Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC’ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Abstract

Nötrofiller, monosit ve dendritik hücreler (DC) verim miyeloid ataları tespit ve hematolojik ve immünolojik analizleri farelerin kemik iliği dan izole. Örneğin, uygulama miyeloid progenitör nüfus hücresel ve moleküler özelliklerinin lösemik dönüştürme altında yatan mekanizmaları ortaya veya patojen maruz bağışıklık sistemin nasıl yanıt vereceğini gösterir. Daha önce açıklanan akış sitometresi stratejileri miyeloid progenitör tanımlama için birçok alanda önemli gelişmeler etkinleştirdim, ancak onlar tespit kesirler çok heterojen bulunmaktadır. En sık kullanılan gating stratejileri için istenen nüfus zenginleştirilmiş, ama aynı zamanda “bulaşıcı” ataları çok sayıda içeren kemik iliği kesirler tanımlayın. Bizim son yıllarda yapılan çalışmalarda bu heterojenlik çoğunu çözmüş ve ruhsatı burada mevcut protokol oligopotent 6 altgrupları yalıtım ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 2 daha önce kemik iliği kesirler açıklanan. 3 kademeli protokolünü açıklar: 1) yalıtım kemik iliği hücreleri, hematopoetik ataları tarafından manyetik aktif hücre (soy tükenmesi MAC’ler tarafından) sıralama ve 3) akış sitometresi (dahil tarafından miyeloid progenitör alt kümeleri tanımlaması için zenginleştirme 2) floresans aktif hücre), sıralama FACS, isterseniz. Bu yaklaşım progenitör miktar ve yalıtım uygulamaları içinde in vitro ve in vivo çeşitli için izin verir ve zaten yolları ve nötrofil ve monosit DC farklılaşma mekanizmalarının içine roman fikir vermiştir.

Introduction

Monosit, nötrofil ve dendritik hücreler (DC) esas olarak kemik iliği hematopoetik ataları myelopoiesis adı verilen bir işlem tarafından ortaya miyeloid hücrelerdir. Ortak miyeloid ataları (CMPs) myeloid hücrelerin yanı sıra megakaryocytes ve eritrositler ama değil lenfoid hücre üretmek potansiyeline sahip. CMPs türetilmiştir, granülosit-monosit ataları (GMPs), granülosit ve monosit üretmek, ama megakaryocyte ve eritrosit potansiyel kaybettik. Monosit ve klasik ve plazmasitoid DCs (KGK/PDC’ler) da ortak ataları CMPs. kademeli kısıtlama lineage potansiyel sonuçta sonuçları lineage kaydedilmiş tarafından üretilen monosit-DC ataları (MDP’ler) olarak bilinen kaynaklanan için düşündüm ataları: granülosit ataları, monosit ataları ve dendritik hücre ataları (Şekil 1).

Weissman ve meslektaşları bildirdi CMPs Lin^– c-Kit ile⁺ ani kalp durması-1^– (LKS^–) CD34 bulunur⁺ FcγR^lo kısmını fare kemik iliği GMPs LKS^– CD34 yer alır iken,⁺ FcγR ^Merhaba Kesir¹. Ancak, bu “Cumhuriyetçi millet partisi” ve “GMP” kesirler çok heterojen bulunmaktadır. Örneğin, “GMP” kesir Ayrıca lineage için kabul edilen granülosit ataları ve monosit ataları^1,2içerir. MDP’ler ayrı ayrı CX3CR1 olmak rapor⁺ Flt3⁺ CD115⁺ da CD34 ve FcγR^3,4ifade ataları. MDP’ler ortaya çıkmasına neden olan c-Kit (CD117) düzeyi düşük hızlı bildirilmiştir cDC/pDC-üreten ortak DC ataları için (CDP) ve LKS^– Kesir⁵dahil değil.

Monosit bir tek yol (CMP-GMP-MDP-monosit) yolu ile ortaya daha önce kabul edildi. (Monosit ataları, MPs adlı) GMPs tarafından üretilen bu model, monosit olarak kaydedilmiş ataları ile tutarlı² ve MDP’ler (ortak monosit ataları, cMoPs adlı)⁶ gibi görünüyor aynı hücre temelinde paylaşılan yüzey marker ifade . Ancak, biz son zamanlarda monosit bağımsız olarak GMPs ve MDP’ler tarafından üretilmektedir gösterdi ve MPs ve cMoPs tek hücreli RNA sıralama⁷tarafından ayırt başardık.

Weissman “Cumhuriyetçi millet partisi” ve “GMP” perdeleme strateji C57BL/6J fare kemik iliği farklı oligopotent ve myeloid progenitör lineage için kabul edilen alt kümeleri içeren 6 subfractions tanımlamak için değiştirilen. Biz ilk Ly6C ve CD115 boyama oligopotent GMPs, hem de granülosit ataları (GPs) ve monosit ataları (MPs ve ayırmak Şu anda açamayacaklar cMoPs) yalıtım izin verir rapor “GMP” Kesir² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Merhaba kapısı; Şekil 1). Daha sonra MDP’ler ağırlıklı olarak “CMP” kesir bulundu gösterdi (LKS^– CD34⁺ FcγR^lo kapısı), ayrıca Flt3 içeren⁺ CD115^lo ve Flt3^– alt kümeleri⁷ (resim 1 ). CMP Flt3⁺ CD115^lo kesir GMPs ve MDP’ler evlatlık transfer verimleri. Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3^– alt CMP-Flt3⁺ CD115^lo hücreler ve GMPs arasındaki ara ürün olarak görünmesini ataları içerir. MDP’ler farklı olarak, hem Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3⁺ CD115^lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3^– kesirler de megakaryocyte ve eritrosit potansiyel bulunmamaktadır.

Ancak, ister gerçekten oligopotent (nötrofil, sahipÖrneğin, tek tek hücreleri içinde CMP Flt3⁺ CD115^lo kesir vardır ataları “CMP” kesirler içeren şu anda belirsiz olduğuna dikkat etmek önemlidir monosit, DC, megakaryocyte ve eritrosit potansiyel), veya alternatif olarak, CSF’den daha sınırlı lineage potansiyeli olan karışımı kapsayabilir. Deneyleri (methylcellulose kültürleri) oluşturan colony CMP-Flt3⁺ CD115^lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3^– kesirler^{1 hücreler granülosit (nötrofil), eritrosit, monosit ve megakaryocyte potansiyel (et hücreleri) “CMP”, içinde olduğu ortaya çıktı ,7}, ama DC potansiyeli değerlendirmesi izin vermez. Buna ek olarak, deneyleri oluşturan colony “GMP” Kesir^1,2oligopotent GMPs (nötrofil ve monosit potansiyel ile ataları) varlığını gösterdi ve bu son tek hücre tarafından desteklenmektedir transcriptomic analiz⁸. Bu oligopotent GMPs da diğer granülosit (eozinofil, bazofil ve mast hücreleri) üretmek olup olmadığını şu anda, ancak, bilinmemektedir.

Bu çalışmalar, biz şimdi göstermek dayalı nasıl 7 işaretleri (c-Kit, ani kalp durması-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C ve CD115) yüzey tanımlanmasını ve yalıtılmasını oligopotent ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 6 Bu alt kümeleri kullanılabilir. Burada açıklanan protokol vitro kültürü deneyleri (kültür) methylcellulose ya da sıvı, uygulanabilir vivo içinde evlat edinen transfer deneylerde fare ve moleküler analiz (toplu ve tek hücreli RNA sıralama, Western blot, vb).

İletişim kuralı 3 etap oluşur: 1) hazırlanması bir tek hücre süspansiyon kemik iliği hücreleri, 2) zenginleştirme hematopoetik ataları (manyetik aktif hücre sıralama) ve 3) tanıma ve istenirse progenitör alt kümeleri akımını, yalıtım sitometresi (bir çözümleyici veya bir sıralayıcısı uygun şekilde kullanarak). İlk adım kalça kemik iliği hücre izolasyon ve ötenazi farelerin yırtılmalarıteşhis ve diğer yukarıda açıklanan protokoller⁹‘ a benzer. Daha sonra örnek farklılaşmış hücreler tüketmek için bir kokteyl hücre yüzey işaretleyicileri, eritrositler, nötrofiller, monosit, lenfositler, vb karşı antikorların kullanarak kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Bu, ancak önerilir hafiye-in yaratıcı alt kümelerini en iyi duruma getirme ve progenitör kimlik için gerekli antikor ve akış sitometresi için gereken süre miktarını azaltmak için zorunlu değildir. Soy tükenmesi iletişim kuralı aşağıdaki Magnetic-Activated hücre sıralama (Mac) bir fare Lineage hücre tükenmesi Kit kullanarak açıklar (CD5, CD45R karşı biotinylated antikor içeren (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 ve Ter-119, artı Anti-biotin lastikteki) ve otomatik bir manyetik ayırıcı. Son adım tanımlamasıdır (ve sıralama, istenirse) akış sitometresi tarafından progenitör alt kümeleri olan. Aşağıda açıklanan antikor paneli (Ayrıca bkz: Tablo 1) bir akış sitometresi (Analyzer’ı veya Sıralayıcı) 4 lazerler ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Şekil 1: nötrofil, monosit ve DC ataları ve ayırt etme yolları. Myelopoiesis⁷ ‘ nin son zamanlarda gözden geçirilmiş modeli “CMPs” (mavi) ve “GMPs” (yeşil)¹ overlaid Weissman gates ile gösterilmektedir. Bu rakam Yáñez vd 2017⁷‘ den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından kabul edildi. 1. yalıtım fare kemik iliği ve bir tek hücre süspansiyon hazırlanması Kurumsal yönergelere uygun olarak fare ötenazi. Sırtında euthanized fareyi getirin ve % 70 etanol (alkol) ile sprey. Keskin, sivri uçlu makas ve cilt legs–dan kaldırmak ve kas ve kemik maruz doğru beden yukarı çekin bir küçük (3-5 mm) kesik ayak bileği düzey kullanarak her hind bacak içinde olun. (Kuadriseps, hamstrings, vb) kas kemik yönünü takip makasla çıkararak kemiklerden kaldırın. Kemikleri zarar vermemeye dikkat et. Uyluk dan kalça eklem yerinden çıkar ve bağ doku ve kas kemik kesmemeye dikkat bacaklar, ayırmak için kes gitsin. Ayak ayak bilekleri yırtılmalarıteşhis dan çıkartacak tarafından kaldırmak, kemikleri steril PBS veya ortam bir tüp içinde yerleştirin ve onları buz doku kültürü odasına taşımak.Not: Bazı diğer uygulamalar (makrofajlar toplam kemik iliği hücrelerden TüretmeninÖrneğin, ) için kemikleri buz üzerinde bir süre için terk etmek mümkündür, ancak progenitör yalıtım için bir downregülasyon önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde devam etmek önemlidir önemli yüzey işaretleyicileri (özellikle CD115). Bir Biyogüvenlik kabini, kalan herhangi bir yumuşak doku kağıt mendil ile sürtünme tarafından kemiklerden kaldırın.Not: steril bir örnek FACS sıralama sonra hücre kültür ve in vivo deneyleri için gerekliyse protokol bir Biyogüvenlik kabini gerçekleştirilmesi gerekiyor. Steril hücreler gerekli değildir eğer, tüm süreç laboratuvarı tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Kısaca kemiklerde bırakın onları ve o zaman steril PBS onları yıkamak için dezenfekte alkol. Kalça diz ile kesme tarafından yırtılmalarıteşhis ve fibulas ayrı ve fibulas atın. Kemikler kapalı uçları keskin makasla kesme. Kemikleri beyaz görününceye kadar kemik iliği soğuk steril PBS ile aşağıdaki gibi hasat: Her kemik forseps ile kavrama ve bir ucunda kemik mili içine soğuk steril PBS içeren bir 10 mL şırınga bağlı 26 G iğne yerleştirin. Kemik 50 mL santrifüj tüpü yukarıda tutun ve 2-5 mL PBS üzerinden kemik kemik iliğini temizlemek. Tüm 4 bones fare (2 uyluk ve 2 yırtılmalarıteşhis) başına gelen kemik iliğini. Yavaşça yukarı ve aşağı bir hücre süspansiyon oluşturmak için kemik iliği disaggregate için bir 1 mL pipet pipet. Bir parça kemik parçaları ortadan kaldırmak ve toplamları, böylece bir tek hücre süspansiyon üreten hücre 30 mikron naylon mesh ile kemik iliği süspansiyon filtre. Santrifüj tek hücre süspansiyon 280 x g de 5 dk ve resuspend hücre Pelet steril boyama arabelleği (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA), 5 mL (Örneğin, uyluk ve yırtılmalarıteşhis 2 farelerin havuza alınmış hücreler için 10 mL) fare başına arabellek boyama kullanarak. 10 μL örnek aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin. 2. yaratıcı zenginleştirme manyetik aktif hücre (Mac) sıralama Tüm tek hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi (veya çok sayıda hücreler olarak istenen verim elde etmek için gerekli) 280 x g 4° C ve resuspend hücre Pelet 40 yılında 5 min için de 107 hücre başına arabellek (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) boyama μL.Not: Ayrıca soy tükenmesi Seti üreticisi arabelleğinden MAC’ler kullanmak mümkündür (bkz. Tablo reçetesi) boyama arabellek alternatif olarak. Soy tükenmesi soy tükenmesi kit ile sağlanan yönergelere göre gerçekleştirin. Malzemeler tablogördüm kit için aşağıdaki yönergeler içindir. Farklı bir kit kullandıysanız, üreticinin yönergeleri izleyin ve 2.3 tutamaçlarından. 10 μL biotin-antikor kokteyl başına 107 hücreleri eklemek, pipetting tarafından mix ve 4 ° C’de 10 dakika için kuluçkaya 30 μL eklemek arabellek/MAC’ler boyama tampon başına 107 hücre ve karıştırın. 20 μL Anti-biotin lastikteki 107 hücre başına ekleyin. İyice karıştırın ve bir ek 15 dk 4 ° C’de için kuluçkayaNot: girdap onları hücrelere eklemeden önce lastikteki onlar tamamen dağınık emin olmak için. 280 x g 5 dk ve resuspend 500 μL boyama arabellek/MAC’ler hücre Pelet arabellek için ilâ 108 hücre, hücre santrifüj kapasitesi, 1 mL 107 hücre başına arabellek/MAC’ler arabellek boyama ekleyin. 10’dan fazla8 hücreler için arabellek/MAC’ler arabellek buna göre boyama sesini çap. Otomatik manyetik ayırıcı üretici yönergelerine göre hazırlayın. Etiketli hücreleri ayırıcı içeren tüpü yerleştirin ve negatif seçim programı seçin. Dede-zenginleştirilmiş lineage negatif (LIN-) hücreleri içeren olumsuz kesir toplamak. Manyetik olarak etiketli soy-pozitif hücreleri içeren olumlu kesir atmak. Lin- hücreleri 280 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet fare (Örneğin, 4 Eğer kemik iliği 2 fareler havuzlu mL) başına arabellek/MAC’ler arabellek boyama 2 ml resuspend.Not: eritrositler tükenmiş çünkü Pelet şimdi yerine kırmızı beyaz olmalıdır. 10 μL Lin- hücreleri aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin. 3. miyeloid progenitör kimlik ve yalıtım floresans aktif hücre (FACS) sıralama Etiket 9 microcentrifuge (1,5 veya 2 mL) tüpler için: 1) hücreleri, 2-8 günahı) hücreleri tek FcγR (CD16/32), karşı antikor fluorophore Birleşik ile lekeli c-Kit, CD34, Flt3 Sca-1 (CD135), Ly6C ve CD115 için voltaj seçimi ve renk tazminat ve 9) örnek hücreleri progenitör kimlik ve sıralama için tüm 7 antikorlar ile lekeli. Her kontrol tüpleri (Tüpler 1-8), 100.000 hücreleri ve tüm kalan hücreleri (veya daha az arzu edilirse) örnek tüp (tüp 9) dağıtın.Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, örnek hücreleri 15 mL tüp içine dağıtmak, onları santrifüj kapasitesi ve Pelet (adım 3.3 aşağıda) resuspend ve o zaman microcentrifuge Tube sonraki boyama adımlar için hücreleri transferi gerekli olabilir. 1500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve denetim tüp granül 100 μL resuspend tampon (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) ve 100 μL örnek tüp Pelet boyama 5 x 106 başına arabellek boyama hücreleri (Örneğin, 1 x 107 hücreler için 200 μL). 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR tek leke tüp ve örnek tüp ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C’de 10 dakika için kuluçkaya girdapNot: Rekabet nedeniyle non-spesifik antikor Fc-aracılı bağlama önlemek için diğer antikorlar eklemeden önce FcγR (CD16/32) antikor örnek hücrelerle leke önemlidir. Hücreleri bir FcγR reaktif engelleme kuluçkaya değil. Karşılık gelen tek leke tüpler (1 her antikor) ve örnek tüp (tüm 6 antikorlar) diğer antikorlar eklemek: 10 μg/mL c-Kit-Pasifik mavi, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3 APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 ve 4 μg/mL CD115-PE. Girdap yavaşça ve 4 ° C’de 15 dakika kuluçkaya 900 μL boyama arabelleğe kontrol tüpleri ve 1 mL örnek tüpü 107 hücrelere başına boyama arabellek ekleyin. Senaryo Özeti 5 min için 1.500 x g santrifüj kapasitesi ve tampon boyama içinde hücre Pelet resuspend: denetim tüp başına 200 μL ve 500 μL örnek tüp 25 x 106 hücre başına. Resuspended hücreleri 5 mL FACS tüpler için transfer.Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, bir 15 mL tüp Santrifüjü için hücreleri aktarmak gerekli olabilir. Üreticinin yönergelerine göre akış sitometresi (Analyzer’ı veya Sıralayıcı) hazırlayın. Günahı ve tek gerilimleri ve renk tazminatlar ayarlamak için akış sitometresi ile kontrol hücreleri lekeli çalıştırın. Örnek hücreleri çalıştırmak, dede alt kümeleri aşağıda özetlenen ve Şekil2 Özet olarak kapı ve istenirse, ilgili progenitör alt kümeleri yalıtmak için sıralama FACS gerçekleştirmek.Not: Her progenitör kapısı en az 1000 olayları almak için yaklaşık 200.000 hücreleri elde etmek genellikle gereklidir. FSC-A (x) ve SSC-A (y ekseni), görüntüleme tüm hücrelerin bir nokta çizim oluşturma ve enkaz ve ölü hücreleri dışlamak için kapı = > “canlı” hücreleri. Bir nokta çizim “canlı” hücre FSC-H (x ekseni) ve FSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) kapısı. Canlı/singlet bir nokta Arsa (FSC) hücreleri SSC-H (x ekseni) ve SSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) / singlet (SSC) kapısı. Canlı/singlet (FSC), bir nokta çizim oluşturma / singlet (SSC) hücreleri, ani kalp durması-1 (x ekseni) ve c-Kit (y ekseni), görüntüleme ve ani kalp durması c-Seti+ — 1 hücreleri seçmek için kapı = > LKS- hücreleri. CD34 görüntüleme LKS- hücrelerinin bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı CD34 seçmek için+ FcγRlo hücreleri = > “CMPs” ve CD34+ FcγRMerhaba hücreleri = > “GMPs”.Not: Mümkün olduğunca kapı “CMPs” ve “GMPs” tam olarak önemlidir. O bir yalancı yoğunluğu arsa veya bir dağılım komplo doğru geçişi için kullanmak yararlıdır. “CMPs” CD115 görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:Flt3+ CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3+ CD115lo hücreleri,Flt3- CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi — Flt3 hücreleri,Flt3+ CD115Merhaba hücreleri = > MDP’ler. “GMPs” Ly6C görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı Ly6C seçmek için-hücreleri = > “GMP-Ly6C- hücreleri” ve Ly6C+ hücreleri = > “GMP-Ly6C+ hücreleri”. “GMP-Ly6C- hücre CD115 görüntüleme”, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:Flt3- CD115lo hücreleri = > GMPs. “GMP-Ly6C+ hücre CD115 görüntüleme”, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için:Flt3- CD115lo hücreleri = > GPs,Flt3- CD115Merhaba hücreleri = > MPs + cMoPs.

Representative Results

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalça ve yırtılmalarıteşhis (2 bacaklar) bir C57BL/6J fare (6-8 hafta yaşlı, erkek veya kadın) (kırmızı kan hücreleri veya ~ 50 milyon çekirdekli hücre de dahil olmak üzere) ~ 100 milyon hücre elde etmek mümkündür. 1-2 milyon Lin- hücreleri fare Lin+ hücreleri MAC’ler tükenmesi tarafından ayrılmış olabilir. Her biri 6 miyeloid …

Discussion

Fare miyeloid progenitör kimlik¹ için strateji çoğunluğuna Weissman immunologists için altın standart ve hematologlar yaklaşık 20 yıl olmuştur, ama şimdi “Cumhuriyetçi millet partisi” ve “GMP” kapıları çok heterojen ve daha kesin belirgin Perdeleme stratejileri ihtiyaç vardır. Burada tarif var Protokolü oligopotent ve soy için kabul edilen alt kümeleri belirli miyeloid CSF’den daha kesin miktar ve eşleme myelopoiesis yollar, hem de incelenmesi için C57BL/6J farelerde izin ve…

Materials

Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7	BioLegend	Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7	BioLegend	Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue	BioLegend	Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE	BioLegend	Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
AutoMACS Separator	Miltenyi Biotec	N/A	Use the "deplete" program
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 13 colors
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	For further analysis of the .fcs files