Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
N6- isopentenyladenosine RNA değişiklikleri işlevsel olarak farklı ve prokaryot ve ökaryotlar arasında son derece korunmuş. En son derece korunmuş N6- isopentenyladenosine değişiklikler biri A37 konumunu tRNA bir alt oluşur. Bu değişiklik çeviri ve sadakat tRNA benzeşim ribozom artırarak artırır. Mutasyon bu değişiklik ökaryotlarda sorumlu enzim mitokondrial disfonksiyon ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarında ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat özgüllüğü ve biyokimyasal faaliyetleri Bu enzimlerin anlama normal ve patolojik ökaryotik biyoloji anlamak için önemlidir. Yöntemleri çeşitli bir dizi6A değişiklikler ben karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Burada olduğunu isopentenylation Mod5 tarafından algılanması için doğrudan bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem RNA'ların kuluçka ardından RNase T1 sindirim ve ben6A değişiklikleri algılamak için 1 boyutlu jel elektroforez analiz bir rekombinant isopentenyl transferaz ile kullanır. Buna ek olarak, bu protokolün diğer RNA enzimler karakterize etmek için potansiyel uyum ele alınmıştır.
Giriş
En azından 163 ayrı posttranscriptional RNA değişiklikler, farklı ve içerik bağımlı işlevler için RNA'ların veriyor, doğrudan RNA yapısını etkileyen ve diğer RNA'ın etkileşimleri etkileyen bu değişiklikler ile tespit edilmiştir molekülleri1,2. Sayısı ve çeşitliliği RNA değişiklikler için takdir arttıkça, güvenilir bir şekilde RNA Modifikasyon ve onları katalizler enzimler sorguya çekebiliriz deneyleri geliştirmek için önemlidir.
TRNA, bitişik Anti-kodonu 3' yan3,4temel 37 at tespit edilmesi için ilk RNA değişiklikler oluşur.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Protokol Ref. 24uyarlanmıştır.
1. RNA ve enzim ilgi elde etmek
- Kullanım vitro dahili 32ile P etiketli RNA transkripsiyonu ve rekombinant His6-Mod5 ifade ve E. coli, yukarıda açıklanan24olarak gelen saf.
- Tanıtmak vitro transkripsiyonu RNA'ların (Bölüm 3) T7 RNA polimeraz etiketlenmemiş ATP, UTP, CTP, GTP ve jel saf, etanol çöktürülmüş α-ATP, 10 µCi huzurunda kullanarak 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1 mM EDTA) resuspended ve-80 ° C'de depolanan 24.
- Alternatif olarak, piyasada bulunan fl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mod5 Tirozin ile inkübe tRNA ya da serin tRNA varlığı veya yokluğu DMAPP. Değişiklik reaksiyon ürünleri hangi tüm guanosines bir 3' guanozin monophosphates (GMP)24 (Şekil 1) bırakarak 3' sonu cleaves RNase T1 sindirilmiş. RNA'ların tam sindirim, sonra bir % 20 polyacrylamide jel denaturing çözümlenir radiolabeled parçacıkları (Şekil 2A), tahmin edilebilir bir desen oluşturur. RNA DMAPP bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücresel ve organizma işlevinde her zamankinden daha fazla önemli ve farklı rolleri oynamak için gösterilecek RNA değişiklikler devam. Bu nedenle, enzimler değiştirme RNA sorgulamaya deneyleri gelişimi biyoloji temel yönlerini daha iyi anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Bu iletişim kuralı Mod5 tRNA değişiklik etkinliği karakterize etmek için yüksek çözünürlüklü vitro tahlil açıklar.
Bu iletişim kuralının isopentenylation bir doğrudan ve kolay yorumlanabilir okuma sağlayan far.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
İfşa için hiçbiri.
Teşekkürler
Dr David Engelke onun rehberlik ve bu el yazması üzerinde yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. PİJAMA - Ball State University laboratuvar başlangıç fonlar; DAB - 1R15AI130950-01 vermek.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler< / güçlü > | |||
| UreaGel Konsantresi | Ulusal Teşhis | EC-833 | Bir kitin parçası olarak |
| UreaGel Seyreltici | Ulusal Teşhis | EC-833 | Bir kitin parçası olarak |
| UreaGel Tampon | Ulusal Teşhis | EC-833 | Bir kitin parçası olarak |
| 10x TBE | Ulusal Teşhis | EC-833 | Bir kitin parçası olarak |
| Amonyum persülfat (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N, N, N ve asal;, N ve asal;-Tetrametiletilendiamin (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris tabanı | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Borik asit | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Kimyasal | 1186-30-7 | |
| Süper RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodyum asetat | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Ksilen siyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Ekipman ve Malzemeler< / güçlü> | |||
| kısa cam plakalar (20-40 cm G x 40 cm U) | The Gel Company | ||
| Uzun cam plakalar (20-40 cm G x 40 cm U) | The Gel Company | ||
| Dikey jel aparatı | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL tek kullanımlık şırınga | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Paslanmaz çelik bağlayıcı klipsler | Idea Scientific | 1066 | |
| Fosfoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Streç film | (yerel bakkal) |
Kaynaklar
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guid....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
