Method Article

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

DOI:

10.3791/58030

⸱

October 5th, 2018

 ,  , 
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verilen hedef gen düzenleyici elemanlarının tanımlaması için bir hedef gen düzenleyici elemanlarının konumlandırma ve etkisi boyutları değişkenlik nedeniyle önemli bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bazı bioinformatic tahmin varlığı ve proksimal korunmuş transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri kullanarak aktif gen ekspresyonu ile ilişkili epigenetik değişiklikler fonksiyonu ile ilerlemeler kaydedilmiştir. Kromatin conformation yakalama çalışmaları yeteneğimizi fiziksel kromatin kişiler dizileri arasında ve tüm bir genom içinde bile keşfetmek için devrim. Dairesel kromatin conformation yakalama (4 C-seq), yeni nesil sıralama ile birleştiğinde özellikle, belirli bir sıra için olası tüm fiziksel kromatin etkileşimler (bakış), ilgi keşfetmek için bir hedef gen veya bir düzenleyici gibi tasarlanmıştır geliştirici. Geçerli 4C-seq stratejileri doğrudan bakış açısı içinde sıra ama çok sayıda gerektiren ve aynı anda üniforma teknik sorunları önlemek için sıralı için farklı bakış açıları (görüntüleme) arama sonraki nesil sıralama platformları ile baz. Bu birimin deney birçok laboratuarlar için pratik olmayabilir. Burada, bir ek Restriksiyon enzimi Özet ve farklı sıra okuma büyük bir yakalama kolaylaştırmak ve olasılığını azaltmak için tasarlanmış qPCR tabanlı amplifikasyon adımları içermektedir 4 C-seq protokolü için değiştirilmiş bir yaklaşım raporu PCR önyargı, anılan sıraya göre. Bizim tarihinde 4C mükellef kromatin mimari değerlendirmek için standart moleküler biyoloji laboratuarında yöntemidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ekspresyonu için düzenleyici elemanlarının tanımlaması tarafından kapsamlı bir şekilde insan genomu1,%280'i için fonksiyonel etkinlik açıklamalı DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) proje kolaylaştırdı. Vivo transkripsiyon faktörü bağlama, DNaseI aşırı duyarlılık ve epigenetik histon ve tek hücre türleri olarak DNA metilasyonu değişiklikleri için sitelerin kimlik fonksiyonel analizleri aday düzenleyici açtı öğeler için hedef gen ekspresyonu. Bu bulgular ile silahlı, biz düzenleyici elemanlarının ve genler arasındaki işlevsel Birleştiricisi belirleme sorun ile karşı karşıya olan. Özellikle, belirli hedef gen ve onun enhancer(s) ilişkisi nedir? Kromatin conformation yakalama (3C) yöntemi doğrudan bir bölge ilgi ve etkileşim dizileri ile yakalanan olayların sabit kromatin3 aday arasında tanımlayıcı fiziksel ve büyük olasılıkla fonksiyonel, etkileşimler tarafından bu soru adresleri . Etkileşimleri kromatin anlayışımız olarak, ancak, bu önceden seçilmiş aday loci incelenmesi gen-artırıcı etkileşimleri tam bir anlayış sağlamak yetersiz olduğu açıktır. Örneğin, kodla insan genomu (44 loci ayarla % 1, pilot) küçük bir bölümünü incelemek için kullanılan yüksek üretilen iş kromozom conformation yakalama karbon kopya (5 C) yöntem ve karmaşık Birleştiricisi loci bildirdi. Genler ve arttırıcılar ile tanımlanan etkileşimleri birçoğu kilobases doğrusal alanı4uzaklıkta bulunan yüzlerce edildi 2 – 4 farklı etkileşen ortakları ortalama. Ayrıca, Li ve ark. Çiftli-bitiş etiketi sıralama (çim) göre kromatin etkileşimi analiz bütün-genom organizatörü etkileşimleri analiz ve RNA polimeraz II bağlayıcı siteleri % 65'i kromatin etkileşimleri dahil bulundu için kullanılır. Bu etkileşimler bazıları büyük, çok gen kompleksleri kilobases genomik mesafe ve içeren, ortalama olarak, yüzlerce spanning her58-9 genler sonuçlandı. Birlikte, bu bulgular kromatin etkileşimleri sorguya tarafsız bütün-genom yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Bu yöntemlerden bazıları Schmitt ve arkiçinde incelenir. 6.

Kromatin conformation yakalama çalışmaları için daha yeni yöntemler bilinmeyen dizileri faiz6bölge ile etkileşim keşfi yeni nesil (Hi-C ve 4 C-seq) sıralama etkinleştir ile birleştiğinde. Özellikle, yeni nesil sıralama (4C-seq) ile dairesel kromozom conformation yakalama yakalanan kromatin proksimal için gelen DNA sekanslama tarafından bir tarafsız şekilde7 ilgi bir dizi ile etkileşim loci tanımlamak için geliştirilmiştir 3B alanda ilgi bölgesi. Kısaca, kromatin Restriksiyon enzimi ile i ciddi ve daha sonra etkileşen loci (Şekil 1) biyolojik ilgili "düğüm" yakalamak için sulu şartlarda bakmaksızın onun yerli protein-DNA etkileşimleri korumak için sabittir. Çapraz bağlantılar böylece ek bölünme için kullanılabilir DNA ile ikinci bir Restriksiyon enzimi bırakarak protein kaldırmak için tersine çevrilir. Son ligasyonu etkileşen loci daha küçük daireler oluşturur. Astar ilgi sıralaması için daha sonra aşağı akım sonraki nesil sıralama tarafından takip circularized parçaları, bilinmeyen sıralarının güçlendirilmiş bir kütüphane oluşturmak için kullanılır.

Numune hazırlama üzerinde duruluyor, burada anlatılan Protokolü varolan 4 C-seq yöntemleri8,9,10,11,12iki önemli değişiklikler yapar. İlk olarak, ampirik olarak amplifikasyon en uygun sayısı 4 C-seq Kütüphane hazırlık adımları için döngüleri ve böylece kitaplıkları aşırı amplifikasyon dallanma PCR önyargı olasılığını açığının belirlemek için qPCR tabanlı yöntemi kullanır. İkinci olarak, bu bir ek kısıtlama Özet adım bir çaba doğru Bankası-tarafından sıralama enstrüman arama engel ve dolayısıyla, benzersiz, bilgilendirici sırası her okuma en üst düzeye çıkarır bilinen "yem" dizileri tekdüzelik azaltmak için kullanılır. Diğer iletişim kuralları bu sorun birçok (12-15)8 4 C-seq kitaplıklar farklı yem dizileri ve/veya kısıtlama siteleri, diğer laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir olmayabilir deneyler hacmi ile havuzu tarafından aşmak. Burada sunulan değişiklikler izin ver deneyler, az sayıda örnekleri ve/veya dizin ve bir tek şeride havuzlu çoğaltır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Restriksiyon enzimi seçimi

  1. Bir bölge ilgi tanımlamak (Örn., gen organizatörü, tek nükleotit polimorfizmi (SNP), artırıcı) ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) için Ulusal Merkezi gibi depoları DNA dizisi elde.
  2. Bu faiz, sıra içinde hangi yapışkan uçlar (DNA termini çıkıntılar ile) sonra sindirim üretmek uygun ve faaliyetlerini tarafından inhibe değil ilk Restriksiyon enzimi sindirim için (RE1) aday enzimleri (REs) tanımlamak KSY metilasyonu.
    Not: Veri çözümlenmesi RE1 tarafından belirlenir. Süre 4 bp tanıma dizisi ile bir enzim parçaları yaklaşık 250 bp uzunluğu, daha kesin izin üretmek bir enzim 6 baz çifti (bp) tanıma dizisi ile ortalama olarak, parçaları yaklaşık 4 kilobases (kb) uzunluğunda, üretir etkileşen dizileri tanımlaması.
  3. Bir RE1 adım uzun bir "bakış açısı" kısıtlama parçası en az 500 bp üreten ilgi bölge veya alternatif olarak, bir komşu bölgesi içeren 1.2 ile belirlenen aday enzimler seçin.
    Not: seçilen enzim astar mükellef olması gerekir (bkz: adım 2) tasarım.
  4. İkinci sindirim için yapışkan biter (DNA termini çıkıntılar ile) sonra olan faaliyet CpG metilasyonu tarafından inhibe değil ve bu sınırlama içinde engelliyor sindirim, yeniden üreten bir 4 bp tanıma sıra ile bir Restriksiyon enzimi (RE2) tanımlamak 250-500 bp yem parçası (Şekil 1) üretmek için RE1 tarafından oluşturulan parçası.
    Not: seçilen enzim astar mükellef olması gerekir (bkz: adım 2) tasarım.

2. tasarım ve Test astar ters PCR ve sindirim verimlilik qPCR için

  1. Primer3 gibi bir astar tasarım aracını kullanma dışa doğru yem parçası sonuna doğru yönlendirilir ters astar tasarlamak için (http://primer3.ut.ee) (i.e., 5' ilk okuma kitabıdır "ters" astar, artı strand 3' astar ise tamamlayıcı bir " İleri"astar, eksi strand tamamlayıcı) ve yakın olmayan bilgilendirici yem amplifikasyon en aza indirmek için mümkün olduğunca kısıtlama siteleri sıra ve PCR verimliliği (Şekil 2A) en üst düzeye çıkarmak gibi.
    Not: Astar genomik DNA dan en az belirsiz amplifikasyon için silico PCR tahminler tarafından öngörülen ve başka bir yerde onların hedefin dışında genom içinde birden fazla 16/18 kimlik9ile hizalanacağını değil. Sıralaması bağdaştırıcısı ters PCR astar dahil değil gibi astar bağlama sitenin diğer 4 C hazırlama yöntemleri daha daha esnektir; astar içinde 50 TAV en iyi şekilde bp ilgili kısıtlama sitesinin sonu.
    1. Ters PCR astar özgüllük tarafından arıtılmış genomik DNA (gDNA) şablon olarak kullanıp amplifikasyon onaylayın.
    2. En uygun astar gDNA şablon olarak kullanırken kaç ürün verim (adım 11,2 beklenen 4 C ürün açıklama için bakınız). GDNA gelen önemli amplifikasyon ortaya çıkarsa, yeni astar tasarım. Kabul edilebilir astar kümesi yok tespit varsa, adım 1'e dönüp yeni enzimleri seçerek yeni bir yem seçin.
  2. Tasarım qPCR astar parçaları kısıtlama sindirim verimliliği (Şekil 2B) izlemek için uzunluğu 70-200 nükleotit (nt) yükseltmek için.
    1. Bir çift yem sıra tanımlamak (1. adımda seçtiğiniz) her kısıtlama site genelinde yükseltmek için astar tasarım. Her iki RE1 için astar tasarım (bkz. Adım 6.5.6) ve (bkz. Adım 9.2) RE2 siteleri.
    2. Siteleri her iki Restriksiyon enzimi için normalleştirme denetimi (uncut DNA) olarak RE1 ve RE2 için (Ayrıca bkz: adım 6.5.6) içeren değil bir bölge yükselterek astar birtakım tasarım.

3. hücreler topluluğu

  1. Doku veya hücre kültürü için uygun bir yöntemle, bir tek hücre süspansiyon elde edilir. Hücreleri 200 x gde 5 min için cips, süpernatant atın ve 1 fosfat tamponlu tuz 107 hücreleri (PBS) x 500 µL Pelet resuspend.

4. Formaldehit kromatin etkileşimleri korumak için hücreleri Cross-linking

  1. 107 hücre başına % 1 elektron mikroskobu (EM) 9.5 mL ekleyin-hemzemin formaldehit (metanol içermeyen PBS içinde) ve, kuluçkaya iken yuvarlanan rocker üzerinde (veya benzer), oda sıcaklığında (RT, 18 – 22 ° C) 10 dk için.
    Not: Fiksasyon koşulları her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekebilir. Fare hücreleri, önceden yayımlanan eser eşlenen okuma telomeric olmayan bir bölge için bir ortalama boy kromozom varsayarsak bakış açısı9 içeren kromozom için hizalama en az % 40 en iyi o fiksasyon sonuçlanan bildirdi.
  2. Buz ve buz gibi 1 M glisin 0,125 çapraz reaksiyon gidermek için M (1.425 mL) son bir yoğunlukta eklemek için tepki tüpler aktarın. Nazik INVERSION tarafından karıştırın.
  3. 200 x g, 4 ° C, 5 min için santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde tüm süpernatant çıkarın. -80 ° C'de hücre Pelet depolamak veya hemen hücre lizis geçin.

5. hücre lizis

  1. Kimden adım 4.3 hücre Pelet 5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) yıkamak için 500 µL içinde resuspend. 200 x g RT. atma, 5 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.
  2. 5 mm EDTA ile % 0.5 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 125 µL hücre Pelet ve 1 x proteaz inhibitörleri, 100 x 5 mg/mL antipain, 10 mg/mL chymostatin, 10 mg/mL leupeptin ve 10 mg/mL pepstatin A. içeren kokteyl gibi resuspend
    Not: Deterjan konsantrasyon her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekebilir. Yetersiz deterjan konsantrasyonları eksik hücre lizis, kromatin ulaşılmaz-e doğru enzimleri bırakarak neden olur. Kısıtlama sindirim adım 6.5.6 ısrarla düşüktür ve enzim aktivitesinin onaylamıştır, ek deterjan gerekebilir. SDS konsantrasyonu % 0.1 adımlarla artırın.
  3. Hücre süspansiyon 10 min için buz üzerinde kuluçkaya.
    Not: için birincil insan keratinositler, 37 ° C gece kuluçka ajitasyon (900 rpm) ile sallayarak bir Isıtma bloğundaki ardından 65 ° C'de 10 dakika kuluçka kullanarak en uygun lizis elde edildi.
  4. Bu hücre lizis tam olduğundan emin olun.
    1. Trypan mavi 6 µL bir slayt ve bir coverslip ile kapak ile mix 6 µL hücrelerin. Mikroskop altında görüntüleyin.
      Not: başarılı lizis iç hücrelerin mavi görünür ve un lysed hücreleri beyaz görünür.
    2. Hücre lizis yetersiz olursa, hücreleri 200 x g 5 min için de cips ve süpernatant kaydedin. Pelet resuspend ve 5.2-5,4 arasındaki adımları yineleyin ve/veya alternatif olarak (bkz: adım 5.3 notta) farklı kuluçka sıcaklık ile.
    3. Yeniden lysed Pelet kaydedilmiş süpernatant ile birleştirmek ve devam edin.
      Not: Görsel muayene yeterli lizis bir garantisi değildir. Sindirim verimliliği adım 6.5.6 olduğu gibi objektif olarak tespit edilmelidir.

6. ilk kısıtlama sindirim

  1. 30 μL Restriksiyon enzimi arabellek (üretici tarafından belirtilen) x 10 ve % 20 27 μL Ekle kimden adım 5,4 Triton X-100 (Son % 1,8) süspansiyon için. H2O. ile 300 µL toplam hacim getirmek
    Not: Restriksiyon enzimi arabellek kompozisyon 1. adımda seçilen RE bağlı olacaktır.
  2. Bir "Sindirilmemiş denetim" ve mağaza 4 ° C'de 15 μL aliquot kaldır
  3. 200 U RE1 kalan tepki karışıma ekleyin ve gecede ajitasyon (900 rpm) ile sallayarak bir Isıtma bloğundaki enzim için uygun sıcaklıkta kuluçkaya. Ertesi gün, ek bir 200 U RE1 ekleyin ve kuluçka gecede devam edin.
  4. 15 μL "Digested denetimi" olarak aliquot çıkarın ve 4 ° C'de saklayın
  5. Sindirim verimliliği belirleyin:
    1. 10 mM Tris-HCl pH 7.5 82,5 µL 15 µL örnekleri için adımları 6.2 6.4 ekleyebilir. 2.5 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin ve 65 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    2. Fenol kloroform 100 µL ekleyin ve rezidüel protein kirlilik INVERSION tarafından kuvvetle karıştırın. Santrifüj için 5 dk, 16,100 x g oda sıcaklığında.
    3. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın. 3 M sodyum asetat pH 5.2, 20 mg/mL glikojen 1 µL ve % 100 etanol (alkol) 300 µL 6,66 µL ekleyin. Karışımı yavaşça tarafından inversiyon ve 1 h için-80 ° C'de yer.
    4. 16,100 x g 4 ° C'de de 20 dk santrifüj Süpernatant kaldırmak için %70 alkol ve 5 min için santrifüj 500 µL RT. de 16,100 x g ekleyin
    5. Süpernatant kaldırmak ve nükleaz ücretsiz H 50 µL içinde Pelet 2 dk. Resuspend için oda sıcaklığında Pelet Makinası2O.
    6. Özet verimliliği tarafından qPCR13,14 ∆∆Ct yöntemini kullanarak belirleyin. Bir kısıtlama site kanat değil ayarla astar kullanın (bkz. Adım 2.2.2) normalleştirme kontrol olarak. Sindirim verimliliği ise > % 85. Aksi takdirde, hücreleri cips ve kuluçka adım 5.3 65 ° C'de atlama 5.2-6.5, adımları yineleyin.

7. ilk tüp ligasyonu

  1. Isı-Restriksiyon enzimi 65 ° C'de 20 dk kuluçka tarafından devre dışı bırakma Alternatif olarak, enzim ısı inaktive olamıyorsan, fenol kloroform ayıklamak ve etanol çökelti örnek.
    Not: bazı enzimleri için önerilen yüksek inactivation sıcaklıklar kromatin proteinleri denatüre ve bu olumsuz örnek kalite etkileyebilir. Ayrıca, bu örnek kaybolmasına gibi fenol: kloroform ayıklama ideal, değildir.
  2. Aktarım 50 mL konik tüp ve nükleaz ücretsiz H 6 mL ekleyin2O, 700 µL ligaz arabellek (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM magnezyum klorür (MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM adenozin trifosfat (ATP)), x 10 ve 50 U T4 DNA ligaz. Karışımı yavaşça dönen tarafından ve gecede 16 ° C'de kuluçkaya
  3. 100 µL aliquot örnek '' tüp ligasyonu denetimi '' olarak kaldırın.
  4. Tüp ligasyonu verimliliği belirleyin:
    1. 2.5 µL İndinavir k (20 mg/mL) ekleyin ve 1 h 65 ° C'de kuluçkaya
    2. Fenol kloroform ve mix 100 µL şiddetle INVERSION tarafından ekleyin. Santrifüj 5 min, RT. de 16,100 x g için
    3. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın. 3 M sodyum asetat pH 5.2, glikojen 1 µL ve %100 300 µL 6,66 µL eklemek alkol. Karışımı yavaşça inversiyon ve yer-80 ° C'de yaklaşık 1 h tarafından.
    4. 16,100 x g 4 ° C'de de 20 dk santrifüj Süpernatant kaldırmak, 16,100 x g 4 ° C'de, %70 alkol ve 5 min için santrifüj 500 µL eklemek
    5. Süpernatant kaldırmak ve oda sıcaklığında Pelet Makinası. Pelet su 20 µL içinde resuspend ve % 0.6 özel jel adım 6.5 "sindirim denetimlerden" yanındaki üzerinde yük.
      Not: İyi ve birleştirilmiş bir örnek nispeten dar, yüksek molekül ağırlıklı bant (Şekil 3) görünmesi gerekir.
    6. Tüp ligasyonu yeterlidir, adım 8 ile devam edin. Aksi takdirde, taze ATP (1 mM son konsantrasyonu) ve yeni ligaz ekleyin; gecede 16 ° C'de kuluçkaya ve 7.3-7,4 arasındaki adımları yineleyin.

8. ters Cross-linking ve kromatin izole

  1. 15 µL İndinavir k (20 mg/mL) eklemek ve bir gecede 65 ° C çapraz bağlantıları tersine çevirmek için kuluçkaya.
  2. 30 µL RNase A, (10 mg/mL) ekleyin ve 37 ° C'de 45 dk kuluçkaya
  3. Fenol kloroform ve mix 7 mL şiddetle INVERSION tarafından ekleyin. Santrifüj 15 dk, RT. de 3300 x g
  4. Sulu faz için yeni bir 50 mL tüp aktarmak ve nükleaz ücretsiz H 7.5 mL ekleyin (DTT mevcut hangi başka türlü-DNA ile precipitates ligaz arabellekte sulandırmak için)2O, 3 M sodyum asetat pH 5.6, 7 µL glikojen (20 mg/mL), 1 mL ve %100 35 mL alkol. Mix ve 1 h için-80 ° C'de kuluçkaya.
  5. Santrifüj 20 dk, 3900 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırmak (Pelet görmek zor olabilir), Pelet buz gibi 70 10 mL ile yıkayın ve santrifüj 15 dk, 3300 x g 4 ° C'de % alkol
  6. Süpernatant kaldırmak ve kısaca RT. erime 37 ° C'de 10 mM Tris-HCl pH 7.5 150 µL Pelet, Pelet Makinası -20 ° C'de depolayın veya adım 9 ile devam edin.

9. ikinci kısıtlama sindirim: kırpma daireler

Not: Bu adım daha küçük yakalanan parçaları PCR önyargı aşağı akım büyütme adımlarda nedeniyle overrepresentation en aza indirmek için daha küçük daireler oluşturur.

  1. Adım 8,6 örnekten için 10 (üretici tarafından belirtilen) Restriksiyon enzimi arabellek x 50 µL eklemek 300 µL nükleaz ücretsiz h2O ve 50 U Restriksiyon enzimi RE2. Gecede için seçilen enzim uygun sıcaklıkta kuluçkaya.
  2. Örnek 15 µL aliquot "sindirim denetimi" olarak kaldırın. Sindirim verimliliği adım 6.5 içinde açıklandığı gibi belirleyin.

10. ikinci tüp ligasyonu ve DNA arıtma

  1. Restriksiyon enzimi üretici tarafından tavsiye edilen şekilde devre dışı bırakabilirsiniz. Enzim ısı inaktive olamaz, bir sütun tabanlı arıtma kit kullanarak enzim kaldırın.
    Not: Bu örnek kaybolmasına gibi sütun arıtma ideal değildir.
  2. Örnek bir 50 mL tüp aktarmak ve nükleaz ücretsiz H 12.1 mL ekleyin2O, 1.4 mL tüp ligasyonu arabellek (660 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP) x 10 ve 100 U T4 DNA ligaz. Gecede 16 ° C'de kuluçkaya
  3. 3 M sodyum asetat pH 5.6, 233 µL nükleaz ücretsiz 467 µL eklemek H2O, 7 µL glikojen (20 mg/mL) ve 35 mL %100 alkol. Mix iyi ve-80 ° C'de 1 h kuluçkaya.
  4. Santrifüj 45 dk, 3900 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırmak, eklemek soğuk 70 10 mL % alkol ve santrifüj 15 dk, 3300 x g 4 ° C'de
  5. Süpernatant kaldırmak ve kısa bir süre oda sıcaklığında Pelet Makinası. 10 mM Tris-HCl pH 7.5 150 µL ekleyin ve 37 ° C Pelet çözülmeye kuluçkaya.
  6. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir silika sütunlara göre PCR arıtma kiti, örnekleriyle arındırmak. 3 x 106 hücreler hücreleri ilk sayısına göre ücret 1 sütun kullanın. 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 50 µL sütunlarla elute ve örnekleri Havuzu.
  7. Konsantrasyon tarafından fluorimetry veya spectrophotometry absorbans 260 kullanarak ölçmek nm. 4C şablon şimdi tersini PCR için hazırdır. -20 ° C'de depolayın veya doğrudan adım 11'e devam edin.

11. PCR yükseltmek bilinmeyen etkileşen dizileri ters PCR tarafından

  1. Amplifikasyon doğrusal dizi şablon dilutions 12.5, 25, 50 ve 100 ng 4 C şablonu kullanarak bir PCR gerçekleştirerek belirlemek. İsterseniz, doğrudan non-spesifik amplifikasyon tanımlamak için ürünleri karşılaştırmak için paralel gDNA dan yükseltmek. PCR reaksiyonları ilk denatürasyon 94 ° C'de 2 min için kullanarak çalıştırın; 30 döngüleri denatürasyon adım 10 94 ° C'de oluşan s, 1 dk 55 ° C'de tavlama bir adım ve bir uzantısı adım 3 dk; 68 ° C'de ve 5 min için 68 ° C'de son bir uzantısı.
  2. 15 µL PCR ürünleri doğrusal amplifikasyon onaylamak ve şablonu kalite (Şekil 4) değerlendirmek için % 1.5 özel jel üzerinde ayırın. 4C şablondan amplifikasyon düşük DNA konsantrasyonlarda ve daha yüksek konsantrasyonlarda bir smear ayrık bantlama verim. Smear varlığını güçlendirilmiş 4 C d artan karmaşıklığı gösterir.
  3. Kalite ve oluşturulan ters PCR ürünün miktarı ile memnun, bir qPCR kadar devir amplifikasyon için kullanılacak en iyi sayısını belirlemek için küme:
    1. Tablo 2' de tepki karışımı kullanarak SYBR ve ROX boyar maddeler içeren tepkiler ayarlayın. Amplifikasyon adım 11,2, kullanım 100 ng şablonunun tepki başına yüksek konsantrasyonlarda doğrusal olmadığı sürece.
      Not: ROX eklenmesi iyi iyi ve döngüsü-döngüsü floresan sinyal normalleştirme kolaylaştırır.
    2. Bir ilk denatürasyon 94 ° C'de 2 min için kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın; denatürasyon adım 10 94 ° C'de oluşan 40 döngüleri s, 1 dk 55 ° C'de tavlama bir adım ve bir uzantısı adım 3 dk; 68 ° C'de ve 5 min için 68 ° C'de son bir uzantısı.
    3. Tepe (bitiş noktası) Floresan amplifikasyon arsa kullanarak reaksiyonların belirlemek. Hangi tepe Floresan (Şekil 5) % 25'i tepkiler ulaşmak belirlemek.
      Not: Bu 4 C kitaplıklar (bkz. adım 11,4) yükseltmek için kullanılan devir sayısıdır.
  4. 4 C şablondan yeme bakmaksızın bilinmeyen dizileri yükseltmek için ters olduğu gibi Tablo 3 PCR ayarlayın. Çalıştırmadan önce 50 µL 16 reaksiyonları bölün. PCR reaksiyonları bir ilk denatürasyon 94 ° C'de 2 dk ve denatürasyon adım 10 94 ° C'de oluşan döngüleri kullanarak çalıştırmak s, bir tavlama adım 1 dk 55 ° c ve 3 dk. 68 ° C'de bir uzantısı adım adım 11.3.3 belirlenen döngü sayısı kullanın.
  5. Toplamak ve tepkileri Havuzu. Bir silika sütunlara göre PCR arıtma kit kullanarak arındırmak. 16 reaksiyonlar başına en az 2 sütun kullanın. Arıtılmış PCR ürünleri havuz.
  6. Örnek miktar ve saflık spectrophotometry tarafından belirler. A260/A280 ~ 1.85 ile 10 ve 20 μg arasında tipik verimleri vardır. Emme oranları alt en iyi durumda, sıralama sırasında sorunları önlemek için yeniden arındırmak.
  7. 300 ayırarak Kütüphane karmaşıklığını değerlendirmek % 1.5 özel jel arıtılmış PCR ürünü ng.
    Not: Güçlendirilmiş ürün bu adım 11,2 benzemelidir.

12. üçüncü kısıtlama sindirim: Yem dizileri Trim

Not: Bu adım aşağı akım sıralama adımları bilgilendirici yakalanan serilerini en üst düzeye çıkarmak için ters PCR ürünleri bilgilendirici yem dizileri kaldırır. Özet etkinliğini izlemek için bir "Özet monitör"15 eşdeğer DNA ve enzim konsantrasyon kullanarak paralel olarak sindirilir. Eşzamanlı sindirim için RE1 ve RE2 uyumsuzsa, örneğin, farklı en iyi kuluçka sıcaklık ya da tepki arabellekleri, nedeniyle bu (Bu ideal değildir) sıralı bir Özet yapılmalıdır.

  1. RE Özet monitör elde etmek ve sindirim 50 µL tepki olarak sınayın.
    Not: Bu dsDNA RE site veya siteleri içerir (örneğin, bir plazmid, PCR amplicon veya sentetik DNA) taşıyan bir moleküldür. Tek gereksinim kesim kesilmemiş bir özel jel monitörde ayırmak kolay olmalıdır olmasıdır. Gerekirse en iyileştir RE monitör kütle ve enzim konsantrasyon.
  2. Özet 1 µg arıtılmış ters PCR ürününün adım 11,6 ve paralel, adım 12,1 RE monitörden.
    Not: DNA ve enzim konsantrasyon yanı sıra kuluçka süresi, adım 12,1 hem ters PCR ürününün test özetinde ve monitör özetleri için aynı olması gerekir. Reaksiyon sesi gerektiği gibi ayarlayın.
  3. Sindirilir konsantrasyon beklenen parçaları için uygun bir özel jel İzleyicisi'ni çalıştırın. Sindirim olarak kabul edilir yeterli zaman < DNA'ın % 10 kalır kesilmemiş (Şekil 6).
  4. Bir silika sütunlara göre DNA arıtma kiti sindirilir ters PCR ürünü arındırmak. Sıralı digests gereklidir, 12,1-12,4 ikinci enzim ile yineleyin.

13. Kütüphane sıralama hazırlık

  1. Bağdaştırıcıları ilgili sonraki nesil sıralama platform ile uyumlu ligate.
    1. Oligos tavlama sonra her RE adaptör ilgili 1 taraflı çıkıntı olması, bağdaştırıcılardan her RE1 ve RE2 için tasarım.
      Not: HindIII kullandıysanız, örneğin, tavlanmış bağdaştırıcısı 5' fosforile "AGCT" çıkıntı içermesi gerekir. Alternatif olarak, Standart T-çıkıntı bağdaştırıcıları kullanılıyorsa, bitiş-onarım ve A-kuyruk bağdaştırıcısı ligasyonu önce kitaplığı.
    2. Kendi adaptörü RE oligos tavlamak. Oligos tavlama arabellekte (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM sodyum klorür (NaCl), 1 mM EDTA) resuspend, 50 µM, ısı ile 95 ° C arasında için ekimolar miktarlarda karıştırın ve yavaş yavaş 25 ° C'ye soğumasını bekleyin
    3. Tüp ligasyonu tepki gerçekleştirin. Ligaz arabellek x 1'deki bir toplam 5 - için 10 - kat molar fazlalığı tavlanmış adaptörler (adım 13.1.2; 50: 50 oranı kullanılan her RE adaptörü için) ile yeniden sindirilir 4C Kütüphanesi mix ve 6U DNA ligaz ekleyin. Üretici yönergelerine göre kuluçkaya.
    4. Düşük-elüsyon birim silis tabanlı sütun seti kullanarak arındırıcı tarafından aşırı bağdaştırıcıları kaldırın.
  2. Boyut seç.
    Not: Boyut seçimi bir boncuk tabanlı temizleme kiti kullanılarak da gerçekleştirilebilir ve sonra bile saflaştırma sütun önerilir.
    1. Dökme önce UV leke ekleyerek yüksek çözünürlüklü bir özel kullanarak bir % 2 özel jel döküm. Isıtma sırasında buharlaşma nedeniyle kayıp herhangi bir su şişe veya cep şişesi önce ve Isıtma ve kayıp kitle kurtarmak için su ekledikten sonra ağırlığında tarafından değiştirilir emin olun.
    2. Bağdaştırıcı bakmaksızın kitaplıkları örnekleri arasında boş şerit bırakarak jel, çalıştırın.
    3. Boyut aralığı 150 bp 1 KB bir temiz bistüri veya jilet kullanarak karşılık gelen jel dilimleri tüketim.
    4. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak jel kitaplıklardan arındırmak. DNA'ın kurtarma GC önyargı en aza indirmek için jel dilimleri rotasyon ile Oda sıcaklığında geçiyoruz.
  3. PCR güçlendirme için döngüsü reaksiyonu karışımı kullanarak Tablo 4' te qPCR tarafından sayısını belirleyin. PCR reaksiyonları ilk denatürasyon 98 ° C'de 2 min için kullanarak çalıştırmak ve 40 döngüleri denatürasyon oluşan adım 10 98 ° C'de s, 1 dk. için 60 ° C'de tavlama bir adım ve bir uzantısı adım 3 dk 72 ° C'de.
    Not: hangi maksimum % 25'i floresans ulaşır döngüsü Kütüphane, olduğu gibi adım 11,3 yükseltmek için kullanılan devir sayısıdır.
  4. Tablo 5' te tepki karışımı kullanarak kitaplıkları yükseltmek. PCR reaksiyonları bir ilk denatürasyon 98 ° C'de 2 dk ve denatürasyon adım 10 98 ° C'de oluşan döngüleri kullanarak çalıştırmak s, 1 dk. için 60 ° C'de tavlama bir adım ve bir uzantısı adım 3 dk 72 ° C'de. Her kitaplık için kullanılmak üzere amplifikasyon döngü sayısı adım 13,3 belirlendi.
  5. Güçlendirilmiş kitaplıkları bir düşük-elüsyon birim silis tabanlı sütun kit kullanarak arındırmak.

14. sıralama ve veri sıralama Analizi

  1. Fluorimetric tahlil kullanılarak güçlendirilmiş kitaplıkları konsantrasyonları belirlemek. Uygun konsantrasyonu (onay sıralama hizmet veya çekirdek için onların tavsiyesi ile) sıralama için kitaplıklarına sulandırmak.
  2. Bir mikrosıvısal nükleik asit Analizi platformu kullanarak kitaplıkları kalitesini belirlemek.
    Not: Kütüphane boyutu profil boyutu seçimi jel adım 13,2 üzerinde görülen taklit etmemelidir ve sıralama için kullanılacak bu adımda belirlenen örnek konsantrasyonu olduğunu.
  3. Havuzu örnek en az 3 milyon okuma (en az 50 bp okuyun; tek [1 X 50] veya eşleştirilmiş bitiş [2 X 50]) elde etmek için kitaplıklarına dizine. Yüksek kaliteli kütüphane en az 1 milyon eşlenen9okur, ama orada-ecek var olmak biraz yıpratma eşleme sırasında gerektirir. Örneğin, yaklaşık 150 milyon okuma lane başına verimleri bir sıralama platform ilâ 50 örnekleri tek şeritte hizmet verebilir.

15. sıra veri analizi

  1. Veri okuma onların uygun örnekleri için atamak için Dizin dizileri kullanarak demultiplex.
    Not: onların benzerlik bağlı olarak, kullanıcılar aşağı akım Hesaplamalı ham FASTA/FASTQ sıra dosyalar temel komut satırı arabirimi veya alternatif olarak, Kullanıcı dostu, web tabanlı Galaxy grafik kullanıcı arabirimi (GUI)16 kullanımı çözümlemesi .
  2. Bağdaştırıcı dizileri ve sindirim adım 12 ' yeniden eksik örneğin kaynaklanan, FAST-X araç seti (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) kullanarak herhangi bir yem sırası kırpın.
  3. Demultiplexed okuma için ilgi genom uygun harita (Örn., UCSC mm10, hg19) Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 ya da SAM kaynaklanan diğer hizalama yazılım kullanarak çıkış dosyaları. Gerekirse, via samtools18 BAM için SAM dosyalarını dönüştürmek (bkz. adım 15,4).
  4. 4 C-seq analiz boru hattı Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21veya fourSig22 gibi verileri çözümlemek ve etkileşimleri tanımlamak için kullanın.
    Not: Seçilen yazılım paketi'nın başvuru rehberine göre veri analizi ve bunların kalite değerlendirmesi yapılmalıdır. Paketleri belirtilenler dışında yatak çıktı dosyaları oluşturur. Kısaca, Basic4CSeq19 (txt, TIFF, yatak ve peruk çıktı dosyaları) etkileşimleri görselleştirmek için bir giriş SAM dosyası (adım 15,3) kullanır ve van de Werken ve arkiçinde belirtilen ölçütlere göre verilerin kalitesini değerlendirir. 9 4 C-ker20 (giriş kesilmiş FASTQ, adım 15,2) ve FourCSeq21 (giriş BAM, adım 15,3) tanımlamak koşulları arasındaki fark etkileşimler. fourSig22 (giriş SAM) de önemli etkileşimler tanımlar ve tekrarlanabilir olma olasılığı olan öncelik. Genomik düzenleyici zenginleştirme ek açıklamalar araç (büyük)23veya kodla veri setleri ile tümleştirme gibi araçlar da 4 C-seq. tarafından keşfedilen etkileşimlerin biyolojik işlev tahmin etmek için kullanılabilir

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil insan Lenfositi 2-3 atılan yenidoğan foreskins izole edildi, havuza alınan ve kültürlü takıma KSFM 30 µg/mL ile sığır hipofiz özü, 0,26 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü ve 0.09 mM kalsiyum klorür (CaCl2 ) 37 ° c, % 5 karbon dioksit. Hücreleri iki şişe ayrılmış ve bir şişeye CaCl2 ek tarafından Proliferasyona üzerinden 72 h. 107 hücreler her için 1,2 mM son bir konsantrasyon için Ayrıştırılan ve nüfus % 1'sabit keratinosit farklılaş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4C sonuçları önceden bilinmeyen düzenleyici elemanlarının tanımlayabilirsiniz kromatin etkileşimleri ve/veya bir belirli biyolojik bağlamda24,25,26yılında önemli hedef genleri ortaya potansiyeline sahip. Ancak, teknik engellerin Bu deneylerden elde edilen veriler sınırlayabilir. 4 C protokolleri şablonunda aşırı amplifikasyon kaynaklanan PCR önyargı olasıdır. Bu iletişim kuralı döngüleri amplifikasyon en uygun sayısı objektif bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NIAMS (R01AR065523) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNA oligonükleotid primerleriIDTOkuyucu tarafından tasarlanmak üzere
50 mL konik santrifüj tüpleriFisher Scientific06-443-19
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleriMidSciAVSS1700
Fosfat tamponlu salinThermo Fisher14190-136
Formaldehit, metanol içermeyenElektron Mikroskobu Bilimleri15710
NutatörVWR15172-203
GlisinJT Baker4059-00
Tezgah üstü santrifüj
Soğutmalı mikrosantrifüj
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichED2SS
%20 SDS çözeltisiSigma-Aldrich05030
Tripan MavisiThermo Fisher15250061
Cam slaytlarFisher Scientific12-550-143
Kapak fişleriVWR16004-094
Işık mikroskobu
Triton X-100Alfa AesarA16046
Çalkalama ısı bloğu
2 M Tris-HClKalite Biyolojik351-048-101
Proteinaz KNEBP8107S
Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1)Sigma-AldrichP2069
Sodyum asetatSigma-AldrichM5661
20 mg / mL glikojenThermo FisherR0561
EtanolFisher Scientific04-355-223
Nükleaz içermeyen suFisher ScientificMT-46-000-CM
qPCR döngüleyiciThermo Fisher4453536
qPCR plakalarıThermo Fisher4309849
ThermocyclerThermo Fisher4375786
PCR şerit tüpleriMidSciAVSST-FL
1 M Magnezyum klorürKalite Biyolojik351-033-721
DitiyotreotolSigma-Aldrich43815
Adenozin trifosfatSigma-AldrichA2383
T4 DNA LigazNEBM0202S
AgarozSigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Qiaquick PCR saflaştırma kitiQiagen28104
MinElute PCR Saflaştırma kitiQiagen28004
Spektrofotometre
Uzun Şablon PCR Sistemini GenişletinSigma-Aldrich11681834001
dNTP karışımıTermo FisherR0191
SYBR Yeşil ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Sodyum klorürSigma-AldrichS5886
End-It DNA Uç Onarım TakımıLucigenER0720
LigaFast Hızlı DNA Ligasyon SistemiPromegaM8221
SYBR GüvenliTermo FisherS33102
Taq PolimerazNEBM0267S
UltraSieve AgarozIBI BilimselIB70054
Qiaquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular Chromosome Conformation Capture4C seq ProtocolChromatin Interaction AnalysisNext generation SequencingRestriction Enzyme DigestionInverse PCR AmplificationQPCR based AmplificationChromatin Architecture AssessmentGene Regulatory SequencesTranscriptional Regulation Field

Related Articles