Yöntem makalesi

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreleri ve makrofajlar patojenlere karşı savunma ilk satırı oluşturan önemli hücrelerdir. Onlar da edinilmiş bağışıklık yanıtının başlama önemli rol oynarlar. Bu hücreler ile deneysel çalışma oldukça zordur. Onların bereket organ veya doku nispeten azdır. Sonuç olarak, onlar çok sayıda izole edemem. Onlar da cDNA yapıları ile transfect zordur. Fare modelinde, bu sorunların kısmen vitro farklılaştırma üzerinden M-CSF makrofajlar için veya GM-CSF dendritik hücreler için huzurunda kemik iliği ataları tarafından aşılabilir. Bu şekilde, bu hücreler büyük miktarda çok az hayvanlardan elde etmek mümkündür. Ayrıca, kemik iliği ataları cDNA yapıları ekimi onların farklılaşma kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar içine önce erken aşamalarında taşıyan retroviral vektörler ile transduced. Böylece, farklılaşma vitro tarafından takip retroviral iletim bu hücrelerde çeşitli cDNA yapıları ifade etmek için kullanılabilir. Ektopik proteinler önemli ölçüde hızlı yeteneği canlı hücre görüntüleme floresan proteinlerin, tandem purifications interactome analizleri, yapı-fonksiyon analizleri de dahil olmak üzere bu hücreler üzerinde gerçekleştirilen deneyler aralığı genişletir, biyosensörler ve diğerleri ile hücresel fonksiyonların izleme. Bu makalede, vektörel çizimler fluorescently öğesini proteinler için kodlama ile fare kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar retroviral iletim için detaylı bir protokol açıklamak. İki adaptör protein, OPAL1 ve PSTPIP2, örnek üzerinde Akış Sitometresi ve mikroskopi pratik uygulaması gösterilmektedir. Biz de avantaj ve sınırlamalar bu yaklaşımın tartışıyorlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myeloid hücrelerin patojenlere karşı savunma mekanizmaları vazgeçilmez bir parçası temsil eder. Onlar hızla mikroplar, hem de ölen hücreleri ortadan kaldırmak mümkündür. Buna ek olarak, onlar da doku gelişimi ve onarım düzenlenmesinde ve homeostasis1,2,3korumak yer alırlar. Kemik iliğinde ortak miyeloid ataları myeloid hücrelerin tümünü ayırt. Pek çok işlevsel ve morfolojik ayrı alt kümeleri içine onların farklılaşma sitokinler ve onların çeşitli kombinasyonları4tarafından kontrol edilen büyük ölçüde etmektir. Çalışılmış en myeloid hücre alt kümeleri nötrofilik granülosit, makrofajlar ve dendritik hücreleri içerir. Bu nüfusun herhangi bir kusurları sonuçları potansiyel olarak yaşamı tehdit eden ve neden ciddi işlev bozuklukları insan ve fare1,2,3,5, , bağışıklık sisteminin yol 6.

Nötrofilik granülosit, aksine dendritik hücreleri ve makrofajlar doku ikamet hücreleri ve bağışıklık organlarında kendi bereket nispeten düşük. Sonuç olarak, yalıtım ve arıtma birincil dendritik hücreleri ve makrofajlar bu hücreler çok sayıda gerektiren deneyler için pahalı ve sık sık imkansız. Bu sorunu çözmek için iletişim kuralları homojen makrofajlar veya dendritik hücreler içinde vitrobüyük miktarda elde etmek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar sitokinler huzurunda fare kemik iliği hücrelerinin farklılaşması üzerine dayanır: makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) makrofajlar ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) veya Flt3 ligand için için dendritik hücreler7,8,9,10,11,12. Bu yöntemle üretilen hücreler yaygın olarak kemik iliği makrofajlar (BMDMs) elde edilen ve kemik iliği dendritik hücreler (BMDCs) elde edilen literatürde açıklanmıştır. Onlar daha fazla fizyolojik özellikleri ile ortak birincil makrofajlar veya karşılık gelen hücre hatları ile dendritik hücreler daha vardır. Bu hücreler formu genetik olarak elde etme olasılığını fareler13değiştiren başka bir büyük avantaj sağlıyor. Vahşi tipi hücreler arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve genetiği değiştirilmiş fare türetilmiş hücre kez genlerin ortaya çıkarılması roman işlevleri veya ilgi proteinler için önemlidir.

Canlı hücreler proteinlerin hücre altı yerelleştirme analiz faiz vivo içindeprotein flüoresan etiket bağlantı gerektirir. Bu en sık (sık sık bir kısa bağlayıcı) birleştiğinde bir analiz protein flüoresan bir protein oluşan genetik olarak kodlanmış füzyon yapı ifade ederek elde edilir (Örn., yeşil flüoresan protein (GFP))14,15 , 16. dendritik hücreler veya makrofajlar fluorescently tagged proteinler zorlu ifadesidir. Bu hücreler genellikle standart transfection yordamlar tarafından transfect zordur ve verimliliği çok düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, transfection geçici, hücresel stres oluşturur ve elde yoğunluğunu floresans mikroskobu17için yeterli olmayabilir. Bu hücreler makul bir kısmını transgene ifade, enfeksiyon kemik iliği progenitör hücre retroviral ile yeterli bir düzeyde elde etmek için vektörel çizimler ve onların sonraki farklılaşma BMDMs veya BMDCs haline gelmiştir çok etkili yaklaşım. Kendi yerel hücresel ortamında, fagositoz, immünolojik synapse oluşumu veya geçiş gibi bağışıklık yanıtı için kritik olan işlemleri sırasında veya bir sabit durumda miyeloid kökenli proteinlerin analiz için izin verdi. Burada, biz fare kemik iliği türetilmiş makrofaj ve dendritik hücreler ilgi fluorescently tagged proteinlerin istikrarlı ifade sağlayan bir protokol tanımlamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemleri, deneysel hayvan refah moleküler genetik Enstitüsü uzman Komitesi ve Çek Cumhuriyeti Bilimler Akademisi tarafından onaylanmış olması.

1. reaktif hazırlık

  1. Amonyum klorür potasyum (ACK) arabellek hazırlayın. NH4Cl 4.145 g ve 0.5 g KHCO3 GKD2O, 500 mL için eklemek sonra 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 100 µL eklemek ve filtre sterilize.
  2. Polyethylenimine (PEI) çözüm hazırlamak. GKD2O. 90 mL 0.1 g PEI ekleyin PH 2.0 düşüktür kadar karıştırma sırasında 1 M HCl dropwise ekleyin. En fazla 3 saat için PEI eriyene kadar karıştırın ve pH 7.2 ile 1 M NaOH için ayarlayın. GKD2O ile 100 mL için ses seviyesini ve filtre sterilize. 1-2 mL aliquots yapmak ve -20 ° C'de depolayın
    Not: Sonra çözülme, PEI 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir ama değil yeniden donmuş.
  3. M-CSF veya GM-CSF içeren hücre kültür supernatants hazırlayın. Önceden yapılan ve-80 ° C. içinde depolanan bu supernatants Bu supernatants yapmak için izdiham sitokin üreten hücrelerin (GM-CSF 18 J558 hücreleri) veya CMG 14-12 hücreleri M-CSF 1910 cm Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) kabında büyümek. O zaman tüm hücreleri T150 doku kültürü şişesi ve Kültür medya 200 mL % 5 CO2ek 4 gün için transfer 37 ° c Süpernatant ve filtre 0.2 µm sterilizasyon filtre üzerinde toplamak. Aliquots yapmak ve bunlar-80 ° C'de depolayın
  4. Hücre kültür ortamının 100 mL hazırlamak: % 10 ile desteklenmiş DMEM ısı Inaktif FBS ve kültür supernatants GM-CSF (için BMDC farklılaşma) veya M-CSF (için BMDM farklılaşma) salgılayan hücrelerden hücre.
    Not: Bu supernatants sitokinler miktarı değişebilir ve ampirik olarak belirlenecek çalışma konsantrasyonu vardır. Genellikle, % 2-3 GM-CSF (önerilen başlangıç konsantrasyonu % 2 dir) veya % 5-10 süpernatant CMG üzerinden M-CSF (önerilen başlangıç konsantrasyonu % 10 olduğunu) üreten 14 – 12 hücreleri üreten hücre satırlarından süpernatant kullanılır. Alternatif olarak, ticari saf kullanılabilir M-CSF 10 ng/mL ve GM-CSF 20 ng/mL, sitokin içeren supernatants, yaniiçin hemen hemen aynı sonuçları ile kullanılabilir., farklılaşma, enfeksiyon verimlilik oranı üzerinde herhangi bir etkisi olmadan ve hücre altı yerelleştirme EGFP öğesini oluşturur. Antibiyotikler penisilin de dahil olmak üzere, G (100 IU/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve gentamisin (40 µg/mL), kullanılan iletişim kuralının herhangi bir aşamada hücre kültürü için Aksi belirtilmedikçe.

2. retrovirüsü imalatı

Dikkat: retroviral vektörler viral vektörler, diğer türleri için karşılaştırıldığında nispeten güvenli olmasına rağmen onlar hala potansiyel bir güvenlik riski oluşturabilir. Bu nedenle, son derece dikkatli ve uygun koruyucu ekipman ile çalışmak ve tüm güvenlik düzenlemeleri ve viral parçacıkların ile çalışmak için yasal şartlara uymak için önemlidir.

  1. Bir tek hücre süspansiyon 10 cm Petri kabına platin-eko (Plat-E) ambalaj hücrelerinin plaka ve 15 mL % 10 içeren DMEM yetiştirmek FBS % 50-60 birleşmesi (24 saat) kadar. Hücreler bir monolayer büyümesini ve kümeleri kültüründe oluşturmalıdır değil.
  2. Retroviral yapı pipet 20 µg (e.g., fluorescently tagged protein pMSCV vektör ilgi ifade yapı) ve20 DMEM 1 mL (olmadan, serum ve antibiyotik) içine vektör ve karışımı yavaşça 10 µg pCL-Eco ambalaj.
  3. İkinci bir tüp için 75 µL PEI DMEM 1 mL (olmadan, serum ve antibiyotik) ekleyin. (RT) Oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya ve sonra her iki tüpler içeriğini karıştırın ve RT. ek 10 min için kuluçkaya
    Not: PCL-Eco isteğe bağlı eklenmesidir. Bu ecotropic viral reseptör için kodlama ve virüs titresi artabilir.
  4. Dikkatli bir şekilde taze DMEMsupplemented % 2 ile 8 mL Plat-E hücreleri üzerinde orta yerine FBS. Orta kullanmadan önce 37 ° C olarak önceden ısıtmak. Antibiyotik transfection etkinliğini azaltmak beri antibiyotik transfection sırasında kullanmayın.
  5. Dikkatli adım 2.3 Plat-E hücreleri üzerinde hazırlanan karışımı (damla) ekleyin ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya
  6. Kuluçka sonra Plat-E hücreler için 10 mL % 10 içeren önceden ısıtılmış DMEM ortamda değişimi FBS ve 37 ° C'de 24 h için hücreleri yetiştirmek Bu kuluçka sırasında Plat-E hücre medya virüs üretecek.
  7. 24 saat sonra 5 mL pipet kullanarak platin Eko hücrelerden retroviral parçacıkları içeren orta toplamak ve (= "süpernatant 1 ecotropic retroviral parçacıkları içeren") 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
  8. Viral supernatants hücrelerde Plat-E tarafından kirlenmesini önlemek için toplanan virüs vasıl 1250 × g 4 ° C'de 5 min için spin En iyi sonuçlar için virüs enfeksiyonu için hemen kullanılmalıdır.
    Not: Virüs Aliquots da daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de saklanabilir. Ancak, iletim verimliliği belirli azalma ile sonuçlanır. Virüs düşmesine yol açar bu yana tekrarlayan donma/çözülme virüs kaçının.
  9. Önceden ısıtılmış DMEM FBS Plat-E için hücreleri ve yetiştirmek için başka bir 24 h 37 ° C'de % 10 ile 10 mL ekleyin
  10. 2.7 adımları yineleyin. ve 2.8. "süpernatant 2" elde etmek için.

3. fare kemik iliği hücre izolasyon

  1. Servikal yerinden çıkması veya diğer onaylanmış yöntemi kullanarak fare kurban. Sprey % 70 etanol ile fare.
  2. Cımbız ve makas kullanarak, deri gibi kas parçası arka ayakları kaldırın. Dikkatle ve kalça eklemi üzerinden asetabulumda femur bozmadan çıkarmak. Pençe ayak bileği eklemde kesti. Kemiği (femur tibia için bağlı) % 70 etanol ile sprey ve bir kağıt havlu kullanarak kasları geri kalanı kaldırın.
  3. Kemikleri içeren steril fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 ile 5 cm Petri kabına yerleştirin FBS (PBS-FBS).  Daha fazla kemik hazırlanıyor, Petri kabına işlenen kadar buz üzerinde tutmak.
  4. Ekimi kısırlık sağlamak için aşağıdaki adımların tümünü bir doku kültürü mahallede gerçekleştirin.
  5. Femur kemik uçları (diz eklem ve dikkatle makas ile kesme bend) bozmadan tibia ayırın.
  6. Kemikleri tek tek işlem. Epifizleri (yaklaşık 1-2 mm) çok küçük bir kısmı kapalı kemik cımbız içinde tutarak makasla kesme.
  7. 30 G iğne ve 2 kullanın veya kemik iliği hücreleri kemik her iki ucunda bir 15 mL santrifüj tüpüne temizlemek için PBS-FBS ile 5 mL şırınga dolu. İğneyi kemiğin içine tüm hücreleri çıkarmak için yıkama sırasında hareket. İğne tıkanmış, değiştirin.
    Not: Kemikler kırmızıdan beyaza kızarma sırasında açmalısınız. Bu hücreleri çoğunluğu kemiğinden kaldırıldı gösterir. Yaklaşık 2-3 mL PBS-FBS kemik başına kullanın.
  8. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
  9. Süpernatant atın ve ACK arabelleği, oda sıcaklığında 2-3 dakika için 2.5 ml Pelet resuspending tarafından kırmızı kan hücreleri parçalayıcı. Lizis sırasında kemik iliği hücre taze 15 mL centrifug tüp 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tonicity PBS-FBS 12 mL ekleyerek geri.
    Not: hücre ölümü önlemek için ACK arabelleği ile hipotonik lizis 5 dk fazla olamaz.
  10. Hemen vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi

4. kemik iliği hücre farklılaşması içine kemik iliği makrofajlar türetilmiş

  1. Pelet %10 FBS ve antibiyotik ile DMEM kemik iliği hücrelerinin resuspend (adım 1.4 sonra nota bakın. antibiyotik yoğunlaşması) ve hücreleri saymak. Farklılaşma BM içine makrofajlar türetilmiş için 5-10 x 10 plaka6 kemik iliği hücre içinde bir 10 cm sigara-doku kültürü adım 1.4 (bakteri) Petri kabına 10 mL serum ve M-CSF ile önceden hazırlanmış DMEM medya ile tedavi.
    Not: 6-8 haftada yaklaşık7 4 x 10 kemik iliği hücrelerinin verimidir-eski C57BL/6J fare.
  2. Hücreleri hücre kültür kuluçka %5 CO2, 37 ° c de 3 gün kuluçkaya
    Not: ilk 2 gün boyunca hücreleri çok hayati bakma, apoptotik hücreler çok sayıda olduğu gibi (hücreleri myeloid hücrelerin ve ölümcül farklılaştırılmış hücrelerin ayırt edemiyor) mevcut.
  3. 3 gün sonra kemik iliği hücre kültürü hayati bakmaya başlar ve hücre bölünmesi, kümeleri oluşturulur. İlk yapışık hücreleri zaten görülebilir. Bu noktada, taze sitokin medya hücrelerle ek.
  4. 10 mL serum ve M-CSF (Kimden adım 1.4) ile önceden ısıtılmış DMEM medya her 10 cm Petri kabına ekleyin ve hücre kültür kuluçka makinesine geri. Bu adımı sırasında eski medya kaldırmak için gerek yoktur.
    Not: kemik iliği makrofajlar kültür 5-7 gün sonra tamamen farklı. Hasat için en güzel gün 6-8, yapışık ve Petri kapları nerede hücreleri çoğunluğu tamamen kaplıdır zamanı.
  5. Gün 5, Petri kabına hücre kültür kapağın almak ve medya neredeyse çanağı kenarı ulaşıyor kadar çanak eğilmek. Dikkatli bir şekilde medya kenarına yakın yüzeyinden 15 mL çıkar ve hücreleri yemeğin ortasında kalmak eğilimindedir. Önceden ısıtılmış medya M-CSF ile aynı birim ekleme ve çanak da kuluçka yerleştirin.
    Not: medya yavaş ve dikkatli emişli, neredeyse hiçbir hücre kaybolur. Ancak, medya emişli santrifüj kapasitesi ve sigara yok yapışık olduğundan emin olmak için geri kültürü için hücreleri eklemek mümkündür (i.e., eksik olarak farklılaştırılmış) kayıp hücrelerdir.
  6. Deneyler için yalnızca yapışık hücreleri (makrofajlar) kullanılır. Hücreleri, 6 veya 7 gün hasat için tüm medya ve yüzen hücreleri kaldırın. Bir kez serum olmadan önceden ısıtılmış PBS ile çanak yıkayın.
  7. 5 mL % 0.02 EDTA de PBS içinde eklemek ve doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 3-5 min için kuluçkaya.
  8. 5 mL pipet kullanarak hücreleri tarafından bir akış PBS-EDTA çanak kaldırmak ve 50 mL santrifüj tüpü 25 mL PBS ile yer onları. Gerekirse, daha fazla yemekleri birlikte havuz.
  9. Hemen vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
  10. Makrofaj Pelet DMEM medyada resuspend ve hücreleri saymak. Makrofaj yüzey ayırt etme belirteçleri (CD11b ve F4/80) ifade tarafından akış sitometresi doğrulayın.
  11. Süspansiyon, e.golmak hücreleri gerektiren deneyler için., akış sitometresi deneyler, qPCR veya western blot analizi, makrofajlar doğrudan kullanın. Yapisan makrofajlar ile deneyler için doku kültürü plaka deneysel kurulumuna göre hücrelerde plaka.
  12. Hücreleri tamamen farklı. Onları amaçlanan deneme için uygun ortamda veya özgün büyüme ve farklılaşma medya M-CSF ile tutun.
    Not: yeni yüzeyine tam yapışma için izin vermek için (ideal gece) kullanmadan önce en az 6 h ile yapışık makrofajlar, çalışma aktarmak için onları yeni bir plaka. Hücreleri yüzen küçük kısmını deneme önce kaldırılabilir.

5. kemik iliği hücre farklılaşması içine kemik iliği dendritik hücreler elde

  1. Protokol BMDMs için aşağıda açıklanan adımları 5.2-5,4 BMDCs için özel ayarlamalar ile izleyin.
  2. %10 FBS ve antibiyotik ile DMEMsupplemented kemik iliği hücrelerinin elde edilen Pelet resuspend ve hücreleri (tarafından aşağıdaki adım 4.1 makrofaj Protokolü) saymak. Dendritik hücrelere farklılaşma için plaka 1-1.5 x 107 kemik iliği hücre içinde bir 10 cm sigara-doku kültürü (bakteri) Petri kabına 10 mL serum ve GM-CSF ile önceden hazırlanmış DMEM medya (adım 1.4.) tedavi.
  3. BMDM Protokolü olduğu gibi aynı işleme adımları izleyin (4.3-4.5 adımlar. makrofaj iletişim kuralı). DMEM medya ile serum ve GM-CSF M-CSF yerine kullanın. BMDCs için yetiştirme süresi daha uzun olduğundan (genellikle 10-12 gün), 1-2 ek besleme 3 gün aralıklarla (süpernatant kaldırma ve adım 4.5 içinde açıklandığı gibi yeni bir yetiştirme ortam ekleme.) ekleyebilirsiniz.
  4. Bu protokolün bir parçası hemen hemen makrofaj protokolü ile karşılık gelen kısmı aynıdır (4.6-4.12 adımlar. makrofaj iletişim kuralı). Deneyler için yalnızca yapışık hücreleri kullanın. Günde 10-12, EDTA, kullanarak hücreleri toplamak saymak ve onları yeni bir yüzey üzerinde plakası. Dendritik hücre yüzey ayırt etme belirteçleri ifade doğrulamak (CD11c +, CD11b +, F4/80-) akış sitometresi tarafından.

6. BMDMs ve EGFP etiketli Protein ilgi ifade BMDCs imalatı

  1. Pelet adım 3.10 alınan kemik iliği hücrelerinin resuspend. DMEM içinde %10 FBS ve antibiyotik ile desteklenmiş ve hücreleri saymak. Enfeksiyon için 2-5 x 10 kullanın6 6-iyi doku kültürü kuyu başına BM hücrelerinin tedavi plaka.
  2. Hazır DMEM medya 1 mL hücrelerde de, M-CSF farklılaşma içine BMDMs için veya GM-CSF BMDCs. farklılaşma için takıma plaka doku kültürü kuluçka %5 CO2 37 ° C'de hücreler için 4-6 h devam
  3. 2 polybrene (12 µg/mL, son konsantrasyon 8 µg/mL hücreleri için ek sonra) ile takıma mL taze toplanan virüs ("süpernatant 1") ekleyin.
    Not: Virüs içeren süpernatant, donmuş aliquot de kullanılabilir, ancak etkinliği düşük olacaktır.
  4. 1,250 x g (ile yavaş hızlanma ve yavaşlama) 30 ° C'de 90 dk için plaka santrifüj kapasitesi. O zaman, 37 ° C'de % 5 CO2 ile 4 h için kuluçkaya
  5. İsteğe bağlı: kültür ortamının 2 mL taze orta içeren ilgili sitokin (M-CSF veya GM-CSF) ve kültür 37 ° C'de % 5 CO2 ile değiştirin İkinci gününde kültür ortamının 2 mL kaldırmak ve 2 mL taze toplanan virüs ("süpernatant 2") ile (adım 6,3-6.4) bütün enfeksiyon yordamı yineleyin.
    Not: Bu adımı enfeksiyon etkinliğini artırabilir. Sonra ikinci enfeksiyon hücre türü ve hedef protein ve deneyimlerimize bağımlı iyileşme % 30 artış verimliliği için hiçbir gelişme hiç değişebilir.
  6. Yapışık olmayan hücreleri 15 mL santrifüj tüpü aktarmak ve toplamak 500 x g 5 min (4 ° C) için de spin. Süpernatant atmak.
  7. Hücre Pelet M-CSF veya GM-CSF ile kültür ortamının 10 ml resuspend, hücreleri 10 cm doku kültürü tedavi Petri kabına yerleştirin ve 37 ° C, % 5 CO2kültür. En iyi 10 cm yemek için hücre sayısı dır 5 – 10 x 106 için BM kaynaklı makrofajlar ve 10-15 x 10 BM kaynaklı dendritik hücre için6 .
    Not: Daha küçük yemekler veya tabak kullanılabilir ancak cep numaraları buna göre ayarlanması gerekir.
  8. İzleyin makrofaj ve dendritik hücre yetiştirme ve farklılaşma Protokolü 4 ve 5 adımda anlatılan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinyal adaptör proteinlerinin enzimatik herhangi bir etkinliği olmayan genellikle küçük proteinlerdir. Sahip oldukları çeşitli etkileşim etki alanları veya diğer proteinler için bağlayıcı arabuluculuk motifleri Tirozin kinaz, fosfatazlar, Ubikuitin Ligazlar ve diğerleri de dahil olmak üzere sinyal iletimi içinde21dahil. Bu iletişim kuralının işlevselliğini gösteri için myeloid hücre adaptörleri PSTPIP2 ve OPAL1 seçildi. PSTPIP2 inflamatuar yanıt22...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Faiz hedef hücrelerdeki protein önemli bir adım biyolojik çalışmalar birçok türde ifadesidir. Farklılaştırılmış makrofaj ve dendritik hücreler retroviral iletim teknikleri ile standart transfection transfect zordur. Bu farklılaşmış hücreler transfection kemik iliği ataları, onlar zaten istenen yapı taşır farklılaşma tarafından takip retroviral iletim ile atlayarak ektopik cDNAs ifade bunları sağlayan kritik bir adımdır hücre tipleri. Bu yöntemin başarılı kullanım örneği bizim son yayın25de bulunab...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser tarafından Çek Bilim Vakfı (GACR) (proje numarası 16-07425S), Charles Üniversitesi Grant Ajansı (Saung) (proje numarası 923116) tarafından ve kurumsal finansman Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden, Çek Bilimler Akademisi tarafından desteklenen Cumhuriyeti (RVO 68378050).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD15028
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD10270Medya desteği için
KHCO3Lachema, Brno, Çek CumhuriyetiN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)A9434
PenisilinBB Pharma AS, Prag, Çek CumhuriyetiN/APENICILIN G 1,0 DRASELN & Aaute; SOL' BIOTIKA
StreptomisinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)S9137Streptomisin sülfat tuz tozu
GentamisinDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, Çek CumhuriyetiN/A Polietilenimin
, doğrusal, MW 25.000Polyscience, Warrington, PA, ABD23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ABD)E5134
PBSIMG ASCR, Prag, Çek Cumhuriyeti'ninmedya tesisi tarafından kurum içinde hazırlanmıştır.N/A
APC anti-fare/insan CD11b Antikoru, klon M1/70BioLegend (San Diego, CA, ABD)101212akış sitometrisi analizi
PE anti-fare F4/80 Antikor, klon BM8BioLegend (San Diego, CA, ABD)123110akış sitometrisi analizi
APC anti-fare CD11c Antikoru, klon N418BioLegend (San Diego, CA, ABD)117310akış sitometrisi analizi
M-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, ABD)315-02
GM-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, ABD)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABDH1398akış sitometrisi analizi 1-2 ve mikroda kullanım; g/mL

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik li i K kenli MakrofajlarRetroviral Transd ksiyon ProtokolAk Sitometrisi AnaliziMikroskopi G r nt lemePlatinum Eco paketleme H creleriKemik li i zolasyonuM CSF DiferansiyasyonuGM CSF Diferansiyasyonu

İlgili makaleler