Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

10.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58041

⸱

3 Ağustos 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

Bu makalede

Özet

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Özet

Nörodejeneratif hastalıklar yükselen ve yaygınlığı ile giderek nöronal fonksiyon bozukluğu ve kaybına yol açan temel patofizyolojisi anlamak önemlidir. Henüz hala bir ihtiyaç için çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar floresans tabanlı görüntüleme araçları ve teknolojileri hücre altı nörobiyolojik süreçleri, benzeri görülmemiş analizini etkinleştirmek . Biz ateş Drosophila modelleri kullanarak floresans tabanlı görüntüleme çalışmaları sayısal veri ayıklamak için basit ve uyarlanabilir bir iş akışı geliştirdik. Özellikle, biz iki hücresel süreçler analiz etmek için Fiji/ImageJ kullanarak takip etmek kolay, yarı otomatik bir yaklaşımı açıklamak: ilk olarak, protein toplama içeriği ve profil Drosophila optik mutant floresan öğesini kullanarak lob ölçmek huntingtin proteinleri; ve ikincisi, Drosophila görsel sisteminde autophagy ratiometric tabanlı miktar bir tandem floresan gazeteci ile autophagy-lysosome akı değerlendirmek. Önemlisi, burada özetlenen iletişim kuralı tüm floresan yapıları seçim önyargı en aza indirmek için ve ince karşılaştırma çözünürlüğünü artırmak için analiz edilir emin olmak için bir yarı otomatik bölümleme adım içerir. Bu yaklaşım diğer hücre biyolojik yapıları analiz için uzatılabilir ve süreçleri de gibi membran bağlı bölmeleri içinde ateş, proteinaceous puncta (stres granül ve sinaptik kompleksleri), gibi karıştığı (mitokondri ve membran kaçakçılığı veziküller). Bu yöntem uyarlanabilir görüntü analizi ve miktar ve başvuru noktası ve güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik alanın karşısındaki kolaylaştırmak, sonuçta ateş mekanik anlayışı geliştirmek henüz standart, sağlar.

Giriş

Nörodejeneratif hastalıklar her yıl milyonlarca insan etkiler ve bir yaşlanma nüfus1ile görülme sıklığı artmaktadır. Her nörodejeneratif hastalık benzersiz bir etiyoloji olsa da, toplama misfolded proteinlerin ve proteostasis ağ arıza bu hastalıkların çoğunun ortak patolojik işaretlerinden vardır. Nasıl bu temel ve birbiriyle ilişkili işlemler bozulma goes awry elucidating nöronal fonksiyon bozukluğu ve hücre ölümüne katkıda nörodejeneratif hastalıkları anlamak için hem de tedavi müdahaleler rehberlik çok önemlidir. Floresans tabanlı görüntüleme nöronlar karmaşık ve dinamik bu işlemlerde incelenmesi için izin verir ve büyük ölçüde nöronal hücre biyoloji anlayışımız katkıda bulunmuştur. Özellikle deneyler vivo içindeson derece kompakt doku, farklı hücre tipleri ve morfolojik heterojenite nedeniyle dışarı taşırlarken analiz fluorescently tagged proteinlerin zordur. El ile destekli miktar uygun fiyatlı ve basit, ama genellikle zaman alıcı ve tabi insan önyargı. Bu nedenle, çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar için bir ihtiyaç vardır.

Biz Fiji/ImageJ, güçlü ve serbestçe erişilebilir görüntü işleme yazılımı2,3, deneysel modelleri floresans görüntüleme çalışmaları nicel veri ayıklamak için kullanan basit ve uyarlanabilir bir iş akışı belirttiğimiz Drosophilakullanma ateş. Protein toplama ve autophagic akı ölçmek için bu iletişim kurallarını izleyerek — iki nörodejeneratif hastalık patolojiye son derece alakalı biyolojik özellikleri hücre — hassasiyet ve tekrarlanabilirlik bu yaklaşımın gösterdi. Drosophila optik lob fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) proteinlerin çözümleme sayısı, boyutu ve yoğunluğu protein toplamları ortaya. Tandem floresan muhabir autophagic akı compartmental çevre4bağlı olarak farklı emisyon sinyallerini görüntüler Drosophila görsel sistemi içinde görüntülenir. Ratiometric tabanlı analiz tandem muhabir autophagosome oluşumu, olgunlaşma ve taşıma autophagy-lysosome akı lysosome bozulması için nicel ve kapsamlı bir görünümünü için izin ve ayrıca savunmasız vurgulanmış nörodejeneratif koşullarda kesintiye bölmeleri. Önemlisi, biz bilinçsiz önyargı en aza indirmek için bizim protokolünde yarı otomatik eşik ve segmentasyon adımları hayata her iki analizlerde örnekleme gücünü artırmak ve benzer çalışmalar arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için bir standart sağlamak. Basit iş akışı güçlü Fiji/ImageJ eklentileri (matematik algoritmalarına dayalı bilgisayar mühendisleri tarafından geliştirilen) yapmak için tasarlanmıştır daha neurobiologists ve geniş yaşam bilimleri topluluğu için erişilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. dikkat edilmesi gereken noktalar ve görüntü analiz deney tasarımı için hazırlıklar

  1. Örneğin 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membran işaretleri, yerelleştirilmiş floresan kazanmakla uygun anatomik, cep veya farklı örnekler üzerindeki bir bölge (ROI) ilgi standartlaştırılması için simge olarak hizmet için hücre altı işaretleyicileri protein, vb
  2. Ayrık puncta faiz yapısı için arka plan düzeyleri ötesinde sınırlandırabilirsiniz bir floresan işaretleyiciyi seçin.
    Not: Bu protokol proteinaceous yapıları (Örneğin, misfolded protein toplamları) ve membran bağlı organelleri (Örneğin, autophagy muhabir) için optimize edilmiştir. Protein toplama görselleştirmek için kullanılan5insan Htt proteini bir RFP öğesini N-terminal parçası 138 yineler (RFP-hHttQ138) bir patojen polyQ yolu ile yapıldı. Mutant Htt protein elav GAL45,6gibi nöronal belirli sürücüleri altında ifade sitoplazmik toplamları oluşturur. Aktin-GAL4 autophagosome-lysosome akı görselleştirmek için ubiquitously ifade bir tandem mCherry-GFP-Atg8a muhabir sürücü için kullanıldı. mCherry ve GFP pozitif puncta gösterir autophagosomes ve GFP floresans bozulmuş7proteindir kadar nerede asit-duyarlı mCherry kalır lysosome, asidik ortamda söndürülür gibi akı izlenir. Ratiometric analiz için tutarlı bir belirtecidir yapısı tek bir kanal bölümleme için kullanılan, veya yine de açıkça açıklanan bu protokol için uygunsa, iki veya daha fazla kanalı bir projeksiyon yapıları, betimlemek için kullanılabilir. Örneğin, asit-duyarlı ve akı ile yol boyunca yerde kalacaktır gibi mCherry Atg8 pozitif parçacıklar, bölümleme için kullanılır.
  3. Açık kaynak görüntü analiz platformu ImageJ veya Fiji karşıdan yükleyip — eklentileri2,3ImageJ ile tercih edilen dağıtım birlikte.
  4. H-maxima etkileşimli dönüm noktası için eklenti.
    Not: Fiji bu iletişim kuralını kullanır; ek eklentileri ImageJ için gerekli olabilir. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG için tarafından geliştirilen eklenti kullanılabilir çevrimiçi (https://imagej.net/Interactive_Watershed) olur.
  5. Gidin "yardım | Güncelleştirmek", seçmek"Yönet güncelleştirme siteleri""ImageJ Güncelleyici"dan SCF-MPI-CBG update sitesini listeden seçin ve sonra kapatın ve Fiji yeniden başlatın.

2. beyin diseksiyon ve ayirt boyama

  1. Silikon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri yapmak.
    1. Silikon elastomer bileşenleri bir ölçek üretici ve iyice karışık kadar heyecan tarafından belirtildiği şekilde dökün.
    2. 5 cm doldurmak için bir pipet kullanın doku kültürü yemekleri üçte biri yarısına tam (yaklaşık 10 mL elastomer karışımı). Yüzeye çıkmak ve kağıt mendil ile yavaşça kaldırmak için herhangi bir baloncuklar izin. Bulaşıkları kapak ve 48-72 saat oda sıcaklığında (RT) tedavisi için düzey bir yüzeye koyun.
  2. Kopyalayabilmek Drosophila beyin ve gerekirse görsel sistem.
    1. Drosophila beyin diseksiyon yukarıda açıklanan8,9olarak gerçekleştirin. Diseksiyon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri, zarar verici doku veya forseps önlemek için beyin dengelemek için bir elastomer alt kullanarak gerçekleştirin.
    2. Lamina diseksiyon sırasında korumak için iki forseps retina altında slayt ve yavaşça retina kaldırmak için göz ortasından yırtıyorsun. Lamina yüzeyine paralel düzenlenen forseps ile lamina için bağlı retina herhangi bir doku uzağa çek.
      Not: Artık pigment aşağıdaki adımlarda yıkayın ve genellikle boyama ve görüntüleme antikor ile müdahale değil.
    3. Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (% 3.7 son bir konsantrasyon içinde 500 µL microcentrifuge tüp kullanmadan önce taze yapmak için PBS) içinde formaldehit % 37 oranında seyreltin. Microcentrifuge tüp düzeltme çözümü ile disseke beyin aktarmak ve hafif sallanan ile 15 dakika RT, kuluçkaya.
      Not: Formik asit üreten formaldehit okside doğal bir eğilim vardır. Bu nedenle, aliquot %37 formaldehit depolama için önerilen ve sulu taze her kullanımdan önce % 3.7 için. Aşırı fiksasyon veya altında fiksasyonu doku ve floresan10bütünlüğünü etkileyecektir.
    4. 3 kez ile PBTx yıkama (PBS % 0,4 ile Triton X-100) 15 dakika.
  3. İmmünhistokimya gerçekleştirmek ve numuneler monte edin.
    1. Antikor boyama gerekirse PBTx kaldırmak, birincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş eklemek ve gecede 4 ° C'de aliquot bir karıştırıcı üzerinde kuluçkaya
    2. Birincil antikor kaldırmak ve 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın. İkincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş ekleyin ve RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın.
    3. DAPI boyama gerekirse PBTx kaldırmak, DAPI çözüm eklemek (stok çözüm: 5 mg/mL, seyreltik bir çalışma konsantrasyonu PBTx 15 µg/ml) ve 10 dakika dik yıkama 15 dakika PBTx ile 3 kez kuluçkaya.
    4. Doku temizlemek için bir damla montaj orta mikroskobu slayt merkezi rondela açık teyp her iki tarafta bir tabaka ile üzerine yerleştirin. Beyin üzerine montaj orta damla aktarmak ve beyin saydam hale gelene kadar için 1-2 dakika bekleyin. Bir pipet ile montaj orta dikkatli bir şekilde çıkarın.
    5. Takmak için slayt üzerinde taze montaj orta beyin üzerine bir damla uygulanır. Dikkatle kabarcıklar kaçınarak bir cam kaplar. Kenarları kauçuk çimento ile mühür ve 20 dk. devam etmek için resim alma en iyi sonuç için RT kuruması.

3. resim alma

  1. Dahil olmak üzere uzamsal çözünürlük, amaç, zoom, tarama hızı, mikroskop satın alma parametrelerini optimize etmek ve boyutu görüntü analizi sırasında yarı otomatik bölümleme kolaylaştırmak için çözünürlük ilgi yapıların en üst düzeye çıkarmak için adım.
    Not: Bir örnek görüntü yakalama ve yarı otomatik bölümleme (içinde adım 5 Bu protokol) tüm deneysel örnekleri Imaging önce sınamak yararlı olabilir. Böylece analitik araçlar ilgi biyolojik yapısını kolayca ayırt edebilirsiniz bu şekilde Kullanıcı görüntüleme ayarlarını yapın.
  2. En yüksek sinyal gürültü oranı ve yüksek dinamik Aralık örnek yakalamak için görüntü algılayıcısı kontrolleri ayarlayın.
    1. Piksel Doygunluk (pozlama çok yüksek) veya (Şekil 3B, kırmızı bir Hi-Low LUT tarafından piksel doygunluk gösterir) ayarlarını yapma sırasında undersaturation (sapma çok düşük) gösterir bir LUT (tablo arama) kullanın.
    2. Deneysel manipülasyonlar olası faiz yapısı olarak kazanç ve mahsup hesabı ayarları tüm deneysel grupları için uygun olduğunu doğrulayın.
      Not: Aynı ayarları tüm gruplar için nicel karşılaştırma yapmak için kullanılır zorunludur.
  3. Tüm verileri elde etmek için doku görüntü.
    Not: Kullanılabilir verilerin tümünü bir görüntüleme oturumu sırasında yakalamak ve gerekirse 4. adımda ROI seçimi sırasında daha kesin bir alanını tanımlamak için önerilir.
  4. Edinme parametreleri ve kayma kalibrasyon gibi meta verileri korumak için düşsel bilgisayar yazılımı tarafından desteklenen dosya türü olarak kaydetmek. Görüntü deneysel Tarih, genetik arka plan ve floresan gazetecilere, antikorlar da dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin veya kanallara karşılık gelen boyalar taranan [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _Ch1. gibi [Fluorophore-hedef /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/dye], vb

4. Fiji/ImageJ görüntü alma ve yatırım getirisi seçimi

  1. Bir görüntüyü Fiji'de açın. "Bio-formatları içe aktarma seçenekleri" iletişim kutusu, seçmek "görünümü yığınıyla: Hyperstack" ve "renk modu: gri tonlama".
    Not: Bu kayma kalibrasyon Fiji okuyabilir gibi meta veriler olarak mikroskop dosya türünü açmak için tavsiye edilir.
  2. Bir alanı tek bir z uçağı veya standart bir yatırım getirisi örnekler arasında (Şekil 1, yatırım getirisi seçimi) kullanılabilir işaret kanal (lar) temel alan bir projeksiyon tanımlayın.
    1. 1.1. adımda belirlenmiş marker(s) yakalamak için kullanılan kanal (lar) görüntülemek için "C" kaydırma çubuğunu kullanın.
    2. Odak uçaklar taşımak için "Z" kaydırma çubuğunu kullanın. Tek bir dilim seçin veya birden çok dilim bir projeksiyon tıklatarak oluşturun "görüntü | Yığınlar | Z Projesi"ve set"Başlat dilim"ve"Stop dilim"ROI kapsayacak şekilde.
      Not: "projeksiyon türü ayarı" olsa bu tüm uygulamalar için uygun olmayabilir "Max şiddeti" "Z Projesi" iletişim kutusu genellikle en iyi yapıları için bölümleme Bölüm 5 ' daki vurgulamak için uygundur. Başka tür bir projeksiyon analizi için gerekliyse, kaydetmek ve bu nedenle Bölüm 6 ve/veya 7 özellik çıkarma için bu dosya belge için özen gösterin.
    3. Kanal (lar) ve görüntü analizi iletişim kuralı aşağıdaki adımları basitleştirmek ilgi odak plane(s) içeren yeni bir resim oluşturur. Seçin "görüntü | Yinelenen", istenen"Kanallar"(c) ve"Dilim"(z) ayarlayabilir ve değiştirebilirsiniz (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] [deneme date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]). seçiminizi yansıtmak için dosya adı
  3. Bir "seçim araçları" Fiji araç çubuğundaki el ile standart bir yatırım getirisi 4.2. adımda belirlenen seçim ölçütlerine dayanarak seçmek için kullanın.
  4. ROI ROI Yöneticisi'ne tıklayarak ekleme "Analyze | Araçlar | ROI Yöneticisi "ve"Ekle"ROI Yöneticisi menüsünde'ı tıklatın. ROI ROI Yöneticisi menüsünden tıklatarak kaydedin "daha | Kaydetmek"ve ROI yansıtmak için dosya adı (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ [z-plane(s)] _ [ROI Açıklama]).
    Not: Bu Fiji'de daha sonraki analizler için açılabilir veya diğer kanalları veya olduğu gibi Bölüm 5.3 görüntü uygulanabilir.

5. ön işleme ve segmentasyon h-maxima Watershedding ile

  1. Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanal ön işleme gerçekleştirin.
    1. Resim dosyasının birden çok kanal oluşuyorsa, tıklatarak kanalları ayırmak "görüntü | Renk | Kanalları Böl"kanal ilgi izole etmek.
    2. Gürültü veya tıklatarak düzeltme için Gauss Bulanıklığı azaltmak için bir Medyan filtresi gibi bir filtre uygula "süreci | Filtreler | "Filtre türü" (Örneğin, "Medyan filtresi" veya "Gaussian Blur").
      1. Farklı filtre tadın ve parametreleri imge--dan her deney grubu üzerinde filtre uygulayabilirsiniz. Adımda 6.2 bölümleme performansını kontrol etmek için her grup temsil edici bir örnek ile devam edin. Filtre ve segmentasyon ilgi yapıların kolaylaştırmak ayarlarını seçin.
    3. Filtre ve ayarları kaydedin. Bu parametreler deneysel grupları arasında geçerlidir.
    4. Başvuru için uygulanan filtre kapsayan bir TIFF dosyası olarak görüntünün bir kopyasını kaydedin. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile].
  2. Segmentasyon yapıları etkileşimli h-maxima dönüm noktası aracı ile ilgi oluşturulan ve 5.1. adımda kaydettiğiniz Önişlenmiş görüntü üzerinde gerçekleştirin.
    1. Fiji'de etkin Önişlenmiş görüntü ile h-maxima etkileşimli havza aracı tıklatarak başlatmak "SCF | Etiketleme | Etkileşimli H_Watershed".
      Not: Bu eklenti ilk dönüm noktası hesaplar ve yerel maxima ve segmentasyon bir anında Güncellenme Zamanı çıkış görüntü yoluyla eşik seçenekleri etkilerini araştırmak kullanıcının izin verir.
    2. Denetim Masası'ndan, tohum dinamikleri (s), yoğunluğu eşik (T) ve en yüksek (%) bölümleme optimize etmek için sel ayarlayın.
      Not: Her zaman raw resim bölümü el ile ilgi yapıların bölümleme performansını incelemek için 4.2 ön işleme önce bakın.
    3. Segmentasyon sonuçlardan memnun, "bölgeler maske ver"'i seçin ve "Dışa aktar" ı seçin. Bu dönüm noktası sonuçları (Şekil 1, bölümleme) ikili bir görüntüsünü oluşturur.
    4. Segmentasyon parametreleri kayıt; Bu parametreler nicel karşılaştırmalar için deneysel grupları genelinde uygulanması gereken. İkili sonuçlar maskesi için başvuru adı [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi ayrıntılı segmentasyon parametrelerle istenirse kaydeder [z-plane(s)] [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri].
  3. Faiz yapılarının havza sonuçlarından ayıklayın.
    1. Kaydedilmiş ROI adım 4.4, ROI Yöneticisi'nde açın. Adım 5.2.4'ten aktif ikili bölgeleri maskeyle ROI ROI Yöneticisi özellik çıkarma Standart yatırım getirisi için sınırlamak için resme uygulamak için seçin.
    2. Yatırım getirisi üzerinde ikili dönüm noktası maskesi etkin ile seçin "Analyze | Parçacıklar "Eklemek için Yöneticisi ile" özellikleri ayıklamak için iletişim kutusunda seçilen analiz".
      Not: Bu segment için yatırım getirisi Yöneticisi sırasında belirlenen her yapısı için bir parçacık tanımlayıcı ekler. Boyutu veya Analize dahil yapıları iyileştirmek için gerekirse Döngüsellik temel özellikleri dışlamak için bu menüdeki seçenekler kullanılabilir.
    3. Parçacıklar tıklayarak kaydetmek "daha | «««Kaydet"ROI Yöneticisi menüsünden. Tanımlayıcıları seçili ve tüm parçacıklar tek bir zip dosyasında kaydedilir sağlamak. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri] _ [yapıları].

6. miktarı, alan ve yoğunluk miktar ve analiz

  1. Oluşturulan ve 4.2. adımda kaydettiğiniz raw resim açın. Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanala ilerleyebilir.
    Not: Yoğunluk ölçümleri Ham görüntü (ön işleme önce) piksel değerlerini filtre adım 5.1 değişiklikleri uygulama olarak almak için önemlidir.
  2. Özellik çıkarma 5.3. adımda elde edilen parçacıklar açın ve "Tümünü göster" ROI Yöneticisi'nden seçin.
    Not: Bu eylem her parçacık "ROI Yöneticisi hakkında" görüntü üzerine bir taslağını yerleşimi ve ilgi (Şekil 1, özellik çıkarma) yapıları kenarları aynı olmalıdır.
  3. Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?".
    Not: Alan, yoğunluk ve parçacık yoğunluğu "alan" ve "entegre yoğunluk" seçerek ölçülebilir. Entegre yoğunluk seçildiğinde, Fiji iki değer üretecek: 'yoğunluğu entegre' hesaplanan alan ve ortalama gri değeri ve 'Ham yoğunluk piksel değerlerinin toplamı olarak ölçülen entegre' ürün olarak. Parçacıklar floresan protein yoğunluğu alanına göre bölünmüş piksel değerlerinin toplamı olarak hesaplanır. 5.3. adımda oluşturulan parçacıklar ROI 4.4. adımda tanımlanan doku içinde parçacıkların miktarı gösterir.
  4. "Ölçü" ROI Yöneticisi menüsünden seçin. Fiji'de görüntüleme yazılımdan türetilen dosya ölçümler alınır sürece sonuçları kalibre birimler cinsinden ifade edilir. Sonuçları sonuçları penceresinden kopyalayın ve derleme ve daha fazla hesaplamalar için elektronik tablo yazılımı içine yapıştırın.

7. Ratiometric miktar ve veri analizi

  1. 6.1 ve 6.2 parçacık tanımlayıcıları ilgi ilk ham kanal açmak için adımları izleyin.
  2. Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?".
    Not: Parçacık başına ortalama yoğunluğu "Demek gri değeri" seçerek ölçülebilir.
  3. ROI Yöneticisi'nden "Ölçü birimi" seçin. Sonuçları penceresinden veri kopyalama ve elektronik tablo yazılımı yapıştırın.
  4. "C" kaydırma çubuğu ilgi, GFP (Şekil 4A), bu örnekte ham ikinci kanala geçin ve adımları 7.2. ve 7.3.
    Not: 5.3. adımda kaydettiğiniz parçacıklar kanal ve dilim oluşturulan varsayılan olacaktır. Parçacıklar faiz doğru kanala uygulanır sağlamak için özen gösterin.
  5. Bir kanaldan yoğunluğu içinde elektronik tablo yazılımı her parçacık saniyeliğine yoğunluğu için oranını hesaplamak.
  6. Bir dağılım çizim görselleştirmek ve kişisel değişiklikler temel biyolojik süreçleri yansıtıcı sergi fluorophores ratiometric verileri ölçmek için kullanın.
    1. Bir dağılım çizim grafik yazılımı oluşturmak.
      Not: Her bir veri noktası burada ilk fluorophore ilgi yoğunluğunu "x değeri", ikinci fluorophore yoğunluğunu "her parçacık ölçülen y değeri" faiz yapısını temsil eder.
    2. Çeyrek dairelerin tanımlamak her fluorophore için eşikler çoğunluğuna ayarlayın.
  7. Fluorophore yoğunluğu faiz yapısı arasında görselleştirmek için satır profili kullanın.
    1. 5.3. adımda oluşturulan bir yatırım getirisi seçin ve yatırım getirisi ile düz bir çizgi çizmek için araç çubuğunda düz çizgi aracını kullanın. Hat yatırım getirisi yatırım getirisi Yöneticisi'ne ekleyin.
    2. Her kanal hattı aktif, yatırım getirisi ile ilgi için seçin "Analyze | «««Çıkart"profili.
      Not: Arsa profil işlev bir çubuk grafik arsa ve hat boyunca yoğunluk değerlerinin bir tablosu üretir. Her kanal ve hamur içine her iki kanal hattı boyunca gösterilen bir çizim oluşturmak için elektronik tablo yazılımı üzerinden ölçülen sonuçlar kopyalayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Miktar sayısını, alan ve fluorescently tagged mutant yoğunluğunu Htt Drosophila optik lobunda toplar.

Merkezi sinir sistemi misfolded protein toplamada Huntington hastalığı, RFP öğesini mutant bir Drosophila modeli araştırmak için bir patolojik olmayan (UAS-RFP-hHttQ15) ya da patolojik genişletme ( ile insan Htt UAS-RFP-hHttQ138) ve membran GFP (UAS-mCD8::GFP)11 a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada özetlenen Protokolü sağlam ve tekrarlanarak hücre biyolojik süreçlerin floresans tabanlı görüntüleme tarafından görüntülenmiştir quantitate için kullanılabilir. Biyolojik bağlam ve teknik sınırlamalar deneysel tasarım kılavuzunu dikkatle dikkate alınması gerekir. İlgi, hücre altı yapıları floresan işaretleri immunohistokimyasal, boya tabanlı veya genetik olarak ifade edilen, Morfoloji ve yoğunluğu tarafından arka plan üzerinde ayırt olmak gerekmediğini. UAS/GAL4 sistem hedeflenen gen ekspresyonu Droso...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Sheila ve David Fuente Nöropatik ağrı araştırma programı yüksek lisans bursu (için J.M.B.) tarafından desteklenmektedir, Lois Pope LIFE Fellows programı (CL, Y.Z. ve J.M.B. için) Snyder-Robinson Vakfı HGUGM Bursu (için CL), Dr. John T . Macdonald Vakfı (na CL), (için R.G.Z.), Ulusal Enstitüleri (NIH) sağlık HHSN268201300038C, R21GM119018 ve R56NS095893 gelen hibe sözleşmeleri ve Taishan bilim adamı projeye (Shandong Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti) (R.G.Z.) tarafından.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SYLGARD(R) 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning CorporationPF184250Diseksiyon çanağı
Falcon 35 mm TC ile İşlem Görmemiş Kolay Kavrama Stili Bakteriyolojik Petri KabıCorning351008Diseksiyon kabı
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-20Diseksiyon aleti
Sodyum KlorürSigmaS3014PBS çözeltisi
Sodyum Fosfat Dibazik SigmaS5136PBS çözeltisi
Potasyum Fosfat MonobazikSigmaP5655PBS çözeltisi
Triton  X-100SigmaT9284Yıkama ve antikor inkübaton solüsyonu.
%37 FormaldehitVWR10790-710Fiksasyon
Tek Kullanımlık Mikrosantrifüj Tüpleri (0.5mL, mavi)VWR89000-022Fiksasyon, yıkama ve antikor inkübatonu.
Düz ve Buzlu Mikro Slaytlar (25&kez; 75mm)VWR48312-004Konfokal görüntüleme için slaytlar
Mikro Kapaklı Camlar, dikdörtgen (22 kez; 40mm)VWR48393-172Konfokal görüntüleme için slaytlar
Kauçuk ÇimentoBalçık1051-AMontaj
VECTASHIELD Antifade Montaj OrtamıVektör Laboratuvarları, Inc.H-1000Montaj
Scotch Magic 810 Görünmez Bant (19mm ve kez; 25.4m)3M Şirketi810Normal
Keçi SerumuTermo Fisher BilimselPCN5000Antikor inkübaton
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)  Thermo Fisher ScientificD1306Nükleik asit boyama. 5 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için deiyonize suda çözün ve -80 ° C'de saklayın. 10-20 & mu'luk bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin; PBTx içinde g/mL.
3.5X-90X Stereo Zoom Muayene Endüstriyel MikroskopAmScopeSM-1BNZDiseksiyon kapsamı. 6W LED Çift Deveboynu Aydınlatıcı ile donatılmıştır
ImageJ/FijiNIHv1.51uSCF_MPI_CBG eklentileri ile (sürüm 1.1.2)
FV1000-IX81 Konfokal lazer Tarama MikroskobuOlympus
Rekombinant YapıBloomington Drosophila Stok MerkeziBL37749

Kaynaklar

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
  2. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671(2012).
  4. Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
  5. Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
  6. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
  7. DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
  8. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
  10. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
  12. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
  13. Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057(2015).
  14. Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887(2008).
  15. Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).
  16. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  17. Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
  18. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  19. Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
  20. Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
  21. Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
  22. Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
  23. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila NörodejenerasyonuFloresan GörüntülemeImageJ AnaliziProtein AgregatlarıOtofaji AkışıYarı Otomatik SegmentasyonOptik LobHuntingtin ProteiniAtg8 ReporteriFloresan Etiketleme
Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.