Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme
Bu makalede
Özet
Özet
Bitkiler, algler ve Diyatomlarla fotosentetik performansı güçlü ışık hasat ve enerji hızlı ve verimli regülasyonu kloroplast thylakoid membran transfer işlemlerinde bağlıdır. Diyatomlarla anteni hasat ışık, sözde fucoxanthin klorofil a/c bağlayıcı proteinler (FCP), ışık emilimi için gerekli ve fotosentetik tepki verimli transferi de fotoğraf-koruma aşırı ışık gelince merkezleri. Bu iki işlev arasında geçiş araştırma uzun zamandır devam eden bir mesele. Bu çalışmaların çoğu FCP ile deterjan micelles gerçekleştirilen. Etkileşim çalışmaları için deterjanlar, hangi FCP kompleksleri belirsiz bir toplama için yol kaldırılmıştır. Bu yaklaşım, eserler ve fizyolojik olarak ilgili verileri arasında ayırt etmek zordur. Bu nedenle, FCP ve kompleksleri hasat diğer bağlı membran ışık hakkında daha değerli bilgiler yerel lipid ortamlarındaki katıştırılmış Eğer protein-protein etkileşimleri, enerji transferi ve diğer spektroskopik özellikleri inceleyerek elde edilebilir. En büyük avantajı lipozomlar tanımlı boyutunu ve hangi tarafından FCP kümeleme ölçüde kontrol edilir bir tanımlanmış lipid/protein oranı olması. Ayrıca, in vivo hasat ışık düzenleyen pH ve iyon kompozisyon değişiklikleri kolayca benzetimi yapılabilir. Thylakoid membran ile karşılaştırıldığında lipozomlar elde edilir ve spektroskopik veri anlamak daha kolay kılan daha homojen ve daha az karmaşık. Protokol FCP yalıtım ve arıtma, lipozom hazırlık ve FCP birleşme içine lipozomlar doğal lipid bileşimi ile ilgili yordamı açıklamaktadır. Sonuçlar tipik bir uygulamadan verilen ve tartışıldı.
Giriş
Fotosentetik canlılar Diyatomlarla gibi sürekli değişen ışık koşulları ile başa çıkmak ve yüksek fotosentetik verimliliği sürdürmek ve aşırı ışık tarafından fotoğraf-oksidatif hasarı korumak sofistike calıştıkları mekanizmaları ile yanıt. Bir büyük ışık-koruyucu fotosentetik ökaryotlarda yüksek enerji su verme (qE) olmayan fotokimyasal su verme (NPQ) hafif stres koşulları1,2 altında ana katkısı olarak oluşur emilen ışık işlemidir ,3. Işık hasat Anten kompleksleri (LHC) uyarma enerji transferi yolları Yönetmelikte katılmaktadırlar. Yanıt yüksek ışık olarak düşük
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Fotosentetik kompleksleri FCPs gibi ışık ve ısı için son derece açıktır. Her zaman buz üzerinde ve bir çok loş ışık altında çalışır.
1. yalıtım FCP hücrelerden
-
Thylakoid yalıtım C. meneghiniana hücrelerden
- C. meneghiniana her ASP-orta23,25 ve 50 milyon hücre ile 300 mL dolu beş 500 mL şişe içinde büyümek. Şişeler ile pamuk Tıpa tak ve hücreleri bir shaker 16 h ışık ile 120 rpm'de yaklaşık bir hafta için üstel büyüme aşaması ve 8 h 40 µmol photons/(m²s) beyaz ışık karanlık aşamasında ve 15-18 ° c arasında b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol Cyclotella meneghiniana üzerinden toplam FCP kesir yalıtım ve birleşme lipozomlar yerli lipid bileşimi ile içine açıklar. Thylakoid yalıtım son derece tekrarlanabilir olmakla beraber thylakoid verim değişebilir. Tüm pigmentler % 50'den fazla adım 1.1.4 kazanılmaktadır kabul edilebilir bir sonucudur. % 80'den fazla en uygunudur.
Thylakoids solubilization kritik bir adımdır. Sonra adım 1.2.2 süpernatant pigmentle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FCP lipozomlar doğal lipid bileşimi ile spektroskopik özellikleri araştırmak için kullanışlı, basit ve tekrarlanabilir bir araç sağlamak tüp bebek. FCP lipozomlar lipid ortamında doğal koşullarına yakın olan deneysel sonuçlar için sebebiyet veren thylakoid membran içinde durum benzer.
C. meneghiniana bir modeli sistem olarak FCP anten için kullanmanın bir çok avantajı vardır. Bu nispeten hızlı büyür ve diğer diatom modeli türler ile karşılaştırıldığında, Örneğin, Thalassi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Rana Adeel Ahmad FCP arıtma yardım için teşekkür. Prof. Claudia Büchel yararlı tartışmalar için kabul etti ve el yazması okuma. Bu eser Alman Araştırma Vakfı'na LD (DI1956-1/1) ve Feodor Lynen bursu için ld Humboldt Vakfı tarafından desteklenmiştir
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 500 ml santrifüj şişeleri | |||
| yüksek hızlı santrifüj | Heraeus | ||
| Boncuk Değirmeni VI 2 | Edmund-Bü hler (edmund-buehler.de) | daha yeni sürüm: Vibrogen-Zellmü hle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 & m | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR filtre hunisi - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| için polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri (30 mL); | te (Laborgeraete-beranek.de | )314348 | |
| Ultrasantrifüj Keşfi 90SE | Sorvall | n.a.rotor | |
| T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Hücre Sayaç Odası (geliştirilmiş) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| optik cam küvetler (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spektrofotometre (yazılım dahil) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodesil-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Ultra Şeffaf tüpler AH629 | Beranek Laborgerä için 17 ml; te (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membran concentrator_Centriprep 30 kDa kesme | Milipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kiti | Bio-Rad (bio-rad.com) | ||
| Libre Office Elektronik Tablosu | Belge temeli | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| floresan için özel cam küvetler (101-0S)Hellma | Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spektroflorometre FP-6500 (Yazılım dahil) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS yükleme tamponu Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-oktil ve beta; -D-glukopiranosid | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalaktosil Diakligliserol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | kloroformda stok çözeltisi yapın |
| Digalaktosil Diasilgliserol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | kloroformda stok çözeltisi yapın |
| Sülfokinovosil Diasilgliserol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | kloroform |
| L-alfa-Fosfatidilgliserol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | kloroform |
| L-&alfa; - Fosfatidilkolin | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | stok çözeltisi yapar |
| Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | ||
| mini Ekstruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Nuleopore polikarbonat membran | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| diyaliz membranı Visking 14 kDa kesme | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | kullanmadan önce damıtılmış suda kaynatın |
| Biobeads SM2 Adsorban | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| sükroz epiklorhidrin kopolimeri - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| için polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri (2.7 mL); | te (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Kırlangıç (merckmillipore.com) | 54356 | |
| görünüm sırasına göre listelenen malzeme | Özel güvenlik talimatları için lütfen malzeme güvenlik sayfalarına ve ilgili kılavuzlara bakın. Standart laboratuvar malzemesi ve maddeleri listelenmemiştir. |
Kaynaklar
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
