Yöntem makalesi

Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı

6.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58022

⸱

24 Temmuz 2018

1Department of Biology, University of Hartford

Bu makalede

Özet

Bu protokolü moleküler saat gen ekspresyonu alter patojen ilişkili moleküler desenleri bulmak için fare splenocytes kullanarak bir teknik anlatılmaktadır.

Özet

Davranış-gen ekspresyonu sirkadiyen ritim fizyolojisi neredeyse tüm yönlerini düzenleyen. Burada, fare splenocytes moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 ve ısı öldürdü Listeria Monositogenez meydan ve moleküler üzerindeki etkileri sirkadiyen incelemek için bir metodoloji mevcut saat. Daha önce çalışmalar LPS etkisi a değişiklik-in vivo ve ex vivo yaklaşımlardan modelleri (Örneğin, fare, sıçan ve insan) bir ürün yelpazesine kullanarak moleküler saat inceleyerek üzerinde odaklanmıştır. Bu iletişim kuralı yalıtım ve saat gen ifade sonrası meydan kantitatif PCR ile değerlendirmek için meydan okuma splenocytes yanı sıra metodoloji açıklanmaktadır. Bu yaklaşım sadece etkisi mikrobiyal bileşenleri ifade saatin değiştirebilir moleküler saat diğer moleküller de ama değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım ayrı nasıl etkilediği PAMP Toll benzeri reseptör etkileşim saat ifade moleküler mekanizması kızdırmak için yararlanılabilir.

Giriş

Neredeyse tüm yönleri için 24 h salınımlarını fizyolojisi ve davranış orchestrates, ana saat memelilerde, suprachiasmatic çekirdek hipotalamus1,2içinde (SCN) yer alır. Bir organizma düzeyinde biyolojik süreçleri düzenleyen ek olarak, ana saatini de periferik hücresel saatler boyunca vücut3,4,5eşitler. En az üç birbirine translasyonel transkripsiyon geri besleme döngüleri moleküler saat makine oluşur ise, çekirdek dönemi (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1oluşur, ve saat genler6,7. Çekirdek moleküler saat doğru zamanlama sürdürmek, yanı sıra bazı yardımcı saat gen ürünleri (Örneğin, Rev erbα ve Dbp) da ifade olmayan genlerine düzenleyen, Yani, kontrollü genler (CCGs)6 saat , 7.

Fonksiyonel moleküler saatler çeşitli bağışıklık dokuları (Örneğin, dalak ve lenf bezleri)8 ve hücreleri (Örneğin, B hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar)8,9tarif edilmistir. Bu hücreler algılamak ve moleküler desenleri patojen ilişkili (PAMPs), doğuştan gelen bağışıklık tanıma reseptörleri Toll benzeri reseptörler (TLR)10gibi ile korunmuş mikrobiyal bileşenleri yanıt. Bugüne kadar 13 fonksiyonel TLRs, hangi bakteri hücre duvarı bileşenleri, kamçılı protein ve mikrobiyal nükleik asitler10gibi mikrobiyal bileşenleri tanımak tarif edilmistir. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri TLR4 tarafından tanınan bir hücre duvarı bileşeni sirkadiyen ritim, organizma ve moleküler düzeyde değiştirmek için gösterilmiştir. Örneğin, LPS vivo içinde meydan etkinlik fareler11 tarafından ölçülen fotosentez benzeri faz gecikmeler indüklenen ve indirimli saat gen ekspresyonu SCN (sahne) ve in situ hibridizasyon ve kantitatif PCR ile belirlendiği gibi karaciğer yol açtı, sırasıyla, içinde12sıçanlar. Sonra bir vivo içinde sorun LPS ile qPCR ile ölçülen birkaç saat genlerin değişmiş ifade insan periferik kan lökosit13 ve deri altı yağ dokusu14 analizi ortaya koydu. Son olarak, insan makrofajlar ve fare peritoneal makrofajlar, ayrıca yol açtı ex vivo LPS sorunları qPCR14tarafından ölçülen saat ifade değiştirdi.

Burada, biz PAMPs LPS, (sentetik oligonucleotides içeren bazlar CpG motifler) ODN1826, etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak ve TLR4, TLR9 ve TLR2, tarafından tanınan ısı öldürdü Listeria Monositogenez (HKLM), sırasıyla, Moleküler saat Gen ifadesinin içinde fare splenocytes. Protokol fare splenektomi, splenocyte yalıtım ve meydan okuma, RNA ayıklama, cDNA sentezi ve qPCR birkaç saat genlerin ifade değerlendirmek için içerir. Bu iletişim kuralı çok az hayvan ile bağışıklık hücreleri çok sayıda zamanında edinimi için izin verir veya daha sonra olabilir hücresel manipülasyon ex vivo çeşitli PAMPs ile meydan. Moleküler saat bağışıklık yanıtı8,15,16, çeşitli açılardan modüle gösterilmiştir, bu nedenle, moleküler saat çalışmasının büyük olasılıkla uygun zamana bağımlı varyasyonu zarar bağışıklık yanıtı. Sirkadiyen ritim kesintileri ciddi patolojiler17,18,19,20' ye neden olabilir beri Ayrıca, araştırmacılar splenocytes geniş bir yelpazede meydan okumak için ilgi olabilir moleküller ve saat onların etkisi değerlendirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma sırasında hayvan bakım ve tedavi Ulusal Sağlık Enstitüleri ilkesiyle uyulması, kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak vardı ve Hartford Üniversitesi hayvan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hayvanların sürüklenme

Not: 20 haftalık erkek B6129SF2/J fareler çalışmada kullanılır.

  1. Fareler (Standart genel gider beyaz ışık) 12 h ışık için trene binmek / 12 h karanlık döngüsü 2 hafta önce deney için.
    Not: Burada zeitgeber zaman (ZT) 0 ışıkları ve ZT12, ışıkları tüm diğer çevresel faktörler (Örneğin, yiyecek, su ve oda sıcaklığında) tutarak karşılık gelen sabit 21.

2. aletleri, kültür orta ve meydan okuma orta hazırlanması

  1. Otoklav forseps ve diseksiyon makası. Buzlu mikroskop slaytlar alüminyum folyo ve basınçlı kap çiftlerini sarın.
  2. Kültür orta fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek RPMI 1640 için % 10 son bir konsantrasyon için hazırlayın. Kültür ortamına aşağıdaki PAMPs ekleyerek 10 mL 50 mL tüpler ortamda meydan hazırlamak (RPMI % 10 ile FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), ısı-öldürdü Listeria Monositogenez (108 HKLM/mL), veya başka bir PAMP onun önerilen konsantrasyon.
  3. Sıcak kültür orta ve meydan okuma orta olarak 37 ° C'de bir su banyosu ve yaklaşık 70 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) Oda sıcaklığında tutmak.
  4. Kültür bir 10 mL pipet ve pipet yardım etmek için bir 50 mL tüp ve yer buz üzerinde kullanarak orta 10 mL ekleyin.
  5. Yaklaşık 30 mL % 70 etanol makas ve forseps mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için kabı diseksiyon of a 100 mL kabı ve yer biter ekleyin.
  6. Lizis arabellek RNA izolasyon için 10 µL β-Mercaptoethanol (altında bir duman hood) ekleyerek arabellek RLT 50 mL tüp içinde her 1 mL hazır olun. Sadece gerekli (yaklaşık 1 x 106 hücreleri oluşur örnek başına 600 µL) olacak miktar olun.
    Not: Arabellek RLT silika membran için RNA bağlamayı destekler RNA ekstraksiyon kiti bir bileşenidir.

3. Splenocyte yalıtım ve meydan okuma

  1. Onları kendi özgün kafeste tutma ve 3 L/dak 1 dk. için CO2 durur nefes sonra tedarik devam akış hızında kafesine CO2 ekleyerek narkoz üzerinden belirli zeitgeber zaman fareler ötenazi.
  2. Servikal yerinden çıkması ile ölüm kafatası tabanında boynun iki tarafında başparmak ve işaret parmağı yerleştirerek onaylayın. Alternatif olarak, kafatası tabanında bir çubuk (Öte yandan kullanarak) hızlı bir şekilde kablolarıylaberaber kuyruk veya servikal vertebra ayrılması kafatası22neden arka bacaklarda Bankası basın.
  3. Fare gövde ile % 70 etanol ve kağıt havlu ile silin sprey. Üstünde onun sırt ve biraz eğik sağ yan üzerine fareyi getirin. Kürk kes gitsin, anatomi kullanarak, fare sol tarafında hakkında yarım ön ve arka bacakları makas.
  4. Forseps kullanarak, Karın zarını kapmak ve dikkatle dalak zarar için bir kesik yapın. Forseps ile dalak çıkarın ve Kültür medya buz üzerinde yaklaşık 10 mL içeren bir steril 50 mL tüp içine yerleştirin. Kalan hayvanlar için yineleyin.
    Not: Dalak bir börülce rengidir ve daha uzun ve böbrek daha düz.
  5. Kültür Orta 2 mL ile bir dalak için küçük steril Petri kabına aktarın.
    1. Dalak iki steril buzlu slayt buzlu kısmı arasında taşlama tarafından lunaparkçı. Mümkünse, sorun ve hücreleri ortamda homojenizasyon işlemi sırasında tut.
    2. Bir kez iyice homojenize damlalıklı kültür splenocytes 50 mL tüp içine 40 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla içeren Orta 2 mL.
    3. Buzlu slaytları yeni çift, 50 mL tüpler kültür orta ve hücre Süzgeçler kullanarak kalan dalağı için yukarıdaki adımları yineleyin.
  6. Her splenocytes için toplam hacmi 10 mL/tüp içeren 50 mL tüpler 8 mL soğuk kültür ortamının ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin.
  7. Yaklaşık 1 x 106 hücreler/iyi 6-şey kültür tabakaları bana ekleyin. Hücreleri de deney için kullanılan farklı PAMPs sayısına karşılık gelen ve bir denetim dahil kuyu sayısını ekleyin. 3 mL kültür ortamının veya meydan okuma orta 3 mL ilgili wells için ekleyin.
  8. Plakayı %5 CO2 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  9. Hücreleri de P1000 micropipette bağlı bir 1000 µL damlalıklı ucu kullanarak alt kazı. 15 mL tüp için aynı 1.000 µL damlalıklı ucu kullanarak hücreleri içeren orta aktarın.
  10. Santrifüjü 167 x g oda sıcaklığında 5 min için de üzerinden hücreleri cips. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 5 mL de PBS ile yıkayın.
  11. Hücreleri 167 x g de ikinci kez 5 min için cips, süpernatant kaldırın ve hücreleri parçalayıcı için hücre Pelet lizis arabelleği 600 µL ekleyin. Sonra RNA izolasyon için ilerlemek.

4. RNA izolasyon ve cDNA sentezi

  1. Splenocytes RNA ekstraksiyon kiti üreticinin yönergelerine uygun kullanarak gelen RNA yalıtmak ve 'isteğe bağlı' sütun üzerinde DNA sindirim gerçekleştirin.
  2. CDNA sentez önce RNA konsantrasyonu konsantrasyonu en uygun RNA aralığı (en çok 2 µg) içinde olduğunu doğrulamak için bir microvolume spektrofotometre kullanarak cDNA sentez Kit'in belirlemek.
  3. Synthesize cDNA her üreticinin yönergelerine uygun ters transkripsiyon seti kullanarak örnekleri için. RNA'ın 10 µL her 20 µL toplam reaksiyon birimindeki örnekleri için kullanın. Ters transkripsiyon (thermocycler çalıştırmak) bitiminde 20 μL Ekle H2O her tepki için.
  4. Standart eğri cDNA hazırlamak için 0.5 mL tüp içine birkaç denetim örneklerinden (Örneğin, 5 10 µL toplamda 2 örneklerinden µL) mRNA havuzu için bir P10 veya P20 micropipette kullanarak oluşturun.
    1. 10 µL 2 x transkriptaz ana karışımı ekleyin.
    2. Ters transkripsiyon bitiminde, standart eğri seyreltme serisinde başlangıç konsantrasyonu ("1") görev yapacak tepki tüp H2O 10 µL ekleyin.
    3. 10 kat seyreltme serisi (1-10-4) 45 µL P100 veya P200 micropipette 10-1, 10-2, 10-3ve 10-4dört 0.5 mL tüpler içine kullanarak su ekleyerek gerçekleştirin.
      1. 5 µL P20 micropipettor, yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix kullanarak başlangıç konsantrasyon "1" (10-1) ilk tüp içine eklemek birkaç kez, sonra transfer 5 µL tüp içine 10-1 tüp belirlenmiş 10-2 ve karışımı.
      2. 5 µL P20 micropipette 10-2 tüp 10-3 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın. 5 µL P20 micropipettor 10-3 tüp 10-4 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın.

5. kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)

  1. MRNA düzeylerinin göreli Nefelometri qPCR tarafından belirler. İçinde deneysel Kur'u "Nefelometri - göreli standart eğri" ve "TaqMan" Kimya seçin. Değişiklik tepki birime 10 µL. plaka düzenine (Örneğin, hedef gen, standart eğri, muhabir, vb) ilgili bilgileri girin.
  2. İçerdiği 0.5 µL astar/sonda testin, gen ifade ana karışımı 5 µL, H2O 2 µL ve 2.5 tepki hazırlıkları µL cDNA (10-100 ng).
    1. Bu standart eğri eklediğinizden emin reaksiyonlar, negatif denetimleri, her tepki performans yinelenen ve hesap olacaktır 2 İlave reaksiyonlar sayısına göre her biri önceki reaktifleri (hariç cDNA) çarparak ana bir karışım hazırlamak Pipetting değişim için.
    2. Damlalıklı 7.5 µL bir 96-iyi tepki plaka bir micropipette veya bir çok kanallı pipet ile önceden belirlenmiş kuyu içine Ana hazırlanan karışımı. Damlalıklı cDNA bilinmeyenli ve standartları için uygun kuyunun içine 2.5 µL ve H2O negatif kontrol kuyu içine 2.5 µL.
    3. Çeşitli moleküler saat genler için astar/sonda deneyleri ve aynı zamanda bir tahlil için bir endojen denetimi (Örneğin, β-aktin) içerir.
  3. Göreli ifade değerleri belirlemek için her çoğaltma için Ortalama göreli miktarını hesaplamak sonra her örnek için hedef gen için Ortalama göreli miktarı ile β-aktiniçin Ortalama göreli miktarı bölün.

6. istatistiksel analiz

  1. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak, veri sütun istatistikleri seçeneği altında programa girin. Bir tek yönlü ANOVA saat Gen ifadesinin denetimi karşı PAMP meydan sonra ortalama değerleri arasındaki farklar değerlendirmek için Dunnett'ın öğleden hoc testi ile seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fareler ZT13 kurban edildi, splenocytes izole edildi ve ex vivo PAMPs LPS, ODN1826 veya HKLM meydan. 3 h sonra RNA izole edildi ve qPCR saat, Per2, Dbp ve Rev-erbα tartışmasız denetim hücrelere kıyasla moleküler saat genlerin göreli ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılır. PAMP meydan sonra saat ifade düzeyleri kontrol hücreleri (Şekil 1A) ifadesinde önemli ölçüde farklı değildi. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, microvolume spektrofotometre ölçmek ve gen ekspresyonu belirlemede kullanılan RNA saflığı değerlendirmek için kullanılabilir. Nükleik asitler absorbe UV ışığı 260 nm, proteinler genellikle 280 ışığı absorbe bir RNA çıkarma işlemi (Örneğin, fenol) sırasında kullanılan diğer potansiyel kirletici 230 tespit olmakla birlikte nm, nm. Bu nedenle, absorbans (bir) oranında 260/280 değerlendirme tarafından nm (RNA protein) ve 260/230 nm (protein olmayan kirletici için RNA) RNA kalitesini tespit edilebilir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Teşekkürler

Bu eser tarafından desteklenmiştir fakülte araştırma hibe Hartford Üniversitesi, üniversite Sanatlar ve Bilimler Dekan'ın ofisinden.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Buzlu slaytlarFisher12-550-343
Hücre süzgeçleriFisher22363547
Lipopolisakkarit InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 veya 74106
RNaz İçermeyen DNaz SetiQiagen79254
6 oyuklu hücre kültürü plakasıDenvilleT1006
50 mL tüplerCorning352070
15 mL tüplerCorning352097
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiThermoFisher4368814
TaqMan Gen Ekspresyon Testleri b-aktinThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan Gen Ekspresyon Testleri DbpThermoFisherMm00497539_m1
qPCR makinesi StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Hızlı 96 oyuklu reaksiyon plakası (0,1 mL)ThermoFisher4346907
İstatistiksel Analiz YazılımıPrism 7.0a

Kaynaklar

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579(2018).
  25. Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Splenosit zolasyonuPAMP Stim lasyonuKantitatif PCRFare DalRNA EkstraksiyonuTers TranskripsiyonHemositometre H cre Say mLPS ODN1826Sirkadiyen Ritim

İlgili makaleler