Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Summary

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Abstract

Saf kültürler incelenmesi ve mikrobiyal topluluk dinamiklerini izleme doğal ekosistemler ve teknik uygulamaları mikroorganizmalar tarafından tahrik anlama ve denetleme için çok önemlidir. Yeni nesil sıralama yöntemleri yaygın olarak microbiomes gidermek için kullanılmaktadır, ancak genellikle kaynak ve zaman yoğun ve çoğunlukla nitel bilgi sunmak. Akış sitometrik microbiome analiz bu dezavantajları zarar vermez ve göreli subcommunity zenginliği ve mutlak sağlayabilir hücre, satır numaraları. Her ne kadar doğrudan filogenetik bilgi teslim etmez, analiz derinliği ve çözünürlük yaklaşımlar sıralama, geliştirebilirsiniz. Araştırma ve rutin ayarları tıbbi uygulamalar keskin aksine, akış sitometresi microbiome analiz için hala yaygın olarak kullanılır. Örnek hazırlama ve veri analiz boru hatları üzerinde eksik bilgileri bir giriş engeli sık ders kitabı akış sitometresi uygulamaları olurdu microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için oluşturabilir. Burada, biz üç kapsamlı iş akışları saf kültürler için mevcut, karmaşık topluluklarda zorlu matrisler, orta ve karmaşık topluluklarda sırasıyla temizleyin. Biz bireysel örnekleme ve fiksasyon yordamlar açıklar ve ilgili örnek kümeleri için protokolleri boyama en iyi duruma getirilmiş. Biz merkezli karmaşık bir araştırma ile sitometrik Analizi ve bir uygulama odaklı tezgah üst aygıt ayrıntılı yordam sıralama hücre tanımlamak ve veri analiz paketleri öneririz. Ayrıca önemli deneysel kontrolleri teklif ve sunulan iş akışları ilgili örnek kümeleri için geçerlidir.

Introduction

Mikroorganizmaların insan birçok yönden canlı hayati bir rol oynamaktadır. Onlar gezegen karbon, azot, fosfor ve kükürt döngüsü¹ve^2,3 aşağılayıcı yanı sıra⁴ Biyokatalizörler Atıksu arıtma tesisleri gibi çeşitli sektörlerde sentezleme olarak hareket ana biyotik sürücüleri vardır ⁵ ya da biyoteknoloji⁶. Onlar bile insan sağlığı ve metabolizma^7,8doğrudan etkileyen insan microbiome oluşturmaktadır. Bu nedenle, yapı, fonksiyon ve yakın çevreleri, yanıt olarak mikroorganizmaların dinamik davranış hakkında bilgi, amacımız tam olarak anlamak ve bu sistemlerin manipüle etmek gereklidir. Yeni nesil (NGS) sıralama microbiome yapısı ve fonksiyonu⁹çözmek için kurulan teknoloji değildir. Ancak, analiz ve değerlendirme NGS veri Niceliksel bilgileri verim değil ve hala pahalı, zaman alıcı ve hiçbir şekilde performans koridorları içinde yerinde sonuçlar sağlamak hazır. Bazı bakteri üretimi kez 1 h ve sürekli değişen toplum yapıları bazı ortamlar¹⁰neden aşağıdaki görüntüler. Böyle dynamics sıralama yaklaşımları kullanarak en bilimsel labs mali ve iş gücü kapasitesi aşabilir.

Buna ek olarak, akış sitometresi daha yüksek bir zaman, işgücü ve maliyet verimliliği koruyarak topluluk parmak NGS veri için benzer sağlar. Burada, akış sitometrik teknikleri mikrobiyal topluluk dinamikleri,-line tek hücre düzeyde uygulayabilmek için mevcut. NGS, aksine akış sitometresi filogenetik ilişki veya bilgi fonksiyonel genler sağlamaz ancak nicel hücre sayıları sunar. Akış Sitometresi kullanılarak, mikrobiyal toplulukları içine subcommunities farklı ışık saçılım ve floresan özellikleri (hücre boyutu ve parçalı yapı, sırasıyla ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) sağlamak) ile çözülebilir. Sunulan yaklaşım ağırlıklı olarak hücre boyutu - kullanır ve DNA belirli hücre tipleri ve fizyolojik (büyüme) Birleşik ilişkili ilgili bilgileri tutar. DNA içeriği UV telaşlı 4', A-T zengin DNA bölgelerine bağlanır ve hatta farklı kromozom düzeyleri çözümlemek için 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) boya kullanarak sayılabilir. DAPI floresans ve FSC birleştirerek 50'den fazla subcommunities seçkin ve zenginliği saat¹¹üzerinde değiştirmek için izlenir. Subcommunity bereket varyasyonları pH ve ürün titreleri gibi¹², genel parametrelerini, hava^13,14gibi veya bağırsak ya da tükürük ile mikro çevre çevresinde değişikliklerle ilişkili olabilir bazı tıbbi tedaviler¹⁵ile microbiomes. Bu korelasyonlar anahtar subcommunities sorumlu tüm toplumun metabolik ağdaki belirli işlevleri için ortaya koyuyor. Anahtar subcommunities daha sonra özellikle terfi veya çevredeki mikro-ortamları değiştirerek bastırılır veya sonraki sıralama¹⁵ veya proteomik soruşturma için¹⁶sıralanmış.

Ancak, mikrobiyal toplum akış sitometresi henüz yaygın olarak oldukça düşük sayıda akış sitometrik aygıtları mikrobiyal nüfus veya topluluklar düzgün çözme yeteneğine sahip olması nedeniyle kurulmuş değildir. Ayrıca, deneyim, topluluk analiz boru hatları ve etkili veri değerlendirme eksikliği microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için bir giriş bariyeri oluşturabilecek. Biz bu sorunları çözmek için kapsamlı iş akışları kurduk. Onların genel uygulanabilirliği göstermek için biz onları üç örnek örnek setlerinde (ek dosya 1-S1), yani ben sunacak) tanımlanmış net Orta (Pseudomonas putida KT 2440 üzerinde yetiştirilen biyoteknolojik uygulamaları için saf Kültür (PC) glikoz), II) net Orta (aktif çamur topluluğa (ASC) sentetik Atıksu) ve III karmaşık laboratuvar toplumda) yoğun matris (Biyogaz topluluğa (M.Ö.) Mısır Silaj) doğal ortamlarda karmaşık bir topluluktan.

Çeşitli faktörler her bu örnek kümeleri için protokol seçimi etkiler. Derin dondurucu zehirli kimyasalların kullanımı forgoes ama çoğunlukla kullanılması dolayısıyla laboratuvar ortamlarına şok buzlanma için sıvı azot sınırlıdır. Formaldehit istikrar ve sonraki etanol fiksasyon toplu örnekleme aliquot hazırlık için gerek kalmadan sağlar ve uzun sürelerle kararlı olduğu ispatlanmıştır. Ancak, protein flocs, denaturized formaldehit tarafından olumsuz sinyal-gürültü oranı neden olabilir çünkü insan tükürük¹⁵ gibi protein açısından zengin örnekleri sorunlu olabilir. Örnek kurutma yordamlar en zaman (yaklaşık toplam 1 h) Bu karşılaştırmada alacak ama sitesinde toksik kimyasallar olmadan yapılabilir. Soğutma veya ek tehlike önlemler kolayca gönderilebilir tüpler istikrarlı granül verimleri. Buna ek olarak, alternatif fiksasyon yöntemleri bol önerilen¹¹olmuştur. Güçlü yeni örnek kümesi sokarken farklı protokolleri çözünürlük ve fiksasyon kararlılığını test etmek için tavsiye ederiz.

Biz iki farklı akış cytometers kümeleri olarak çözümlemeye: i) bir son derece karmaşık ve pahalı, araştırma hücre sıralayıcısı ve yerinde uygulama⁵için daha uygun görünen II) bir uygulama odaklı tezgah üst analizörü merkezli. PC ve ASC hücre sıralayıcısı ile ölçüldü iken M.Ö tezgah üst analyzer ile ölçüldü. Üç örnek örnek analizi en iyi duruma getirilmiş tekrarlanabilirlik, örnek istikrar ve iş akışı kolaylık sağlamak için gerekli farklı yordamlar ayarlar. Aşağıdaki protokol için üç farklı sistem bölümleri belirtir.

Protocol

1. örnekleme ve fiksasyon

1. Saf kültür: derin dondurucu^15,17
   1. Hücre süspansiyon, santrifüj (RT) Oda sıcaklığında 5 min için ve 5000 x g 2 mL al ve süpernatant atın.
      Not: Örneklenen hücre süspansiyon ek dosya 1-S1 içinde açıklanmıştır.
   2. Ayrıca 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl ile bi distile H₂O, pH 7.2) hücrelerde resuspend % 15 (v/v) gliserol cryoprotective ajan olarak içeren.
   3. 10 dakikadır-80 ° C'de sonraki depolama için sıvı azot buz ve şok dondurucu üzerinde kuluçkaya
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnekler en az bir ay boyunca stabildir.
2. Aktif çamur topluluk: formaldehit sabitleme + etanol fiksasyon^5,10,18
   1. Hücre süspansiyon, 15 ° C ve 3200 x g 20 dk santrifüj 4 mL al ve süpernatant atın.
      Not: Örneklenen hücre süspansiyon ek dosya 1-S1 içinde açıklanmıştır.
   2. PBS %2 formaldehit 4 mL ekleyin ve RT., 30 dk için kuluçkaya
      1. % 8 formaldehit hisse senedi eriyik--dan paraformaldehyde sıvı formda sevk formaldehit ekledi tasarrufu katkı metanol önlemek için hazırlayın. PBS 50 ml 70 ° C'de paraformaldehyde 4 g ekleyin Yaklaşık 125 µL 10 M NaOH çözüm ekleyin. Paraformaldehyde tamamen çözülmüş ve izin vermek o kadar karıştırın sonra HCl. donma 15 mL aliquots formaldehit çözümde depolama için RT. ayarlama pH değeri 7. 0 yaklaşık 100 µL % 37 ile serin. Fetişlerin aliquots 10 günden daha uzun süre kullanmayın.
         Dikkat: Formaldehit ele ve bakım nedeniyle toksik ve mutajenik özellikleri ile bertaraf gerekiyor. Her zaman eldiven taşıma sırasında. Bir çok yormak kukuleta paraformaldehyde eriterek zehirli gazlar etkilenmemek için kullanın.
   3. Örnek 15 ° C ve 3200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   4. Örnek 4 ml % 70 etanol ve mağaza-20 ° C'de resuspend
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnekler en az 2 ay boyunca stabildir. Örnek özellikleri bağlı olarak 1.2.1 Santrifüjü adımda da 10 dk 4 ° C'de zaman kazanmak için gerçekleştirilebilir.
3. Biyogaz topluluk: kurutma
   1. Viskoz digestate örnek 200 µL için kırpılmış bir 1000 µL Pipet Ucu 2 mL tüp içine kullanın.
   2. PBS arabelleği 1,700 µL ekleyip iyice karıştırın.
   3. Tüpler 35 kHz ve 80 W etkili çıkış gücü 1 dk. için büyük hücreli agrega terhis ve hücre artıkları bitki yapışmasını hücreleri ayırmak için bir ultrasonik banyo içine koyun.
   4. Örnek iyice karıştırın, örnek bir 50 µL gözenekli filtre ile filtre ve yaklaşık 400 µL dört aliquots filtrate bölme.
      Not: Bu noktada aliquots hazırlanması iki büyük avantaj sağlar. İlk, daha küçük birimler daha kolay ve daha hızlı mekanik suyunu almak için (santrifüj) ve termal olarak (kurutma), ama genellikle küçük birimlerden, kalın biyogaz çamur örnekleme çok zor olabilir. İkinci, ekstra örnekleri sıralama, sonraki hücre için yedek ölçümleri veya denetimleri kullanılabilir.
   5. 10 ° C ve 4.000 x g 10 min için iki kez aliquots santrifüj kapasitesi ve süpernatant ikisinde tamamen mekanik olarak örnek mümkün olduğunca iyice suyunu almak için atın.
   6. 40 dk 35 ° C, yaklaşık-97 kPa ve istikrarlı parçaları oluşturmak için 2500 x g için ısıtmalı bir vakum santrifüj örneklerinde kuru. 4 ° C'de granül karanlıkta saklamak.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Granül en az 6 ay boyunca stabildir.

2. boyama

Not: Yüksek çözünürlüklü nokta araziler teslim kanıtlanmıştır DAPI boyama ve bu nedenle topluluklar analiz ederken özellikle avantajlıdır. Boyama çözüm DAPI konsantrasyon bir hücre kapısı floresan yoğunluğu oldukça gürültü seviyesi üzerinde ama boncuk aşağıda garanti için optimize edilmiş olması gerekir. Optimum enstrüman duyarlılık ve boncuk seçimi bağlıdır, örnek kümeleri K/R içeriği bulunan mikroorganizmaların nedeniyle arasında değişebilir ve genellikle yeni tanıtılan örnek kümeleri için test edilmelidir. Konsantrasyonları 0,24 µM DAPI ile 1 arasında test µM DAPI sunulan kurulum için tavsiye edilir. Diğer boyalar özel uygulamalar için kullanılabilir olur. Kullanımı ne zaman mutlak hücre doğruluk sayma Parmakizi analiz (ek dosya 1-S1)^6,15üzerinde öncelik verilmesini SYBR yeşil ben protokol boyama tavsiye edilir. Daha az örnek işleme ve Santrifüjü adımları içerir ve sabit ve hayati hücreleri ile uygulanabilir. Hayati hücreleri kullanımı daha da örnek işleme adımları fiksasyonun atlayarak azaltır ve dolayısıyla hücre hasat için yalnızca bir Santrifüjü gerektirir. Bu potansiyel hücre kaybı ve sonuç olarak sistematik ölçüm hatası en aza indirir. PBS, permeabilization tampon ve tüm aşağıdaki adımları sırasında kullanılan çözüm boyama örnek ek parçacık yükü azaltmak için 0.2 µm şırınga filtre ile filtre. Escherichia coli BL21 içeren bir örneğini boyama (DE3) gibi her örnek havuzu ile biyolojik bir standart tavsiye edilir.

1. Saf kültür
   1. Örnekleri, santrifüj RT ve 5000 x g 5 min için defrost ve süpernatant atın.
   2. Hücre Pelet buz gibi PBS tekrarlanan pipetting tarafından resuspend ve 0.035 için OD_700nm ayarlayın (yol uzunluğu_küvet = 0.5 cm).
   3. Hücreleri boyama için hazırlayın.
      1. RT ve 5000 x g 5 min için ayarlanan hücre süspansiyon 1 mL santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
      2. 1 mL permeabilization arabelleği 0,3 M sitrik asit ve 4,1 mM Tween20 içeren hücrelerde resuspend ve iyice karıştırın.
      3. Örnek geçirgen hücre zarlarında sonraki boyama için oluşturmak için buz üzerinde 10 min için kuluçkaya.
      4. RT ve 5000 x g 5 min için örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   4. 0.68 µM DAPI 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ arabelleği (289 mM Na₂HPO₄, bi distile H₂O, pH 7 ile 128 mM NaH₂PO₄ ) içeren çözüm boyama 1 mL ekleyin, karıştırın ve en az 15 dakika RT, karanlıkta kuluçkaya.
      Not: Hassas aşırı doz ayarlaması DAPI konsantrasyonu sabit tutuluyorsa DAPI floresans hücre yoğunluğu ile değişir çünkü karşılaştırılabilir ölçümleri güvence altına almak önemlidir. Süpernatant dikkatle hücre kaybı önlemek için genellikle kırılgan bir Pelet nedeniyle kaldırılmalıdır.
      Dikkat: İşlemek ve mutajenik özellikleri nedeniyle özenle DAPI atmayın.
2. Aktif çamur topluluk
   1. Sabit örnek iyice karıştırın ve 0.6 mL Cam tüp içine aktarın. PBS 1.4 mL ekleyin ve RT, 10 min için 1.3.3. adımda açıklandığı gibi solüsyon içeren temizleyicide. Örnek 4 ° C ve 3200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. PBS 2 mL ekleyin ve iyice karıştırın. 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
   2. OD_700nm 0.035 için ayarlamak (yol uzunluğu_küvet = 0.5 cm) PBS ile.
   3. Hücreleri boyama için hazırlayın.
      1. Örnek 4 ° C ve 3200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
      2. 1 mL permeabilization arabelleği 0,11 M sitrik asit ve 4,1 mM Tween20 içeren hücrelerde resuspend ve iyice karıştırın.
      3. RT geçirgen hücre zarlarında sonraki boyama için oluşturmak için 20 dk için kuluçkaya.
      4. Örnek 4 ° C ve 3200 x g 10 min için tekrar santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
   4. Boyama çözüm 0,68 µM DAPI ve 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ arabellek içeren 2 mL ekleyin, iyice karıştırın ve en az 60 dk RT, karanlıkta kuluçkaya.
      Not: Bazı mikroorganizmalar için plastik tüp duvarlar uygun eğilimindedir ve işlemi sırasında kaybolabilir gibi cam tüpler kullanımı önerilir. Kuluçka gecede mümkündür ve genellikle Laboratuvar işlemleri kolaylaştırır.
      Dikkat: DAPI ele ve mutajenik özellikleri nedeniyle itina ile bertaraf gerekiyor.
3. Biyogaz topluluk
   1. Kurutulmuş hücre Pelet PBS içinde askıya alma.
      1. PBS 800 µL eklemek, iyice karıştırın ve Pelet 15dk için emmek.
      2. 1000 µL pipet ile sıvı faz Aspire edin ve sırılsıklam Pelet tüp duvar pipet ucu, silindirik bölümüne taşıyın. Orada kalmalısın.
      3. Pipet Ucu tüp duvarlar boyunca Pelet ezmeye dairesel bir hareketle hareket ettirin.
      4. Pipet Ucu tüp duvar boyunca sıvı faz dağıtımı tarafından elde edilen Bulamaç tüpü duvarlardan yıkayın.
      5. Süspansiyon alıyorum ve pipet üç kez askıya tarafından tahrik.
   2. PBS ile örnek iki kere yıkayın.
      1. 10 ° C ve 4.000 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
      2. PBS 1.500 µL ekleyip iyice karıştırın.
      3. Bir kere yukarıdaki iki adımı yineleyin.
   3. 1.3.3. adımda açıklandığı gibi tüpler için 1 dk ultrasonik bir banyo içine koyun ve daha sonra her örnek bir bireysel cam tüp içine 50 µL gözenekli filtre ile filtre.
   4. OD_700nm 0.035 için örnek 2 mL seyreltik (yol uzunluğu_küvet = 0.5 cm) PBS ile.
   5. Hücreleri adım 2.2.3 yukarıda açıklandığı gibi boyama için hazırlayın.
   6. 2 mL boyama çözeltisi 0,24 µM DAPI içeren ve 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ arabellek, iyice karıştırın ekleyin ve RT geceleri karanlıkta üzerinde kuluçkaya.
      Dikkat: DAPI ele ve mutajenik özellikleri nedeniyle itina ile bertaraf gerekiyor.

3. ölçü

Not: Örnek örnek setleri iki farklı akış cytometers ile analiz edildi. PC ve ASC daha karmaşık, son derece ayarlanabilir ve kolayca özelleştirilebilir, araştırma ortalanmış hücre sıralayıcısı ile analiz edildi. PC analiz için bu aygıt kadar mavi bir önceki yayın¹⁶, kısacası açıklandığı gibi ayarla bir lazer ile donatılmıştı (488 nm, 400 mW) ve bir ultraviyole (334-364 nm, 100 mW) argon iyon lazer. ASC analizi, daha yeni mavi için (488 nm, 400 mW) ve ultraviyole (355 nm, 150 mW) Yarıiletken lazerler monte edildi. Her iki durumda da, mavi lazer (Bant Filtre 488 nm ± 5 nm, nötr yoğunluk filtresi 1.9) FSC ve SSC (Bant Filtre 488 nm ± 5 nm, nötr yoğunluk filtresi 1.9, tetikleyici) indüklenen. Bu optik özellikleri hücre boyutu ve hücre yoğunluğu, sırasıyla ilgili. UV lazerler DAPI floresans heyecanlı (bant filtre 450 nm ± 32.5 nm) hücresel DNA içeriği miktar için. Sıvı sistemi 56 psi (3,86 bar) maksimum 0.3 psi adlı örnek aşırı basınç ve 70 mikron meme ile çalıştırıldı. Tüm parametreleri tepe yükseklikleri ölçüm çözümlemesini geliştirmek için en yüksek alanlarda yerine olarak kaydedildi. Uzun vadeli Biyogaz topluluk izleme bağlı olarak, daha az karmaşık akışı küvet ile tezgah üst analyzer yapılmıştır. Bir ultraviyole yarı iletken lazer (355 nm, 50 mW) FSC ikna etmek için kullanılan (bant filtre 355 nm ± 5 nm) ve SSC (bant filtre 355 nm ± 5 nm, tetikleyici) ve sinyalleri DAPI floresans heyecanlandırmak (bant filtre 455 nm C). Her iki aygıtın kılıf arabellek için kullanılan filtre bı-distile ve 0,1 µm suydu. PBS numune dilüsyonu için kullanılan filtrelerden mümkün olduğunca ölçümlerde parçacık gürültüyü azaltmak için 0.2 µm şırınga filtre.

1. Saf kültür ve aktif çamur toplum
   1. Enstrüman, lazer, bilgisayar ve yazılım başlatmak ve örnek analiz için hazırlanın.
      1. Lazerler üzerinde geçin ve çalışma sıcaklığı ulaşmak ve ışın istikrarı sağlamak için 15 dakika çalıştırın.
      2. Bi distile H₂O için çalışan çözüm x 0.2 ile seyreltilmiş kılıf tank ile 10 x kılıf arabellek (19 mM KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM Na₂HPO₄, 1,39 M NaCl ile bi distile H₂O) doldurun (hücre sıralama: 0.5 x çalışma çözümü).
      3. Sıvı sistemi ile 56 psi basınç ve yaklaşık 6 psi vakum ile atık tankı üzerinde Başbakan.
      4. En az 15 dakika araç durulama örnek bağlantı noktası, boru ve meme Backflush modunda çalıştırın.
   2. Standart boncuk ile kalibre.
      1. Boncuk karışımları ayarı'nda doğrusal (1 mikron mavi + 2 mikron sarı-yeşil floresan) hazırlamak ve Logaritmik aralığı (0.5 mikron ve 1 mikron mavi floresan). Sulandırmak boncuk süspansiyon eşit konsantrasyonları elde etmek için orijinal stok kullanılamaz hale gelen.
      2. Sürekli olarak doğrusal boncuk mix ölçmek ve meme manipüle ederek önceden belirlenmiş kalibrasyon şablonuna boncuk doruklarına uyum ve optik durum-e doğru alet doğrusal aralıktaki önceden kalibre lazer.
      3. Logaritmik aralığına geçin ve Logaritmik boncuk mix kesintisiz ölçerler. Boncuk doruklarına enstrümanın donanım ince ayar yapmak için kendi önceden belirlenmiş kalibrasyon şablonuna uygun. Kazanç ayarı photomultiplier tüp (PMTs), boncuk pozisyon son ayarlamalar.
      4. Enstrümantal gürültü konumunu kontrol edin ve muhtemelen kalibrasyon şablon uyacak şekilde ayarlayın.
         Not: Sabit kalibrasyon şablonu boncuk pozisyonu için bir ölçüm proje öncesinde hazırlanması gerekir ve (bkz. ek dosya 1-S4) değiştirilemez! Enstrümantal gürültü örnek veya PMTs elektronik gürültü parçacıklar tarafından indüklenen ve bir dereceye kadar her zaman kaydedilir. Gürültü tamamen kazanç ayarı veya arsa ofset tarafından gizlemek için tavsiye edilmez. Bolluk ve gürültü olaylar konumunu bilgi değerli bir kaynak olabilir ve bu nedenle ham veriler yer alan. Çok parçacık yoğun örnekleri komplo ve veri analizi nedenlerle gürültü sonraki kaldırılması gerekli. Düzenli aralıklarla kalibrasyon aleti istikrar garanti ve bu nedenle karşılaştırılabilir örnek için bir ölçüm gün boyunca kontrol.
   3. 2.1.4 içinde açıklandığı gibi biyolojik standart içeren bir örnek ölçmek ( Escherichia coli BL21 lekeli DAPI (DE3), Örneklenmiş ve 1.2 ile açıklanan ASC protokolüne göre durağan faz (16 h) sırasında sabit). Kendi önceden belirlenmiş kalibrasyon şablonuna (bakınız ek dosya 1-S5) ile ilgili olarak en yüksek konumunu kontrol edin.
      Not: Rutin boyama ve biyolojik standart ölçüm örneklerinin her havuzlu de boyama yordam için dahili bir denetim olarak görev yapacak. Cihazın boncuklar kullanılarak kalibre edilmiş ve biyolojik standart, önceden belirlenmiş kalibrasyon şablon uymuyor, boyama yordamı muhtemelen tekrarlanması gerekir.
   4. Örnek alma.
      1. Örnek bağlantı noktası ve tüp durulama ve sonraki örnekte DAPI floresans istikrarı sağlamak için 10 dakika için boyama çözüm çalıştırın.
      2. Lekeli örnek sitometresi meme tıkanma veya kapiller akış için ölçüm önce 50 mikron gözenekli filtre ile filtre.
      3. Logaritmik boncuk karışımı enstrüman istikrar izlemek ve bir retrospektif kalibrasyon denetimi için imkanı sağlamak için örnek ekleyin. Örnekleri 1.000 ve 2500 olayları her iki boncuk Gates arasında yer almalıdır.
      4. Bir hücre kapısı enstrüman yazılımında yeni örnek kümesi ilk deneme ölçümler sırasında oluşturun. Bu kapıyı lekeli hücre içeriyor ve gürültü ve boncuk dahil değildir.
      5. Örnekleri mix ve 250.000 hücreleri (topluluklar) veya 50.000 hücreleri (saf kültürler) hücre kapısı içinde tespit edilir kadar 3.000 olaylar s^-1 maksimum hızda ölçmek.
         Not: Bu hücre sayımları örnek setleri ile deneyim dayalı seçilir. Farklı numaraları ölçüm verimlilik ve düşük bereket subcommunities her iki yönde algılama arasında tradeoff kaydırmak için kullanılır.
         Sorun giderme: Ani Intra-ölçüm boncuk vardiya ve hücre konumu meme içinde hapsolmuş hava kabarcıkları neden olabilir. Bu kaldırma ve meme ve kılıf arabellek sıvı sistemiyle durulama temizleme gerektirir. Araç meme (başlangıç ile adım 3.1.2) remounting sonra ayarlamalara gidilmesi gerekiyor.
      6. Backflush kılıf arabellek kapatma ve örnekleri geçiş önce iyice aletle.
2. Biyogaz topluluk
   1. Enstrüman, lazer, bilgisayar ve yazılım örnek analiz için hazırlamak için başlatmak.
      1. Backflush en az 6 mL kılıf arabelleği (bi distile H₂O) boru ve örnek bağlantı noktasına araç yazılım "kılıf sıvı Başbakan" işlevini kullanarak gevşek bağlı bir tüp yoluyla.
      2. Bi distile H₂O 200'den daha az olayları s^-1 algılanır kadar 0.5 µL s^-1normal akış hızı sıvı sistemi durulama 5 µL s^-1 adlı ölçmek.
   2. Sistemi kalibre.
      1. Boncuk mix (0.5 mikron ve 1 mikron mavi floresan) hazırlayın. Sulandırmak boncuk süspansiyon eşit konsantrasyonları elde etmek için orijinal stok çözümleri.
      2. Sürekli olarak günlük₄ aralığı boncuk karışımda ölçmek ve akış küvet ve Lazer optik pozisyonlar işleyerek boncuk doruklarına kendi önceden belirlenmiş kalibrasyon şablonuna uygun. PMTs boncuk konumunu kazanç ayarı ile son ayarlamalar.
   3. Biyolojik standart ile kalibrasyon kontrol 3.1.3. adımda anlatıldığı gibi.
   4. Örnek alma.
      1. PBS 1.600 µL lekeli örneğinin 400 µL sulandırmak, ölç ve konsantrasyon testi gerçekleştirmek için olay sayısı izlemek.
         Not: Ayarlanan seyreltme oranları diğer örnek kaynağı için gerekli olabilir. Olay sayısı 1200 olaylar s^-1 ileri dağılım (negatif örnekte ek dosya 1-S2) çözünürlük kaybını önlemek için parçacık zengin örneklerinde aşmaması gerekir. Saf kültürler ilâ 2,000 olaylar s^-1ile ölçülebilir.
      2. Bir hücre kapısı bu ilk deneme ölçümler sırasında araç yazılımında oluşturun. Bu kapıyı lekeli hücre içeriyor ve gürültü ve boncuk dahil değildir.
      3. En fazla 1200 toplam olayları s^-1 çalıştırmak ve boncuk karışımı enstrüman istikrar izlemek ve bir retrospektif kalibrasyon denetimi için imkanı sağlamak için örnek eklemek için toplama test sonuçlarına göre örnek sulandırmak. Örnekleri 1.000 ve 2500 olayları her iki boncuk Gates arasında yer almalıdır.
      4. Mix ve 250.000 hücreleri (topluluklar) veya 50.000 hücreleri (saf kültürler) hücre kapısı içinde tespit edilir kadar örnek ölçmek.
      5. Bi distile H₂O iyice aletle kapatma ve anahtarlama örnekleri önce yıkayın.

4. hücre sıralama

Not: yordam sıralama hücre ek araç ayarlamak gerektirir ve yayımlanmış protokolleri¹²göre gerçekleştirilir.

1. Başlamak yukarıya ve adımları 3.1.1-3.1.3 içinde açıklandığı gibi araç kalibre 0.5 x çalışan çözüm kılıf arabelleği kullanır
2. Damlacık sonu kapalı bulmak için DD genlik ve DD sıklığı ayarlayın.
3. Saptırma plakaları monte, bedelini de fatura ve 2 veya 4-yönlü için sıralama modu karar.
4. İç damla gecikme kalibrasyon 2 ile gerçekleştirmek mikron sarı-yeşil boncuk bir parçacık veya hücre sorgulama seyahat alır zaman aralığını tanımlamak için akışına bağlı son damlasına (lazer sayısı hücre) üzerine gelin.
5. 6 kere 20 boncuk cam slayt üzerindeki sıralamak ve bunları bırakma gecikme kalibrasyon doğrulamak için mikroskop ile kabul.
6. Sıralama kapısı şablon hazırlamak.
7. Kullanım "tek ve bir bırak modu: en yüksek saflık % 99" olaylar s^-1 -en fazla 4 gates 500.000 hücrelerde bir defada (4 yönlü sıralama modu) sıralamak için toplam 2.500 değil daha yüksek bir hızda.
8. Hücreleri Santrifüjü tarafından (20.000 x g, 6 ° C, 25 dk) hasat ve Pelet daha sonra DNA izolasyon ve sıralama için-20 ° C'de dondurmak.
   Not: gates ile % 5 daha az hücrelerde sıralama kaçının sıralama süre olarak göreli bereket için göreli bolluk ters orantılı. Tek tek adımları hücre sıralayıcısı kılavuzunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Gerekli hücre sayıları ağır ilgili kullanım durumları ve çıkarma protokolleri üzerinde bağlıdır. Çok sayıda Yöntem uygulandı: ddPCR (1.000 hücrelerin^17,19), 16S rDNA veya mcrA amplicon sıralama (500.000 hücreleri^6,10,15) ve proteomik (en çok 10⁷ hücreleri ^{x 1.1 16,17}). Hücre sıralama sıralanmış subcommunities daha düşük çeşitlilik nedeniyle bir metagenomics yaklaşımla birlikte özellikle yararlı olacaktır.
   Uyarı: yüksek voltaj nedeniyle sıralama işlemi sırasında yansıtıcı plakaları dokunmayın.

5. veri analizi

Not: "Akış sitometresi standart".fcs veri dosyaları genellikle tek tip veri yapısı ile sitometrik ölçüm verir. Ancak, farklı sitometresi üreticileri biraz adapte sürümlerini kullanan ve büyük aletleri son FCS standart 3.1 2010 giriş gelmek. Bu piyasaya çıkarma, hangi farklı enstrümanlar ile toplanan sonuçları doğrudan karşılaştırma önlemek ölçekleme nokta Arsa yol açabilir. Ancak, tek tek veri noktalarını her zaman belgili tanımlık anılan sıraya göre dağılım ve floresan yoğunluk değerleri farklı sütunlar ile bir matris satır depolanır. Sunulan microbiome analiz boru hatları belirgin hücre boyutu ve DNA içeriği mikrobiyal subcommunities açıklamak için kullanın. Bu parametreler için FSC ve DAPI floresans kanal yoğunluklarını correlated (hücre sıralayıcısı: FL-4, analyzer: FL-1) ve sonuç iki boyutlu FSC DAPI floresans araziler içinde görüntülenir zaman subcommunity kümeler halinde. Bu nokta araziler yorumu ve akış sitometresi veri çözümlemesi sağlar ve genellikle logaritmik olarak ölçeklenir. Onlar özel sitometresi yazılım veya üçüncü taraf çözümleri kullanarak .fcs dosyalarından görüntülenebilir ve otomatik (sitometrik çubuk grafik görüntü karşılaştırma, şık) temel ve yarı otomatik (sitometrik barkodlama, CyBar) topluluk analiz.

1. Sitometrik çubuk grafik görüntü karşılaştırma
   Not: Kod, ayrıntılı belgeler ve bu paket için el http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html kullanılabilir. Onlar da yayınlanan²⁰olmuştur.
   1. Yükleme ve R paketi yüklemek, .fcs dosyalarını içeren çalışma dizini ayarlayın ve yürütmek yoluyla dosya liste oluşturma:
      > kaynak ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Çalışma dizinini FCS dosyalarınızı konumlandırıldığı yolunu ayarla
      > # Yolu tırnak işaretleri yazın
      > setwd("")
      > # Almak a liste-in senin çalışma dizininde bulunan FCS dosyalarındaki dosya adlarını
      > dosyaları <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Almak a liste-in FCS dosyaları pakete dahil dosya adlarını
      > dosyaları <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + tam = TRUE, desen = "*.fcs")
      > # FlowFrame olarak ilk FCS Dosya okumak
      > Çerçeve < - okundu. FCS(Files[1],alter.Names=true,Transformation=false)
      > # Parametre/Kanal adlarının bir listesini almak
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. "Fcs_to_img" paket işlevi yürütmek yoluyla sitometrik ham veri için görüntüleri oluşturun:
      > # Oluşturmak varsayılan parametreleri kullanarak çubuk grafik görüntüleri
      > fcs_to_img(files)
   3. "İmg_sub" paket işlevi yürütmek yoluyla çubuk grafik görüntülerin alt kümelerini tanımlayın:
      > # Görüntü alt kümeleri varsayılan parametrelerini kullanarak histogram oluşturma
      > img_sub (dosyaları, ch1 "FS. = Log",ch2="fl.4.log")
   4. "Calculate_overlaps_xor" paket işlevi yürütmek yoluyla görüntü analizi yapmak için örtüşme ve XOR değerleri hesaplamak:
      > # Kurtarmak tüm alt görüntülerin adları liste olarak
      > alt kümeleri <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Hesaplamak örtüşme ve XOR görüntüleri ve değerleri için iki yeni dosyaları yazmak
      > sonuçları <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Sigara-ölçüm çok boyutlu ölçekleme (NMDS) "plot_nmds" paket işlevi yürütmek yoluyla benzerlik analizi için arsalar oluşturun:
      > # NMDS çizim örnekleri göster
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. Sitometrik tedarikçilerden
   Not: Kod, ayrıntılı belgeler ve bu paket için el http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html kullanılabilir. Onlar da yayımlanmış^11,12olmuştur.
   1. Ana kapısı şablon olarak kullanmak tüm örnekleri üzerinde geliştirmek.
      1. .Fcs dosyaları sürükle ve bırak işlevselliği kullanarak analiz yazılımı yükleyin.
      2. Çift tıklayın bir ölçüm ve x ve y ekseni parametreleri FSC vs DAPI floresans Arsa açmak için ilgili açılan listelerden seçin.
      3. Adım 3.1.4.5 ve 3.2.4.4 analiz hücreleri kontrol etmek ve buna göre adı daha önce kullanılan hücre kapısı oluşturmak için çokgen çizme aracı kullanılır. Hücre kapısı giriş örnek listesinde bu havuz için tüm örnekleri grubunun sürükleyin.
      4. Çift tıklatın hücre kapısı ve hücre kapısı olaylar görselleştirmek için eksen atama düzeltin.
      5. Örnek küme yaygın subcommunities¹² yayımlanan yönergeleri takip eliptik gates aracıyla tanımlayabilir ve SSC veya başka bir üçüncü parametre²¹ tarama kapısı şablon bütünlüğünü sağlamak için kullanabilirsiniz. Havuz, kontrol ve diğer örnekleri subcommunity tahsisatına ayarlayın.
   2. Göreli subcommunity zenginliği R komut dosyasında kullanmak için bir .txt dosyasına verin.
      1. Tablo Düzenleyicisi ile düzenleme sekmesini açın.
      2. Her subcommunity 5.2.1.5 adımda tanımlanan ve "üst frekans" çıkış istatistiği ayarlamak için sütun ekleyin ve onları adını.
      3. "Tablo Düzenleyicisi" tabloda kaydetme biçimi ve hedef seçtikten sonra oluşturun.
         Not: Analiz yazılımı doğrudan göreli subcommunity zenginliği sağlar. Onlar da bireysel subcommunity kapısında olay sayısı hücre kapısında olay sayısı tarafından bölünmesi yoluyla elde edilebilir. Değerler herhangi bir geçersiz alanlar içeremez ve R kodu (bkz: el ile ve belirli yönergeleri SSS) tarafından okunması gereken bazı ek gereksinimleri karşılaması gereken bir .txt dosyasında bir sekme sınırlı matris kurtarmana gerek.
   3. Yüklemek ve R paketi yüklemek ve yürütmek yoluyla verileri yüklenemedi:
      > kaynak ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Yolu tırnak işaretleri yazın
      > setwd("")
      > # Yük veri kümesi
      > data(Cell_number_sample)
      > # Verilerini göster
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. Göreli zenginliği "normalleştirme" paket işlevi yürütmek yoluyla normalize:
      # Verileri normalleştirmek, 2 basamak Yazdır
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. "Cybar_plot" paket işlevi yürütmek yoluyla normalleştirilmiş bir bar kod ve özgün göreli zenginliği bir kutu çizimi oluşturun:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Varsayılan parametreleri ile Arsa
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Özgün göreli zenginliği bir NMDS Arsa oluşturun.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMDS Arsa normalleştirilmiş cel sayıların
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Normalleştirilmiş göreli zenginliği ve diğer parametreleri korelasyon analizi "ilişki" paket işlevi yürütmek yoluyla oluşturun:
      > # Yük veri kümesi
      > data(Corr_data_sample)
      > # Korelasyon değerleri göster
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Çalıştır korelasyon analizi
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Not: Şık ve CyBar göreli zenginliği güveniyor. Ancak, akış sitometresi biyoteknolojik uygulamalar için büyük ilgi olabilir mutlak hücre sayıları öğeleri de belirleyebilirsiniz. Mutlak hücre numarasını belirlemek için faiz kapısı hücre sayısı analiz örnek hacmine göre ayrılmıştır. Analiz numune hacmi boncuk süspansiyon içine örnek (ek dosya 1-S7 formülde) bilinen bir konsantrasyon ile ekleyerek belirlenebilir. Tezgah üst analyzer ayrıca doğrudan örnek tüp hacmindeki ölçüm sırasında quantifies gerçek bir hacimsel sayım özelliği ile donatılmıştır. Bu bir SYBR yeşil ben hücre sayımı için protokol boyama kullanmak için tavsiye edilir.

Results

Aşağıdaki temsilcisi sonuçlar çoğaltır gerekliliğini vurgulamak ve farklı veri görselleştirme ve analiz teknikleri her biri bu üç örnek Grup örnekler. Olası veri değerlendirme boru hatları sonuçlarını ilgili kümesi hakkında standart araştırma soruları yanıtlayan için uygun gösteriyorlar. Ancak, sunulan teknikleri ile sunulan örnek ayarlamak için özel değildir. Akış Sitometresi ham veri FlowRepository kimliği FR-FCM-ZY46 ile herkesin hazır hale getirilmiştir. Daha önce yüklenen ASC veri kimliği FR-FCM-ZYD7 altında kullanılabilir.

Biyolojik ve teknik çoğaltır alınan, kurumlara ve yayımlanmış protokolleri¹¹göre analiz. PC ve ASC biyolojik çoğaltır üç paralel şişeler alınmıştır. Biyolojik çoğaltır, MÖ bir pilot ölçek bitki bir yerde üç sonraki örnekleme olarak alınmıştır. Üç aliquots bir örnek sabit, lekeli ve teknik tekrarlanabilirlik emin olmak için analiz. Yöntemleri tekrarlanabilirlik daha önce yayımlanmış yordamlar¹¹göre değerlendirildi. Bir kapı şablonu bir örnek kümesi (ek dosya 1-S6) tüm örnekleri için kapı başına standart sapma (%) hesaplamak için kullanıldı.

Ortalama standart sapma %2.13 (Şekil 1) iken PC için göreli bereket maksimum standart sapması %3.44, oldu. Ortalamalar, standart sapmalar ve %2.13 %0,21 (ek dosya 1-S8) ASC ve BC için göreli zenginliği maksimum standart sapmalar %1,27 ve %0,88, bulunmuştur.

Standart bir prosedür, saf suşu kültür, soruşturma zaman lag faz, üretimi süreleri ve hücre yoğunluğu belirli koşullar altında analiz etmek için bir büyüme eğrisi hazırlıktır. Bu yordamı ile akış sitometrik analiz iş akışı sistemi (Şekil 2) daha derin bir anlayış elde etmek için birlikte. FSC vs DAPI floresans araziler toplu iş kültürünün farklı noktalarda kültür hücre döngüsü durumları ortaya koyuyor. Ana kapısı şablonu (ek dosya 1-S6) bir (c1n), hücre oranı ölçmek için kurulan iki (c2n) ve birden fazla kromozom (cXn, Şekil 2B

Discussion

Mikrobiyal nüfus ve toplulukların başarılı bir analizini iyi ayarlanmış cytometers, hücre parametreleri uygun bir seçim ve örnekleme ve fiksasyon ölçüm ve veri değerlendirme doğru güvenilir bir iş akışı gerektirir. Seçili hücre parametreler kullanılabilir uyarma dalgaboyu ile eşi gerekir. Biz kullanmak ve çok düşük konsantrasyonlarda hassas DAPI öneririz; Ama bir UV-hangi genellikle standart sitometresi set-up oluşur değil lazer, heyecanlı gerekiyor. Diğer boya, SYBR gibi yeşil ben, aynı zamanda leke bütün nüfus veya topluluklar ama genellikle düşük kaliteli çözümler sunmak. Balık yordamlar veya canlılık testleri mikrobiyal topluluklarda kullanma önerilmez. Bu yaklaşımlar ölçmek, doğrulamak ve toplumda bireysel türler üzerindeki etkileri belirsiz olduğundan denetlemek imkansız. Tipik topluluklar önemli bir kısmı hala saf bir kültür olarak kullanılabilir olduğu sürece onlar güvenilir, sınanamıyor.

Kritik adımlar protokolündeki hücre sıralama yanı sıra, örnekleme ve fiksasyon yordamlar içerir. Örnekleme eğilimi bazı saf kültürler ve flocs için toplamak veya örnek matris parçacıklar için uygun mikrobiyal topluluklar tarafından karmaşık. Bu toplamları dağılımı ve güvenilir sonuçlar güvence altına almak için akış sitometrik çözümlemesi için giriş önce ayrı bir hücreler için gereklidir. Sunulan hazırlık protokolleri tek hücre Analizi etkinleştirmek için optimize. Son 50 µm filtrasyon daha önce herhangi bir kalıntı toplamları kaldırmak ve hücre sıralayıcısı 70 µm meme ve akış küvet Çözümleyicisinin tıkanma dan engellemek için ölçüm gerçekleştirilir. Hücre flocs gelen Atıksu arıtma tesisleri özellikle bol, sağlam ve sisteminin işlevi için çok önemli. Biz planktonik araştırdık ve çamur oluşturulmuş protokol test etmek için bir tam ölçekli Atıksu arıtma tesisi farklı tankları mikrobiyal topluluklarda dayalı. Toplamları açıkça harcanmış hücre şekillendirme çamur ve topluluk kompozisyon sabit kalmıştır. Ayrıca, planktonik ve çamur tabanlı toplulukların aralarındaki tüm üç örneklenen tank (Şekil 8, ek dosya 1-S10) olağanüstü benzerlik sergiledi. Bu sonuçlar bir formaldehit ve etanol fiksasyonlu karşılaştırmalı 16S rDNA amplicon sıralama, bir taze-, bir formaldehit tedavi-, tarafından doğrulanmadı-ve sıralanmış örnek¹⁰. Yine de, olağanüstü güçlü biyofilmler veya sıkıca bağlı zincirler içinde büyüyen bakteriler gibi çevre örnekleri zorlu dağıtmak mümkün olabilir. Her yerde parçacıklar histogram içinde görünür ve hücreleri tarafından dik bereket karanlık gibi toprak örnekleri özellikle sorunlu olabilir. Bu gibi durumlarda, geleneksel sıralama yöntemleri uygulanması gereken.

Her yeni örnek kümesi fiksasyon istikrar sonucu geçerliliği garanti için deney tasarlamadan önce test edilmelidir. İyi fiksasyon istikrar da havuza alınan boyama ve birden çok örnek zaman puan ölçümü tek bir günde sağlar. Ayrıca çoğaltma ölçümleri ve geriye dönük olarak hücre belirleyici zaman noktaları sonuç ve denemenin son değerlendirme sonra sıralama sağlar. Saf kültür fiksasyon kararlılığını 28 gün içinde (Şekil 9) doğrulandı. Örnek taşıma dahil olmak üzere yerinde deneyler için fiksasyon istikrar (Bu durumda, aktif çamur topluluk için 60 gün Biyogaz toplum, ek dosya 1-S9 için 195 gün) daha uzun süre üzerinde test edilmelidir.

Boyama genellikle sorunlu değil ama bioinformatic değerlendirme araçları izin vermek için biyolojik bir standart ile kontrol gerekmektedir. Biz sahte zorlanma E. coli BL21 kullanılan (DE3), hangi ASC protokole göre saplantısı ve boyama her toplu olarak kullanılmak üzere depolanmış.

DAPI, SYBR yeşil dışında ben başarılı bir şekilde birkaç yıl^{14,23,24,25,26}mikrobiyal topluluklar gidermek için uygulanmıştır. SYBR yüksek ve düşük nükleik asit alt kümeleri (HNA ve LNA) topluluklar çözmek yeşil bir online modus canlı hücrelerde kullanma. DAPI, DNA için onun bağlamada daha belirlidir ve 50'den fazla subcommunities bir örnek küme ayrım sağlar ancak boyama önce bir fiksasyon adım gerektirir.

Hücre sıralama bu yaklaşımın dikkat çekici bir özelliği ve bazı subcommunities daha fazla ilgi varsa uygulanabilir. Bu ne PFA-(sadece 30 dk yapılır) ne de etanol tedavi veya¹⁰ boyama DAPI sonraki 16S amplicon sıralama üzerinde olumsuz bir etkisi olduğunu vurguladı gerekiyor. Potansiyel fiksasyonu etkiler ve subcommunity metagenome ilgili yordamlar boyama analizleri hala test edilmesi gerekir.

Topluluk işlevlerine ve eğilim dinamikleri hakkında bilgi bir sürü bağımsız sıralama yaklaşım toplumun özellikleri sanal bir hücre hücre düzeyinde çözümlemek ve bu özellikleri ile abiyotik bağlanmak Biyoinformatik araçlarını içeren ne zaman elde edilebilir parametreleri.

Son zamanlarda, bir dizi yeni Biyoinformatik değerlendirme aracı, her iki SYBR için tüm yararlı yeşil ben ve DAPI yaklaşımlar, sitometrik topluluk desenleri gidermek için geliştirilmiştir. Bunlar FlowFP²⁷, paketleri bu çalışmada (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), tatlı su topluluklar²⁹ ile kurulan bir deconvolution model ve suşların kendi fizyolojik göre ayrımcılık için kullanılan bir araç kullanılan özellikleri³⁰. Ayrıca, sitometrik çeşitlilik kararlı²⁵ olabilir ve mikrobiyal topluluklar hatta istikrar özelliklerini şimdi bir çevrimiçi araç¹⁰ile takip edilebilir.

Böylece, akış sitometrik analizleri mikrobiyal topluluklar ve olası abiyotik parametre korelasyon hızlı değerlendirilmesi konusunda büyük bir avantaj var. Ancak, hala yöntemine sınırlamalar vardır. Gerçekten online flowCyBar aracıyla nedeniyle deneyimli tabanlı kapı ayarı yordam uygulanamaz. Ayrıca, özel yapım, kullanımı kolay akışı cytometers gelişimi büyük ölçüde akış sitometrik microbiome analiz yaklaşımı yayılması ilerlemek. Bu yönde ilk adım üstlenmiş²⁸vardır.

Mikrobiyal akış sitometresi gelecekteki uygulamalar mikrobiyal ekoloji, bakteri üretimi kez aralığında yüksek frekans izleme sağlar ve ekolojik paradigmalar sitometrik veri^{5 tabidir gösterilmiştir gibi öngörülen ,10}. İsviçre³¹yılında zorunlu içme suyu denetimleri gibi doğal ortamlarının rutin izlemek için çok yararlı bir yöntemdir. Bu da insan¹⁵ veya hayvan³² microbiome tarama gibi tıbbi uygulamalar için değerli bir araç olabilir. Buna ek olarak, biyoinformatik son gelişmeleri işlem denetimleri, yönetilen mikrobiyal sistemlerinin ayrılmaz bir sensör olmak mikrobiyal akış sitometresi sağlayabilir. Mikrobiyal topluluk sitometresi da belirli topluluk alt kümeleri genomik araştırmalar daha yüksek çözünürlük sağlayan hücre sıralama, bir tarama aracı sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milli-Q sistemi Sentez A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltrasyon Kartuşu	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
MoFlo Eski hücre sıralayıcı	Beckman-Coulter, Brea, California (ABD)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (ABD)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, Kaliforniya, ABD		355 nm, 150 mW
Fotoçoğaltıcı tüpler R928 ve R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonya)
Summit 4.3 yazılımı	Beckman-Coulter, Brea, Kaliforniya (ABD)
1 & mikro; m  FluoSpheres	Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)	F8815	350/440 mavi floresan
2 & mu; m YG FluoSpheres	Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)	F-8827	505/515 sarı-yeşil floresan boncuklar
0.5 ve mu; m Floresbrit BB Karboksilat mikroküreler	PolyScience, Niles, Illinois (ABD)	18339	360/407
1 & mu; m Floresbrit BB Karboksilat mikroküreler	PolyScience, Niles, Illinois (ABD)	17458	360/407 mavi floresan
1 ve mikro; mYG FluoSpheres	Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)	F-13081	505/515 sarı-yeşil floresan boncuklar
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)	CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japonya)
UV Laser Genesis CX,	Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)		355 nm, 150 mW
H6779-32 serisi PMT'ler	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonya)
FloMax yazılımı	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
tüm optik filtreler	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (ABD)		Yapı numarası: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html