Yöntem makalesi

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

8.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

17 Temmuz 2018

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

Bu makalede

Özet

Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Bioassay-güdümlü ayırma Kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır yinelemeli bir yaklaşımdır. Bu yöntem başarılı alan nitelik özellikleri kimyasal sinyallerin Feromonlar hayvan türlerinin geniş bir alanda olarak bu işlev sonuçlandı. Deniz lampreys davranış ya da fizyolojik yanıt aracılık Feromonlar tespit etmek için koku alma üzerinde güveniyor. Biz bu bilgi balık biyoloji sözde Feromonlar işlevlerini yerine koymak ve Kılavuzu yalıtım ve etkin feromon bileşenleri tanımlaması için kullanın. Kromatografi ayıklamak, konsantre ve bileşikleri şartına sudan ayırmak için kullanılır. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları hangi kesirler koku yanıt-e doğru çıkarmak belirlemek için yapılmaktadır. İki seçenekli labirent davranış deneyleri daha sonra herhangi bir kokulu kesirler de davranışsal etkindir ve neden bir tercih belirlemek için kullanılır. Spektrometrik ve spektroskopik Yöntemler moleküler ağırlık ve yapısı aydınlatma ile yardımcı olacak yapısal bilgiler sağlar. Bioactivity saf bileşiklerin EOG ve davranışsal deneyleri ile doğrulanır. Labirent içinde gözlenen davranış yanıt sonuçta kendi işlevleriyle bir doğal akışı ayarı onaylamak için bir alan ortamda doğrulanması. Bu biyoanalizler 1) ayırma işlemi yol ve 2) onaylamak için ikili bir rol oynar ve daha fazla ayrılmış bileşenleri bioactivity tanımlamak. Burada, bioassay güdümlü ayırma yaklaşım yarar reaksiyonların bir deniz taşemen feromon kimlik temsilcisi sonuçları raporu. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması invaziv deniz taşemen Laurentian göller denetlemek için kabul seçenekler arasında bir modülasyon feromon iletişim sistemi olduğu için özellikle önemlidir. Bu yöntemi özellikleri geniş bir dizi iletişim kimyasal karakterize ve su bazlı kimyasal ekoloji ışık için kolayca adapte edilebilir.

Giriş

Feromonlar gıda kaynakları bulma, yırtıcı algılama ve conspecifics1sosyal etkileşimlerin arabuluculuk yardım bireyler tarafından yayımlanan belirli kimyasal sinyaller. Feromon iletişim böceklerde de okudu2olmuştur; Ancak, kimyasal kimlik ve suda yaşayan omurgalı Feromonlar biyolojik fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir değil. Kimlik bilgisine ve serbest Feromonlar fonksiyonu tehdit türlerin3,4 veya kontrol haşere türü5,6kurtarma kolaylaştırmak için uygulanır. Bu tekniklerin uygulama yalıtım ve karakterizasyonu biyoaktif feromon bileşenleri gerektirir.

Feromon kimlik doğal ürün Kimya bir dalıdır. Feromon araştırma sürüyor kısmen feromon moleküller kendilerini yapısı nedeniyle sınırlı olmuştur. Feromonlar çoğu kez kararsız ve küçük miktarlarda yılında yayımlanan ve uçucu7,8 , suda çözünen bileşikler9dakika miktarda algılamak için sadece birkaç örnekleme teknikleri adlı biri yok. Feromonlar tanımlamak için bir yaklaşım bilinen bileşikler, 2) metabolomics ve 3) bioassay-güdümlü ayırma hedeflenen 1) bir tarama içerir. A hedeflenen perde bilinen bileşikler ticari olarak mevcut metabolik yan ürünleri Feromonlar çalışması için olan fizyolojik süreçlerin sınar. Araştırmacılar sadece bilinir ve kullanılabilir bileşenler test edebilirsiniz çünkü bu yaklaşım sınırlayıcı olduğunu. Ancak, Japon balığı cinsiyet hormonları başarılı tanımlaması bu işlevi Feromonlar10,11,12olarak sonuçlandı. Metabolomics biyolojik sistem13içinde potansiyel küçük molekül metabolik ürünler ayıran ikinci bir feromon kimlik bir yaklaşımdır. İki grubun (yani, bir etkin ve etkin olmayan bir özü) metabolik profilleri karşılaştırılması potansiyel bir metabolik profili kimliği sağlar hangi metaboliti saf üzerinden, yapısı aydınlatılmamıştır ve bioactivity teyit edilen14yaşında. Özel karışımlar karmaşık formülasyonları katkı maddesi ya da sinerjik etkileri metabolitleri birlikte yerine kesirler13bir dizi olarak kabul edilir çünkü metabolomics ile tespit edilebilir olasılığı daha yüksektir. Ancak, elde edilen verileri yeni yapıların aydınlatma kolaylaştırmak değil çünkü metabolomics uygulanması sentetik başvurular kullanılabilirliğine dayanır.

Bioassay-güdümlü ayırma yaklaşımdır iki alanı kapsayan bir entegre, yinelemeli: kimya ve biyoloji. Bu yaklaşım kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır. Ham bir özü bir kimyasal özelliği (yani, moleküler boyutu, polarite, vb) tarafından şeker ve elektro-olfactogram (EOG) kayýtlarý içeren ve/veya bir bioassay test edilmiştir. Biyoaktif bileşenler ayırma ve EOGs ve/veya biyoanalizler aşağıdaki adımları tekrar ederek dışarı ekranlı. Saf aktif bileşikler yapılarının moleküler ağırlık ve bahçedeki sentezlenmiş için bir şablon oluşturmak için yapısal bilgi sağlayan spektrometrik ve spektroskopik yöntemler tarafından aydınlatılmamıştır. Bioassay-güdümlü ayırma farklı metabolitleri ve potansiyel olarak Roman Feromonlar biyosentetik yolları öngörülen vermemektedirler benzersiz kimyasal iskeletler ile yol açabilir.

Burada, biz yalıtmak ve erkek deniz taşemen seks feromon bileşiklerin bioactivity karakterize için kullanılan bioassay güdümlü ayırma iletişim kuralı tanımlamak. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) Bu balıklar ağır üç ayrı aşamadan oluşan anadromous onların yaşam öyküsü arabuluculuk kimyasal cues koku algılamayı dayandığından feromon iletişim eğitim için ideal bir omurgalı modelidir: Larvalar, çocuk ve yetişkin. Deniz taşemen larvaları tatlı su akışları tortu yuva, köklü bir metamorfoz geçmesi ve bir göl veya nerede büyük konak balık parasitize okyanus geçirmek gençlere dönüştürün. Ana bilgisayar balıktan ayırma sonra yetişkin yumurtlama akarsu geri akışı yerleşik larva15,16,17,18tarafından,19 serbest göçmen Feromonlar rehberliğinde göç . Olgun erkek yumurtlamabölgelerine dönmek çıkmak, arkadaşları çekmek, yaklaşık bir hafta için zaman zaman spawn ve sonra15,20ölmek çok bileşenli seks feromon serbest. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması önemli çünkü bir modülasyon feromon iletişim sisteminin Laurentian büyük göller21invaziv deniz lampreys kontrol etmek için kabul seçenekler arasında yer alıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 ve 02/17-031-00) tarafından onaylanmış olması.

1. toplama ve çıkarma deniz taşemen su şartına

  1. Yer cinsel olgun erkek deniz lampreys (15-30 hayvanlar) 250 L 16-18 ° C'de tutulan gazlı göl Huron su ile birlikte bir su tankında
  2. Her gece boyunca erkek şartına su Haziran ile Temmuz için toplamak.
    Not: deniz lampreys doğal yumurtlama sonra ölür. Bir balık onun hayatında bu noktaya yaklaşıyor olan taze ve olgun bir erkek yerine.
  3. Katı faz çıkarma tarafından şartına su ayıklayın.
    1. Reçine metanol 4 h için bir sütuna yüklemeden önce ıslatın. Reçine sütuna yük, o zaman 10 L su sütunu boyunca organik çözücü ortadan kaldırmak için pompa.
    2. Klimalı su tankı balık üzerinden pompalama sistemi için sütunun üstünde tutan geçmek. Bir yatak dört bir dizide bulunan Orta kutup polimerik iyon değiştirme reçine (e.g., Amberlite XAD-7 HP reçine), 2 kg su geçer 2.5 L kapasiteli cam sütunlar. Yükleme hızı 400 ve 600 mL/6 dk. metabolitleri 10 litre metanol ile hemen aseton 5 L tarafından takip Elute arasında korumak.
      Dikkat: Bu adımı metanol ve aseton kullanır. İkisi de yanıcı ve zehirli.
      Not: Havuza alınan kalan-80 ° daha fazla işlenen kadar C saklanır.
  4. Sütun (yaklaşık 10 L) su ile yıkayarak zenginleştirme 1 hafta sonra yeniden etkinleştirin.
  5. Organik çözücü (metanol ve su karışımı) kaldırmak ve düşük basınç (altında 300 mbar) 40 ° C'de altında 5 h için çevirme buharlaşma tarafından özü hasat Su kalıntı dondurma kuru kadar 48 h-20 ° C'de lyophilization kurutma makinesi tarafından konsantre ol.

2. izolasyon-in kesir havuzları kromatografi ile

  1. Silika jel (230-400 mesh) ilk mobil faz 30 dk. Transfer için jel bir cam sütun için çözücü (süspansiyon) ile ıslatın. Mobil faz üzerinden gitmek izin vermek için sütun vanayı aç. Silika jel çökelti ve silika jel yatak oluşturmak olanak sağlar.
  2. Özler silika jel (70-230 mesh) ile iyice karıştırın ve silika jel yatağa sıvı kromatografi sütuna yükleyin. Onları bir gradyan % 95 CHCl3 (kloroform) ile elute / MeOH (metanol) % 100 MeOH, toplam hacim içinde 2.5 L. Bireysel şişeleri (her 10 ml) eluent toplamak.
    Dikkat: Bu adımda kullanılan kloroform zehirli bir reaktif olduğunu.
  3. Eluents 20 kesirler göre ince tabaka Kromatografi (TLC) analiz havuzu kılavuz.
    1. TLC deney öncesi kaplı silika jel tabaklarda örnek başlangıç çizgisine uygulanması ve gelişmekte olan çözücüler (polarizasyonu CHCl3 oranında metanol için % 100-0 Seç) kapalı bir cam plaka başlangıç çizgisine çeker yerine getirilir Tank.
    2. Çözücü 0,3 arasında değişen her TLC noktalar saklama faktörü (Rf) yapmak için geliştirme oranı seçin - 0.8.
    3. Satır sonu gelişmekte olan çözücü ulaştıktan sonra plaka havuzdan al ve solvent buharlaşır için 10 dk bekle.
    4. Belgili tanımlık yer ilk UV 254 nm ve sonra leke ışığı altında görselleştirmek onları % 5 anisaldehyde (20 μL) bir kromatografi püskürtme tarafından bir asidik metanol çözümü ile püskürtme ve onları 3 dk 85 ° C'de Isıtma onları.
      Not: TLC plaka üzerinde renkli noktalar kesir ana bileşeni belirtir.
    5. Eluent 20 kesirler spot renk ve ana bileşeni Rf benzerlik göre için birleştirin.
  4. Yaklaşık 30 dakika için 40 ° C'de düşük basınç (çözücüler mülkiyeti göre 300 mbar) altında çevirme buharlaşma tarafından kesir bir kalıntı için konsantre.

3. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları kokulu kesirler/bileşenleri tanımlamak için

  1. Borosilikat cam kılcal çekin (dış çap: 1.5 mm; iç çap: 0,86 mm; uzunluğu: 100 mm) bir micropipette ile çektirme ısıtıcı düzeyi ayarlamak için 65.
  2. Puan edinildi ve cut bir cam elmas uçlu kesici ile kılcal ucundaki açma ve erimiş %0,4 agar % 0,9 serum fizyolojik ile doldurun. Kılcal ucu açılışında çapı yaklaşık 10 µm olmalıdır.
  3. Adımları 3.1-3.2 ve katı hal elektrotlar sahipleri çekti kapiller elektrotlar ön fabrikasyon 3 M KCl bir micropipette kullanarak ile Ag/AgCl granül (bkz: Malzemeler tablo) ile dolgu.
    Not: herhangi bir hava kabarcıkları kılcal veya Elektrot tutucu çıkarmak.
  4. Çekti elektrot elektrot sahipleri yerleştirin.
  5. 10-5 M 100 mL hazırlamak L-arginin kömür filtre su 10-2 M L-arginin hisse senedi çözeltilerine volumetric flask deiyonize su (4 ° C'de depolanan) üzerinden. 10-5 M 20 mL transfer L-arginin bir cam şişe için.
  6. Konsantrasyon-yanıt eğrisi için kesir havuzlarının adım 2.3 cam şişe içinde 10 kat dilutions 10 mL hazırlayın. Her gün önce deneyler taze dilutions hazırlamak ve onları bir gün içinde kullanın. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve kesir havuzu dilutions cam şişe koymak
  7. 3-aminobenzoic asit etil ester (MS222; 100 mg/L) ile taşemen anestezi ve gallamine triethiodide (3 mg/kg vücut ağırlığı, % 0,9 serum) bir kas içi enjeksiyon ile steril bir şırınga hareketsiz.
    Not: Anestezi yeterli derinliğe no gill hareket, dik bir duruş korumak için bir yetersizlik ve hiçbir emme sözlü onun yuvarlak yüzey istimal belgili tanımlık tank kenarlarına gözlemci tarafından belirlenir. Herhangi bir mikrobiyal kirlenme öncesi ve ameliyat sırasında en aza indirmek için steril eldiven giymek ve % 70 etanol (v: v) diseksiyon araçlarında en az 10 dk kullanmadan önce deiyonize su ıslatın.
  8. V şeklindeki standı imzalat taşemen yönlendirmek ve kurutulma önlemek için ıslak kağıt havluyla sarın.
    Not: solungaç açıklıklar engel değil.
  9. Gazlı su 50 mg/L MS222 bukkal kavite içine içeren recirculating bir tüp takın, akış hızı ayarlamak ve gill açıklıklar sürekli solungaçları sulamak için su yolu ile çıkarken sağlamak.
  10. Steril neşter ve forseps kullanın [1,25 X büyütme, stereoskopik mikroskop altında ( Tablo malzemelerigörmek)] koku epitel ortaya çıkarmak için koku kapsül yüzeyi cilt 5 mm2 bölümünü kaldırmak için.
  11. Propil teslim boru filtrelenmiş su ile yıkayın ve bir micromanipulator üzerinde sıva üstü Vana bağlayın. Propil teslim kılcal tüp filtrelenmiş su kuruma odorants yönetirken değil önlemek için koku epitel sunmak için micromanipulator kullanarak koku epitel kavite içine koyun.
  12. Kayıt ve başvuru elektrotlar micromanipulators üzerinde bağlayın. Referans elektrot naris yakınındaki dış deri üzerine indir. Stereoskopik mikroskop (1,25 X), daha düşük koku epitel yüzeyi çok az dokunmak kayıt elektrot kullanarak.
  13. Propil teslim tüp alımını filtre arka plan su 10-5 M L-arginin çözüm için transfer.
  14. Bilgisayar, amplifikatör (DC modunda), filtre ve çizim tablası açınız. Vana sürücü yazılımını kullanarak program propil 4 bir s tek darbe T 4 olarak ayarlamak T1, kutusunu işaretleyerek yönetmek için bu yordamı s ve T2 kutunun işaretlenmesi.
  15. Veri toplama yazılımı (bakınız Tablo malzemeler), ayarla toplama modu için yüksek hızlı bir osiloskop, oyun simgesini tıklatın ve propil darbe tetiklemek için Vana sürücü Başlat ' ı tıklatın.
    Not: Veri toplama yazılımı otomatik olarak fark EOG yanıt genlik 20 kaydeder s (3 önce 4 s s propil darbe ve 13 sırasında daha sonra s). Kayıt elektrot, referans elektrot veya L-arginin standart en fazla yanıt ve bir çok az yanıt-e doğru boş denetim (sinyal-gürültü oranı artırmak için propil teslim tüp konumlarını manevra için micromanipulator kullanın filtrelenmiş su). Zemin elektrotlar hareket ederken AC-DC amplifikatör anahtar GND için değiştirme'yi amplifikatör.
  16. Boş kontrolü, L-arginin ve sonra adım 3.6'düşük 2 dk floş süzülmüş su ile yüksek konsantrasyonları uygulamalar arasında hazırlanan odorants kaydetmeye başlamak.
  17. Yanıt test edilecek tüm odorants için kayıt sonra amplifikatör zemin ve dikkatle elektrotlar ve propil teslim kılcal tüp geri çek. Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yöntemleri, EOG deney sona ermesi, takip ötenazi ile MS222 aşırı dozda imzalat taşemen (1 g/L).
    Not: başarılı ötenazi gill hareketi ve kalp atışı en az 5 min beyin pithing tarafından takip için eksikliği işaret ederek doğrulayın.
  18. Analiz ve analiz yazılımı kullanarak verileri çizmek. Yanıt-e doğru boş su kontrolü büyük temin kokulu kesirler tanımlamak için odorants22 algılama eşiği belirlemek. Boş su kontrolü farklı konsantrasyon bağımlı koku yanıt temin kesir havuzları sonra bir davranış tahlil (adım 4) test edilir.

4. iki seçim labirent davranışsal aktif kesirler/bileşikler tanımlamak için davranış Bioassay

  1. Cinsel Olgun kadın deniz taşemen labirent yayın kafeste alışmana ( ek Şekil 1bakınız) için 5 dk. labirent içinde nehir su akış hızı korumak
    Not: Labirent vernikli deniz sınıf ahşap ve önlemler 6.5 m uzunluğunda ve 1, 2 m genişliğinde bir bölücü 2.7 m uzunluğunda ters yönde sonunda iki kanal içine labirent ayırmak için ölçme ile inşa edilmiştir. Su içine labirent geçici olarak yönlendirilir. Su derinliği 0,19 m., saklanması gereken ve hız 0,07 m/s ± 0,01 muhafaza edilmelidir.
  2. Deniz taşemen yayın ve taşemen deneysel geçirdiği zaman ve denetim kanalı içeren her nehir su 10 dakikadır kümülatif miktarı kaydetmek.
    Not: deniz taşemen deneysel girin ve en az 10 için kanal denetlemek başarısız olursa bu 10 dk dönemde s son deneme bu hareketsizlik ya da güçlü yan önyargı bir göstergesi olarak.
  3. Test uyarıcı uygulamak (yani, 10-12 M, sözde bir feromon % 50 metanol/deiyonize su içinde çözünmüş) rasgele atanan deneysel kanal ve kanal denetimi kullanarak araç (% 50 metanol/deiyonize su) peristaltik 5 min için pompalar 200 mL/dk sabit bir fiyatla.
    Not: Electro-olfactogram kayıtları ile belirlenen test uyaran algılama eşik konsantrasyonu davranış testi için başlangıç konsantrasyonu kullanılmalıdır.
  4. Test uyarıcı ve aracın ek bir 10 min için geçerlidir ve taşemen geçirdiği zaman toplam miktarını Deneysel kayıt ve denetim kanalı.
  5. Labirent sonraki duruşma başlamadan önce 10 min için su ile yıkayın. Yeterli test uyarıcı kullanılabilir 4.1-4.4 en az 7 lampreys ile yineleyin.
  6. Bir dizin tercih22 her deneme için hesaplamak ve Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma önemini değerlendirmek.
    Not: Dizin sonuçlarda olumlu veya olumsuz olabilir tek bir numara. Oysa cazibe, değeri tercih Dizin gösterir tercih göstergeler itme dizinin negatif bir değer. Tercih dizin sıfırdan önemli ölçüde farklıysa, kesir etkin olarak kabul edilir.
    figure-protocol-1
    Burada,
    Bc = propil uygulamadan denetim kanalı test taşemen tarafından harcanan zaman
    Be = propil uygulamadan deneysel kanaldaki harcanan zaman
    C = propil uygulamadan sonra denetim kanalı harcanan zaman ve
    E = propil uygulamadan sonra deneysel kanalda harcanan zaman.

5. kromatografik yalıtım etkin kesirler gelen saf bileşiklerin

  1. Tekrarlamak merdiven 2.1-2.4 koku yanıt (adım 3) neden kesir havuzlu ve davranışsal yanıt (adım 4) temin.
  2. Daha fazla etkin kesirler Sephadex LH-20 sütun kullanarak boyut-dışlama kromatografi ile bileşikler arındırmak.
    1. 0.5 mL örnek ilk mobil aşamasında hazırlamak [CHCl3- MeOH (1:1) veya MeOH % 100], bir CHCl3- MeOH (1:1) sütun ve sonra bir MeOH (% 100) sütun karşılık gelen sütuna yüklemek ve onları bileşikleri vermeye elute.

6. yapı aydınlatma kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile saf bir bileşik

  1. Dağıtılması ve saf bileşik ilk mobil aşamasında yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yaklaşık 1 μg/ml 10 μL çözüm oluşturmak için (genellikle, metanol su, 1:1, v: v) oranında seyreltin.
    1. Örnek çözüm HPLC şişeleri için aktarmak ve HPLC Otomatik Örnekleyici koymak onları. Örnek (10 μL) electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESIMS) enjekte ve yüksek çözünürlüklü electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (HRESIMS) spectra kromatografi kütle spektrometre23kullanarak kaydedin.
  2. Moleküler formülü kütle spektrometre yazılım veritabanında göre tahmin (bakınız Tablo reçetesi)24.
    1. Eklenen örnek kromatografik açın ve kromatografik tepe seçerek onun kitle spektrum elde etme.
    2. Aracı modülü Elemental bileşiminde iyon (m/z) değeri (4 ondalık) ölçülen ayine girdi. PPM tolerance parametre ayarla < 5.
    3. Öğe oluşumu ölçülen molekülünün sığdırmak için sembol parametrelerini ayarlamak. Yazılım moleküler formülü tek kitle analizi dayalı bir tahmin oluşturur.
  3. Deuterated çözücüler (600 μL, CH3OH -d4 veya DMSO -d6) örnekleri çözülmeye Protokolü25 göre seçin.
    1. Yaklaşık 0,1 10 mg/mL aralığında değişen bir konsantrasyon ile bir çözüm oluşturmak için seçili deuterated çözücüler örnek tamamen erimesi. Örnek çözüm 1 D (1H, 13C) kaydetmek için bir NMR tüp içine aktarmak ve 2D NMR [1H -1H korelasyon spektroskopisi (rahat), heteronuclear tek kuantum tutarlılık (HSQC), heteronuclear çoklu bağ korelasyon (HMBC)] Spectra 900 MHz NMR spektrometresi26.
  4. NMR tüp spinner türbin içinde örnek ile yerleştirin. Derinlik mastarı örnek yükseklik ölçme penceresinin ortasında olduğundan emin olmak için kullanın. NMR yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve mıknatıs örnek değiştirmek için Kaldır düğmesini tıklatın.
    Not: magnet mıknatıs tepesinden gelen gaz hissetmek tepesinden bir elini tut. Aynı zamanda, bir ıslık sesi duyulabilir olmalıdır.
  5. Yavaşça örnek hava yastığı mıknatıs üstüne yerleştirin ve NMR mıknatısına örnek tekrar inmeye Kaldır düğmesine basın.
    Not: örnek doğru pozisyonda olduğunu belirtmek bir "tıklama" gürültü dinler.
  6. Yeni bir veri kümesi oluşturun ve NMR enstrüman tarafından önerilen varsayılan parametreler yük ( Tablo malzemelerigörmek).
    1. Otomatik kilitleme yordamı çağırmak ve solvent istemi sayfasindan seçmek için "kilit" yazın.
    2. İnce ayar için Unlock modelindeki düğmesini Değiştir masası' nda, ayarlamak, imleci işlemek panelindeki ayarlama ve mıknatıs kilit daha.
    3. İstemi Atma sayfa üzerinde bir kaç dakika sürebilir ayarlama yordamı işlemek paneline parametresinde ayarlayın. Devam etmek için ayarlama tamamlanana kadar bekleyin.
    4. Otomatik shimming rutin-e sevketmek içinde "topshim" yazarak başlatın. Titremeden devam tamamlanana kadar bekleyin.
    5. Türü "rga otomatik ayarlamak için" kazanç ayarlar, daha sonra "türü d1 Bakliyat, sonra"türü zg satın başlatmak ve satın alma bitene kadar bekleyin"arasındaki gecikme ayarlamak için" alınıyor.
    6. "Ef" veya "verileri işlemek ve sonra yazın"apk otomatik phasing için"e.f.P'yi" yazın. NMR işleme yazılımı verilerin işlenmesi.
  7. Kimyasal yapısı NMR veri analizi bir yorumu tarafından aydınlatmak.
  8. 13C NMR spektrumu karbon sinyalleri saymak. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HR-MS) öngörülen sonucu eşleşen moleküler formülü seçin.
  9. 1H NMR spektrumu proton sinyalleri entegre ve belgili tanımlık connectivity, karbon ve proton-tabanlı HSQC spektrumda sinyalleri üzerinde atayın.
  10. Korelasyon 1H -1H rahat ve HMBC spektrum dayalı karbon iskeleti bağlantı atayın.
  11. Kesin olmayan biçimde kimyasal yapısı yapısı mantığı27tarihinde temel atayın. Geçici yapısı kimyasal yapısı veritabanlarında arama. Geçici yapısı başvurular analogları ile karşılaştırın.
  12. Nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrum göreli yapılandırmayla atayın.
    Not: spektrometresi ve spektroskopik yöntemler üzerinde görüntülenen enantiomers kimlik özelliklerini aynı olduğundan, bazı bileşiklerin, özellikle de 2'-alkol ve 2'-NH2, mutlak yapılandırma ile belirlenecek sahip bir derivatization reaksiyon. Derivatization reaksiyon sonra spectra üzerinde belirtilen farklılıklar çoğu bileşikler28mutlak konfigürasyonlar kesin atama kolaylaştırmak.

7. EOG ve Bioassay saf bileşikler onaylamak için kokulu ve davranışsal aktif

  1. 3.1-3.5 adımları yineleyin.
  2. 10-6 M - 10-13 M 10-3 M feromon hisse senedi çözüm % 50 metanol/su içinde belirlenen moleküler ağırlık temel-20 ° C'de depolanan gelen saf bileşiklerin 10 kat dilutions 10 mL konsantrasyonu-yanıt eğrisi için hazırlamak Adım 6.2. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve saf bileşikler ile cam şişe koymak
  3. 3.7-3.18 adımları yineleyin.
  4. 4.1-4.2 adımları yineleyin.
  5. EOG algılama eşik konsantrasyon saf kampta rasgele atanan deneysel kanal ve 5 min için 200 mL/dk Sabit fiyatla peristaltik pompa kullanarak Denetim kanalında ve aracın (% 50 metanol/deiyonize su) uygulanır.
  6. 4.4-4,6 adımları yineleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bioassay-güdümlü Ayırma Protokolü içinde açıklanan adımları özetleyen bir diyagram Şekil 1' de gösterilen. Protokol yalıtmak ve yapısı, koku kudret ve davranış etkinliği 5 sözde deniz taşemen Feromonlar (Şekil 2) ile karakterize için adımları içerir. Kütle spektrometrik ve NMR veri (Şekil 3 ve Şekil 4) kullanarak, petromyzene A-B ve petromyzone A-C yapılar olgun erkek de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Balık bileşiklerin henüz tespit için tam bir kimyasal dünyada yaşıyoruz. Bioassay-güdümlü ayırma belirlemek ve bu masu somon31, Asya filler32ve deniz lampreys33gözlenen gibi birçok kimyasal etkileşimlerin arabuluculuk biyoaktif molekülleri karakterize temel kanıtlamıştır, 34,35. Bioassay-güdümlü ayırma doğru bir şekilde izleme ve belirlemekte başlangıç biyoaktif bileşikler için sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Okyanus deniz lampreys sağlamak için Kanada ve ABD Jeolojik Araştırma Hammond Bay biyolojik İstasyonu onların araştırma tesislerinin kullanımı ve personel ABD balık ve vahşi yaşam servisi ve balıkçılık için teşekkür ederiz. Bu araştırma Weiming Li ve Ke Li büyük göl balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Filamentli birinci sınıf standart duvar borosilikat kılcal damarları Warner InstrumentsG150F-4kayıt ve referans elektrodu (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)
Pipet çektirme aletiNarishigePC-10EOG'ler için elektrotları çeker
Elmas uçlu cam kesiciEOG için elektrotlarıngenel
Borosilikat cam kılcal damarlarEOG
için World Precision Instruments 1B150-4 koku verici dağıtım tüpüKayıt elektrot tutucusu E Serisi cam kılcal OD 1,5 mm için Ag/AgCl peletli düz gövdeWarner InstrumentsESP-M15Nkayıt elektrot tutucusu
Referans elektrot tutucusu E Serisi saplı  Ag / AgCl peleti  cam kılcal OD için 1,5 mmWarner InstrumentsE45P-F15NHreferans elektrot tutucusu
1 mm pinWarner InstrumentsWC1-10referans ve kayıt elektrot tutucularını köprülemek için
2 mm pinWarner InstrumentsWC2-5referans ve kayıt elektrot tutucuları için
AgarSigmaA1296erimiş agar
Potasyum klorür (KCl)SigmaP9333Elektrotları ve elektrot tutucuları doldurmak için 3M KCl
Mikropipet mikrofilWorld Hassas AletlerMF28G-5elektrotları ve elektrot tutucuları doldurmak için
L-ArgininSigmaA5006EOG
MetanolSigma34860
Su banyosuÖzel yapımN / AEOG için koku maddeleri tutar
3-aminobenzoik asit etil ester (MS222)Syndel USATricaine1GEOG anestezik
Gallamin trietiyodürSigmaG8134-5GEOG paralitik
1 mL şırıngaBD Biosciencesparalitik uygulamak için301025
Subkutan iğne 26G 5/8BD Biosciences305115paralitik
Makaralı kelepçeuygulamak için Dünya Hassasiyeti Aletler14043-20anestezik akış hızını lamprey'in ağzına ayarlar
Sodyum klorür (NaCl)JT Baker3624-05% 0.9 tuzlu
V-şekilli plastik standınÖzel yapımN/AEOG Plastik oluk sırasında lambayı tutar
Özel yapımN/A, EOG Neşter Bıçakları sırasında V şeklinde plastik standı tutar
- # 11EOG diseksiyonu için10011-00
Neşter Kolu - #EOG diseksiyonu içinBilim Araçları10003-12
düz ultra ince forsepsGüzel Bilim Araçları11252-00, Dumont #5SF Forseps
Kavisli ultra ince forsepsGüzel Bilim Araçları11370-42, Moria MC40B
Düz pring MakasıEOGdiseksiyonu için15003-08
StereomikroskopEOG diseksiyonu içinZeissDiscovery V8
Aydınlatıcı ışığıZeissCL 1500 ECOEOG diseksiyonu için
Plastik borusirkülasyonlu EOG kurulumunu ve su banyolarını bağlamak içinjenerik
Koku dağıtım borusuÖzel yapımN / A
In hat filtresi ve conta setiLee CompanyTCFA1201035A
MikromanipülatörlerNarishigeMM-3elektrotları ve koku verici iletim kılcal borusunu konumlandırmak için
Manyetik tutma cihazlarıKanetecMB-K
Valf sürücüsüArduinokoku stimülasyonu için valfin açılmasını kontrol etmek içinözel olarak üretilmiştir
Elektromanyetik valfLee ŞirketLFAA1201618Hkoku stimülasyonu için valf
NeuroLog AC/DC amplifikatörDigitimer Ltd.NL106, elictrical sinyalin genliğini artırmak için
NeuroLog DC ön amplifikatörü, headstageDigitimer Ltd.Elictrical sinyalin genliğini artırmak içinNL102G
Alçak geçiren 60 Hz filtreDigitimer Ltd.NL125
Sayısallaştırıcı MolekülerCihazlar LLCAxon Digidata 1440A
Axoscope veri edinme yazılımı çalıştıran Dell bilgisayar (OptiPlex 745)Molecular Devices LLCAxoScope sürüm 10.4
Faraday kafesiÖzel yapımN / AElektromanyetik gürültü kalkanı
İki seçenekli labirentÖzel yapımYokplastik astar ile kaplı su geçirmez deniz sınıfı kontrplak
Çöp pompasıHondaWT30XK4Alabirenti yakındaki nehirden gelen suyla dolduruyor
Labirentte koku maddelerini yönetmek içinborulu peristaltik pompaCole ParmerMasterflex 07557-00
İnvertör JeneratörHondaEU1000iperstaltik pompaya güç sağlar
Serbest bırakma kafesiÖzel yapımN / Alabirentte lamprey iklimlendirmek için kullanılır
MeshJeneriklabirentin boyutlarını içermek ve ağ silindirleri ile su türbülansını en aza indirmek için kullanılır
Kovalar (5 galon)Koku maddelerini karıştırmak içinjenerik
Deşarjı ölçmek içinakış ölçerMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000
XAD 7 HP reçineŞartlandırılmış37380-43-1 
Şartlandırılmış suyun ekstraksiyonu içinmetanolSigma34860
Şartlandırılmış suyun ekstraksiyonu içinsu banyosuYamatoBM 200
Dondurarak kurutucuLabconcoCentriVap Şartlandırılmışsu kloroformunun ekstraksiyonu için
Fraksiyon havuzlarının izolasyonu içinSigmaCX1050
Silika jel 70-230 meshFraksiyon havuzlarının izolasyonu içinSigma112926-00-8
Silika jel 230-400 meshFraksiyon havuzlarının izolasyonu içinSigma112926-00-8
Ön kaplamalı silika jel TLC plakalarıFraksiyon havuzlarının izolasyonu içinSigma99571
izolasyonu içinanisaldehitSigmaA88107
Fraksiyonhavuzlarının izolasyonu içinGE Healthcare17-0090-01
Amberlite XAD 7 HP reçineSigmaXAD7HPşartlandırılmış suyun ekstraksiyonu için 
4, 2.5L kapasiteli cam sütunlarAce Glass Inc.5820şartlandırılmış suyun ekstraksiyonu için 
Şartlandırılmış suyun ekstraksiyonu içinAsetonSigma650501
TQ-S, TOF LC, Kütle spektrometresi (veya eşdeğeri)Waters Co.Yapı açıklaması içinN / A
İkili HPLC pompasıWaters Co.Fraksiyon havuzlarının/bileşiklerinin izolasyonu için1525
Agilent NMR spektrometresi, 900MHz (veya eşdeğeri)aydınlatması içinAgilentN/A
Şartlandırılmış suyun ekstraksiyonu içinRotovap kurutma sistemiBuchiRII
UV lambası (254 nm)Spectronics Co.İnce tabaka kromatografisi içinENF-240C
kesim ucu için pozitif kontrol koku verici , , numune aşaması olarak hazırlanması için , Güzel Bilim Araçları 3 Güzel EOG diseksiyonuiçin EOG diseksiyonu için Güzel Bilim Araçları Yeniden , ile donatılmıştır., suyun ekstraksiyonu için Dow kimyasal   konsantratör Fraksiyon havuzlarının Yapı   

Kaynaklar

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kat Faz EkstraksiyonuS v KromatografisiElektro Ol Faktogram Kaydki Se enekli Labirent DeneyiBoyut d lama KromatografisiK tle SpektrometresiNMR SpektroskopiKimyasal Ekoloji

İlgili makaleler