ve S. cerevisiae kararlı durum hem yeni sentezlenmiş RNA'ların RT-qPCR veya üzerinden Mikroarray fiş ya da yüksek üretilen iş sıralama10kullanımı sayısal. Bu veriler kinetik modelleme ile birleştirerek, mRNA sentezi ve mayası çürümesi mutlak oranda ölçülebilir.

Bu makale çerçevesinde, biz nasıl RNA polimeraz II transkripsiyon tomurcuklanma coactivator kompleksleri destan ve TFIID14,15Maya için küresel bir rol ortaya çıkarmak için yeni transkripsiyonu RNA Analizi izin gösterir, 16. Önemlisi, son çalışmalar kararlı durum mRNA düzeyleri S. cerevisiae sayılabilir ve destan destan mutasyonlar kuvvetle etkilenen ama nispeten TFIID karşı olan Maya genler, sınırlı sayıda üzerinde baskın bir işlev çalış önerdi mutasyonlar17,18,19. Şaşırtıcı, destan enzimatik faaliyetleri tüm kopya etmek soykırım, RNA polimeraz II transkripsiyon Co bu harekete geçirmek için daha geniş bir rol öne hareket gösterilmiştir. Azalan RNA polimeraz II işe alım en ifade genler, destan veya TFIID, bu coactivators birlikte çoğu genleri çalışır düşündüren inactivation üzerine gözlendi. Bu nedenle, yeni kopya etmek mRNA miktar destan ve TFIID için neredeyse tüm genlerin transkripsiyonu RNA polimeraz II14,15,16tarafından gerekli olduğunu ortaya koydu. Telafi edici mekanizmaların uygulanması için hücreleri mRNA sentezi mRNA yıkımı eşzamanlı bir küresel düşüş arabelleğe alınmış genel bir azalma ile başa çıkmak bir yol olarak ortaya çıkıyor. DESTAN transkripsiyon faktörü TFIIH21,22 RNA polimeraz II transkripsiyon, RNA Pol II alt birimleri10gibi küresel bir etkisi, arabulucu coactivator karmaşık20, general sahip faktörler listesine ekler ve dolaylı olarak, öğeleri mRNA yıkımı makine9,10,23. Telafi tür olayların evrensel destan mutantlar, mRNA sentezi14küresel ve ciddi bir düşüş rağmen kararlı durum mRNA düzeylerinde mütevazı ve sınırlı değişiklikler için muhasebe gözlendi. Benzer analizler de tam bir kaybı histon H2B ubiquitination ile sonuçlanan bir BRE1 silme yük içinde gerçekleştirilmiştir. İlginçtir, bir çok daha hafif ama tutarlı küresel etkisi RNA polimeraz II transkripsiyon Maya içinde yeni transkripsiyonu RNA'ın metabolik etiketleme algılayabilir ve çok çeşitli mRNA değişiklikleri ölçmek olduğunu belirten Bre1, yokluğunda tespit edilemedi sentez oranları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hücre kültürü çalışmalarının ve Rapamycin tükenmesi bir destan alt birimi

  1. Her S. cerevisiae zorlanma ve çoğaltma için vahşi-türü dahil olmak üzere veya kontrol suşları, YPD Orta (%2 pepton, % 1 maya özü ve % 2 glikoz) 5 mL taze bir tabağa tek bir koloni aşılamak.
  2. S. cerevisiae hücreleri gecede 30 ° C'de sabit ajitasyon (150 devir/dakika) ile büyümek.
  3. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) ve yaklaşık 100 0.1 ml YPD orta OD600 kültür sulandırmak ve OD600 0,8 kadar büyümesine izin.
  4. Buna paralel olarak, bir koloni Evet orta 50 mL taze bir tabağa S. pombe hücre aşılamak (% 0.5 maya özü; 250 mg/L adenin, histidin, urasil, lösin ve lizin; % 3 glikoz) ve gecede 32 ° C'de sabit ajitasyon (150 ile hücrelerin büyümesine devir/dakika).
  5. S. pombe gecede kültür OD600 ölçmek ve kültür yaklaşık 0,1 500 ml Evet orta OD600 sulandırmak ve OD600 yaklaşık olana kadar büyümesine izin 0.8.
  6. Her S. cerevisiae çapa koyma zorlanma ve çoğaltma için vahşi-türü dahil olmak üzere veya kontrol suşları, YPD Orta (%2 pepton, % 1 maya özü ve % 2 glikoz) 5 mL taze bir tabağa tek bir koloni aşılamak.
  7. Bir gecede 30 ° C'de sabit ajitasyon (150 devir/dakika) ile hücrelerin büyümesine.
  8. Ertesi sabah, OD600ölçmek, yaklaşık 100 0.1 ml YPD orta OD600 kültür sulandırmak ve OD600≈ 0,8 kadar büyümesine izin.
  9. Rapamycin 100 µL kültür için 1 mg/mL (son rapamycin konsantrasyonu 1 µg/ml) hisse senedi bir çözümden ekleyin ve faiz çekirdek (koşullu olarak tükenmiş protein için gereken süre için sürekli ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya hücreleri izin Genellikle, 30 dk yeterlidir). Denetim için benzer bir Maya kültür kullanın ama rapamycin eklemek yerine, dimetil sülfoksit (DMSO) eşdeğer hacmi ekleyin.

2. 4tU S. pombe ile bir Spike bileşeni (sayım) etiketleme

  1. 2 M 4-thiouracil taze çözeltisi hazırlamak. Bir kez hazırlanan, oda sıcaklığında ve ışıktan uzak tutun.
    1. Doğru 64,1 mg 4-thiouracil her S. cerevisiae kültür için tartmak ve dimethylformamide (DMF) 250 µL veya DMSO 250 µL geçiyoruz.
    2. Spike-, kullanılmak üzere S. pombe kültür için 4-thiouracil 320.5 mg tartmak ve DMSO 1,250 µL içinde çözülür.
  2. S. cerevisiae ve S. pombe kültürler 5 mM son bir konsantrasyon için 4-thiouracil çözüm eklemek ve onları 30 ° C ve 32 ° C, sürekli ajitasyon ile 6 min için sırasıyla kuluçkaya.
  3. 6 dakika sonra hücre sayımı için her kültür küçük bir aliquot kaldırın. Bir otomatik hücre sayaç veya Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak.
  4. Santrifüjü (2500 x g) 4 ° C'de 5 dakika ile hücreleri toplamak
  5. Süpernatant atmak, hücreler (2500 x g, 4 ° C, 5 min) buz gibi 1 x PBS ve tekrar santrifüj ile yıkayın.
  6. Her birine S. cerevisiae ve S. pombe örnekleri toplam sayısını hesaplayın.
  7. 5 mL buz gibi 1 x PBS de hücrelerde resuspend ve S. cerevisiae 3:1 oranında hücrelerle S. pombe ile karıştırın.
  8. Hücreleri (2500 x g, 4 ° C, 5 min) santrifüj kapasitesi, PBS çıkarın, flash-hücreler sıvı N2' donma ve örnek-80 ° c kadar daha fazla kullanılmasını saklayın.

3. RNA çıkarma ve DNaz tedavi

  1. Buz yaklaşık 20-30 dk hücrelerdeyse çözülme.
  2. Bir maya-RNA ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile birkaç uyarlamalar kullanarak RNA çıkarma ile devam edin.
  3. Her örnek 750 µL buz gibi zirkon boncuk kiti ile birlikte bir 1.5 mL vidalı kapak tüp içine dökün. Her tüp RNA--dan ilâ 109 hücre verimli bir şekilde elde edilebilir olduğunu göz önünde bulundurun. Bu nedenle, tüpler her örnek için gerekli sayıda hazır olun. Örneğin, 100 mL (OD600≈ 0,8) S. cerevisiae kültürünü yaklaşık 2 x 109 -3 x 109 hücre, toplam 2.7 x 10 için çıkılan işleyebilir9 4 x 109 hücre (sonra spike-in S. pombe üçte ile toplam hücreleri). Bu durumda, en çok 3-4 tepki tüpler her örnek/durum/mutant/Çoğalt başına gerekli olacaktır.
  4. Her 1 x 109 hücre başına 480 µL kit ile sağlanan lizis arabelleği, 48 µL % 10 SDS ve fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, v/v/v) 480 µL ekleyin.
  5. Bir girdap Mikser kullanarak hücreleri karıştırın ve buz gibi zirkon boncuk içeren tüpler aktarabilirsiniz.
  6. Bir girdap Mikser adaptör üzerine boruları karşılamak, girdap maksimum hızda açmak ve Maya hücreleri (4 ° C'de bir odada) koşullar için 10 dakika için yendi. Alternatif olarak, hücre lizis otomatik bir boncuk döven gerçekleştirin.
  7. 16.000 x g oda sıcaklığında 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde taze 15 mL şahin Tüp üst aşama (aşama RNA içeren) toplamak. Genellikle, her tüp kurtarılan birim civarındadır 500 – 600 µL.
  8. Kısmen arıtılmış RNA içeren 15 mL tüpler için kit ve karışımı ile iyice sağlanan bağlama arabellek ekleyin. RNA çözüm her 100 µL, bağlama arabellek 350 µL ekleyin (sulu faz çözüm hacmi 600 µL, bağlama arabellek 2.1 mL olduğundayani, eklenebilir).
  9. Önceki karışımı için % 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. RNA çözüm her 100 µL, 235 µL % 100 etanol ekleyin (sulu faz çözüm hacmi 600 µL olduğundayani, 1,41 mL etanol ekleyin).
  10. Her ikisi de kit ile sağlanan bir koleksiyon tüp içinde monte 700 µL filtre kartuşu için adım 3.9 karışımı uygulamak.
  11. Santrifüj 16.000 x g, 1 dk için. Santrifüjü süresi toplam hacim filtreden geçmek için yeterli değildi, aralıklarla 30 için yinelemeniz s.
  12. Akış-üzerinden atmak ve aynı toplama tüp yeniden kullanabilirsiniz. Filtre ve 1 dk. için tekrar 16.000 x g , santrifüj başka bir 700 µL RNA-bağlama arabellek-etanol çözüm ekleyin.
  13. Akışı aracılığıyla atın ve RNA çözüm bitmesini 3.11 ve 3.12 adımları yineleyin.
  14. Filtre 2 yıkama x 700 µL, çözüm 1 yıkama ile. Yıkama çözüm yolu ile Santrifüjü 16.000 x g 1 dk. için de toplamak ve her zaman toplama tüp.
  15. Filtre 2 yıkama x 500 µL, çözüm 2 yıkama ile. Yıkama çözüm yolu ile Santrifüjü 16.000 x g 1 dk. için de toplamak ve her zaman toplama tüp.
  16. Bir kez daha, 16.000 x g filtre tamamen kurumasını 1 dk. için tüpler santrifüj kapasitesi.
  17. Filtre kartuşu son koleksiyonu tüp (RNA uygun tüp) aktarmak ve RNA DEPC tedavi, RNase free H2O (100 ° C'ye ısıtılmış) 50 µL ile elute.
  18. Santrifüj 16.000 x g, 1 dk için.
  19. RNA tekrar (aynı tüp için) 50 µL önceden ısıtılmış DEPC tedavi, RNase free H2O. bütün toplu filtreden geçti emin olun ile elute; Aksi takdirde, uzun süre santrifüj kapasitesi.
  20. Bir tek örnek için birden fazla tüpler kullandıysanız, onları bütün bir tüp içinde havuz.
  21. Ölçmek ve uygun ekipman kullanarak örnek saflığı kontrol edin.
    Not: 4tU sadece yeni sentezlenmiş RNA içinde dahil ederken, DNA ile küçük kirlenme olasılığı yoktur. Bu nedenle, her zaman DNaz örnekleriyle tedavisi için tavsiye edilir ben. Bunun için RNA-ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) üreticinin önerilerini takip sağlanan reaktifler kullanın.

4. thiol özgü Biotinylation yeni sentezlenmiş RNA'ın

  1. Bölüm 3-2 mg/ml protokolü ile elde edilen RNA konsantrasyonu ayarlayın. Toplam RNA, aliquot 200 µg 60 ° C'de 10 dakika için ısı ve hemen buz 2 min için chill.
  2. RNA aliquot için aşağıdaki sıraya göre aşağıda belirtilen reaktifler ekleyin: 600 µL DEPC tedavi, RNase free H2O, 100 µL biotinylation arabellek (100 mM Tris-HCl [pH 7,5] ve 10 mM EDTA, DEPC tedavi, RNase free H2O) ve 200 µL biotin-HPDP 1 mg/mL biotin-HPDP DMSO veya DMF stoktan.
    1. Bazı durumlarda, biotin-HPDP çözüm çökelti, büyük olasılıkla onun düşük suda nedeniyle eğilimindedir. Bu durumda, DMSO/DMF tepki birim % 40 kadar hacmini (RNA örnek için DEPC tedavi H2O, biotinylation arabelleği 100 µL ve biotin-HPDP 400 µL 400 µL 0,5 mg/mL stoktan ekleyin).
  3. Örnek oda sıcaklığında kuluçkaya ve nazik ajitasyon ile 3 h için ışık korunuyorsunuz.
  4. Kuluçka sonra tüpler için kloroform yaklaşık olarak eşit bir hacmi ekleyin ve kuvvetle karıştırın.
  5. 13.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek spin Bu adımı RNA biotinylate mi fazlalığı Biyotin kaldırılmasını sağlar. Alternatif olarak, faz kilidi tüpler (ağır) kullanarak bu adımı gerçekleştirin. Bunun için faz kilidi tüpler 13.000 x g, 1 dk. için aşağı spin, RNA karışımı ve kloroform, eşit miktarda onları kuvvetle karıştırın ve onları 13.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ekleme
  6. Dikkatle üst aşama yeni 2 mL tüpler içine aktarın.
  7. -Onda biri 5 M NaCl hacmi ve örnek karıştırın.
  8. İsopropanol eşit bir birim eklemek, örnek iyice karıştırın ve 13.000 x g 4 ° C'de en az 30 dk için de spin
  9. Dikkatli süpernatant kaldırmak ve buz gibi % 75 etanol 1 mL ekleyin.
  10. 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin
  11. Dikkatle süpernatant, hızlı-spin Tüp, kaldırmak ve kalan etanol çözüm kaldırın. RNA Pelet değil Kuru emin olun.
  12. RNA DEPC tedavi, RNase free H2o 100 µL içinde askıya alma

5. Toplam ve etiketsiz RNA manyetik boncuklar Streptavidin kaplı kullanarak üzerinden yeni sentezlenmiş kesir saflaştırılması

  1. 65 ° C'de 10 dakika için RNA biotinylated ısı ve sonra 5 min için buz üzerinde örnekleri chill.
  2. Manyetik boncuklar streptavidin kaplı 100 µL biotinylated RNA (at 200 µL son hacmi) ekleyin. Özellikle, bu konuşmaları ile diğer laboratuvarlar, bu gibi görünüyordu sonra beri Malzemeler tablo, belirtilen boncuk daha tutarlı ve güvenilir olarak kullanmak için tavsiye edilir.
  3. Oda sıcaklığında 90 dk hafif sallayarak ile örnek kuluçkaya.
  4. Manyetik standında kiti (Malzemeler tablo) ile sağlanan sütun yerleştirin.
  5. Oda sıcaklığında çamaşır arabelleği 900 µL ekleyin (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl ve %0.1 ara 20, DEPC tedavi içinde RNase free H2O) (önceden çalıştırmak ve equilibrate) sütunlar için.
  6. Boncuk/RNA karışımı (200 µL) sütunlarla.
  7. 1.5 mL tüpler aracılığıyla akış toplamak ve yine aynı manyetik sütun için geçerlidir. Etiketlenmemiş RNA kesir temsil eder gerekirse, bu akış yoluyla tutun.
  8. Sütun 5 yıkama birimleri, arabellek yıkama artan x (600, 700, 800, 900 ve 1000 µL).
  9. 200 µL 0.1 m DTT ile yeni sentezlenmiş RNA elute.
  10. Bir ikinci elüsyon, 3 dk sonra 0.1 M DTT eşit bir hacmi ile gerçekleştirin.
  11. RNA eluting sonra 3 M NaOAc (pH 5.2), buz gibi % 100 etanol 3 cilt ve 20 mg/mL glikojen (RNA-grade) 2 µL 0.1 miktarda ekleyin ve -20 ° C'de RNA acele geceleme izin
  12. Santrifüjü (13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika) tarafından RNA yeniden elde etmek ve DEPC tedavi, RNase free H20 15 µL içinde resuspend. Etiketli toplam RNA oranı yaklaşık % 2-4 yeni sentezlenmiş RNA'ın yaklaşık 2.0 µg işleme % (genellikle daha fazla alt sonuna doğru), olacağı tahmin edilmektedir. Bu miktar Mikroarray/sıralama analizleri için de birkaç qPCR deneyler yapmak için yeterli olacaktır.

6. farklı kesirler doğrulanmasını RT-qPCR

  1. Toplam RNA'ın 2 µg veya rasgele hexamers ve transkriptaz tercih, kullanarak etiketli RNA'ın 10 µL cDNA üretici yönergelerine göre (Tablo reçetesi) sentez.
  2. CDNA standart Protokolü (Tablo reçetesi) kullanarak gerçek zamanlı qPCR tarafından yükseltmek.
    Not: Tüm örneklerini nüsha en az iki biyolojik çoğaltır ve çalıştırılması gerekir. S. pombe tübülin ifade tüm ham değerleri düzeltin.

7. Mikroarray hibridizasyon

  1. RNA örnekleri üretici yönergelerine göre tercih edilen Mikroarray fiş üzerine melezlemek (bu belirli iletişim kuralı için bkz: Malzemeler tablo). Kısaca, biotinylated 150 hedeflerden cRNA hazırlamak ng Premier RNA güçlendirme seti (Tablo malzemeler), üreticinin yönergelerine göre kullanarak RNA'ın. 16 h 45 ° C'de ve Mikroarray yongaları üzerinde 60 rpm için parçalanmış cRNAs 4 mg melezlemek.
  2. Yıkama, leke ve belirtilen İstasyonu ve tarayıcı (Tablo reçetesi) kullanıldığında cips inceden inceye gözden geçirmek. Ham veri (CEL yoğunluğu dosyalar) komut konsolu (AGCC, sürümü 4.1.2) kullanılarak taranmış görüntülerden ayıklayın.
  3. Daha fazla ifade konsol yazılım sürümü 1.4.1 sonda sinyal yoğunluklarını, varsayılan ayarları ve küresel normalleştirme yöntemi olarak ölçekleme ile istatistik tabanlı algoritmalar MAS 5.0 kullanarak ayarla hesaplamak için CEL dosyalarla işlem.
    Not: Her çip kesilmiş ortalama hedef yoğunluğunu keyfi olarak 100'e ayarlandı. Tüm deneylerin en az iki bağımsız biyolojik çoğaltır kullanarak gerçekleştirin. S. pombe sinyal için ham veri normalleştirme ve sınıflandırma toplam ve yeni sentezlenmiş RNA düzeylerinde kat değişiklikleri hesaplamak.

8. veri analizi kullanarak varolan bir R boru hattı

  1. Sentez hesaplamak ve oranları bir boru hattı ve R/Bioconductor paket halk için elde edilebilir, daha önce açıklanan8,10kullanarak çürüme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Metabolik yeni transkripsiyonu RNA etiketleme işlemi sırasında çeşitli yönleri kontrol edilebilir gerekiyor: zaman ve verimlilik etiketleme, spike oranı, ayıklama Protokolü ve biotinylation etkinliği (dahil olmak üzere sinyal-gürültü oranı), diğerleri arasında. Bu koşullar yoğun ve sistemli bir şekilde başkaları tarafından7,10,11gösterilmiştir. Burada esas olarak yorumu ve örnekleri, RT-qPCR, Mik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Transkripsiyon değişiklikleri analiz etmek için genom çapında araçları hala gelişiyordu iken, RNA'ın kararlı durum düzeyleri miktar üzerinden transcriptome tek analizini doğru değişiklikleri RNA polimeraz II etkinliğinde yansıtmıyor. Nitekim, mRNA düzeyleri sadece RNA sentezi tarafından aynı zamanda kendi olgunlaşma ve yıkımı tarafından düzenlenmektedir. MRNA yıkımı edilişi mRNA sentezi ölçmek için farklı protokolleri Maya ve memeliler doğmakta olan transkripsiyon analizi için son yıllarda geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Onun desteği için Laszlo Tora ve V. Fisher, K. Schumacher ve F. El Saafin kendi tartışmalar için teşekkür ederiz. Tüberküloz Marie Curie-ITN Bursu (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) tarafından desteklenen ve Fondation ark. Bu eser fonlarından Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ANR-10-LABX-0030-INRT, Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 altında tarafından yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-ThiourasilSigma-AldrichKedi # 440736
RapamisinEuromedexKedi # SYN-1185
Kontes II FL Otomatik Hücre SayacıThermoFisherN/A
RiboPure RNA Saflaştırma kiti, mayaThermoFisherCat # AM1926
NanoDrop 2000 SpektrofotometreThermoFisherND-2000
TURBO DNA İçermeyen KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisher Cat# 21341
TiyotinAbcamab143556
ve mikro; MACS Streptavidin kitiMiltenyi BiotecCat # 130-074-101
Transkriptör Ters TranskriptazRoche03 531 295 001
SYBR Yeşil I MasterRoche 4707516001
GeneChip Maya Genomu 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Akışkan İstasyonu 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Tarayıcı 3000 7GThermoFisher00-0210

Kaynaklar

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

mRNA SenteziSchizosaccharomyces pombeRNA EkstraksiyonuBiyotinilasyonStreptavidin BoncuklarRT qPCR
Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.