Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Birçok çalışma alt hücresel veya sinaptik düzeyinde nöron-astrocyte diyalog nöronal işlevleri ve sinaptik iletimi nasıl olabilir anlatmıştık. De astrocytes nöronal aktivite çevreleyen duyarlıdır kurulur; Aslında, onlar için glutamat, GABA, asetilkolin ve ATP (daha önce yayımlanmış değerlendirmeleri^2,3,4bakınız) de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin var. Buna karşılık, astrositik ensheath sinaptik öğeleri ve etkisi nöronal aktivite var ve extrasynaptic sitelerdeki ekstraselüler iyonik homeostazı düzenleyen ve çeşitli faktörler veya vericileri glutamat, D-serin ve ATP gibi serbest işler ^{5 , 6 , 7}.

Astrocytes Ayrıca ağ düzeyinde nöronal fonksiyon modüle fikir, astrositik kaplin dağınık şekilde düzenlenmiştir ve karşılık gelen nöronal segmentasyon alanlarda açık anatomik tarafından karakterize kanıtlarla ortaya çıkmıştır Bölünebilme (gibi alanlarda duyusal temsilcilikleri ile), astrocytes diğer astrocytes aynı işlevi yerine sadece o kadar da yakın hizmet veren çift gösteren. İçinde varil korteks veya olfactoty glomeruli, astrocytes arasındaki iletişimi varil ya da glomeruli içinde çok daha güçlü ise yanal üstün olive, mesela en astrositik ağları uygun tonotopic eksen⁸' e, odaklı ve zayıf bitişik olanlar^9,arası¹⁰. Her iki durumda da, astrositik ağlar glomerule veya varil^9,10merkezine doğru odaklı vardır.

Biz son zamanlarda astrositik faaliyet nöronal ateş konsantrasyonu hücre dışı Ca^{2 +} azaltarak gelen gösterdi ([Ca^{2 +}]_e), S100β, bir Ca^{2 +}sürümü ile muhtemelen-protein¹¹bağlama. Çekirdek (NVsnpr, masticatory hareketleri üretiminde önemli bir rol oynamaktadır düşünülen), sonuçları aslında trigeminal rhythmogenic nöronların trigeminal ana duyusal sırt kısmında bir popülasyondaki sunuldu bu etki bu Bu nöronlar ritmik ateş etmeye [Ca^{2 +}]_e^11,12azalır tarafından teşvik bir kalıcı Na⁺ geçerli bağlıdır. Bu nöronlar ritmik ateş etmeye "fizyolojik" girişleri uyarılması veya yapay [Ca^{2 +}]_eazalma elicited. Biz daha fazla astrositik kaplin nöronal ritmik ateş¹için gerekli olduğunu gösterdi. Bu olasılığını astrositik ağlar nöronal aktivite nerede senkronize ve koordine sinirlari belirli işlevsel etki alanları oluşturmak kaldırdı. Bu hipotezi değerlendirmek için ilk ciddi bir şekilde NVsnpr içinde bu ağların kuruluş belgelemek için bir yöntem geliştirmeye ihtiyacımız vardı.

Astrositik ağlarda önceki çalışmalar çoğunlukla kaplin cep telefonu numarasını ve yoğunluğu ve bölgeyi açısından ölçüde anlatmıştık. Astrositik ağlar şekli ve boya-kaplin yönünü değerlendirmek için girişimleri çoğunlukla iki eksen (x ve y) varil cortex⁹, hipokampus^13,14, boyunca ağların boyutu karşılaştırarak gerçekleştirilmiştir ¹⁵, talamus¹⁶, yanal üstün zeytin⁸, koku glomeruli¹⁰ve korteks¹⁴barreloid alanlarında. Yöntem tanımlamak burada bir ağ etiketli hücrelerinin tarafsız sayıları ve çevrenin onlar kapağı bir tahmin sağlar. Ayrıca bir ağ içinde bağlantı tercih edilen yönünü belirtin ve tercih edilen yönlendirme merkezi çekirdeği veya farklı bir yöne doğru olup olmadığını değerlendirmek için araçlar geliştirdi. Önceden kullanılan yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu iletişim kuralı organizasyon ve dorsal trigeminal ana duyusal çekirdeği gibi bilinen bir açık anatomik var mı yapılarda astrositik ağlar yönünü açıklamak için bir yol sağlar. Bölünebilme. Yukarıdaki çalışmalarda, ağ yönlendirmesini şekil zaten belgelenen yapının kendisi bir ilişki olarak açıklanan (Örn., varil korteks, talamus barreloid katmanlar hipokampus ve korteks, glomeruli içinde olfaktör ampul, vb). Buna ek olarak, farklı koşullar altında ortaya yönelimleri kaplin karşılaştırmalar için vektörel analiz sağlar. Bu parametreler ağ çekirdek içindeki konumuna göre değişiklik olup olmadığını çözümlemek için Ayrıca her ağ referans olarak çekirdek sınırları değiştirmek için bir yöntem geliştirdi. Bu araçların kolayca diğer alanlar eşleşmiş hücre soruşturma ağlar için adapte edilebilir.

Tüm yordamlar tarafından Kanada Sağlık araştırma enstitüleri kuralları abode ve Montreal Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. sıçan Beyin dilimleri hazırlanması

1. 1 litre sükroz tabanlı bir çözümü (Tablo 1) ve standart yapay beyin-omurilik sıvısı (aCSF) (Tablo 2) 1 litre hazırlamak.
2. % 95'i O₂ ve %5 CO₂ (carbogen) için 30 dk karışımı ile sükroz tabanlı çözüm çözüm soğuk ama tamamen donmuş olana bu yaklaşık 30 dk,-80 ° C'de yerleştirmeden önce kabarcık. Bu buz gibi sükroz beyni Dilimleme Kesim tampon olarak kullanın. Dondurucudan kaldırıldıktan sonra buz üzerinde tutun.
3. ACSF carbogen tüm deneyi ile kabarcık. Bu çözüm için dilim depolama ve yama sıkma ve biocytin-dolgu astrocytes yapıldığı perfusing tampon olarak kullanın. En kısa zamanda onlar kesilir Beyin dilimleri yatırmak odası tutan bir dilim kurtarma hazırlayın.
   Not: Dilim kurtarma holding odası özel yapım olabilir ve aslında bir küçük iyi bir kafes içinde alttan carbogen getirmek için bir tüp takılı olduğundan aCSF ile dolu büyük bir kuyu içinde alt ile oluşur.
4. 15 - için 21-bayat Sprague-Dawley rat herhangi bir seks ya da zorlanma özel önyargı olmadan kullanın. Hayvan isoflurane (isoflurane bir anestezi indüksiyon odasında 1 mL) ile anestezi. Anestezi derinliği hafifçe arka pençe veya kuyruk hayvan pinching tarafından kontrol edin.
5. Fareyi kullanarak bir giyotine başını kesmek, onun kafatası makasla kesme ve beyin kafatası düz bir spatula ile hızlı bir şekilde kaldırmak.
6. 30 s ve transfer hakkında kendisine (Çözümle) bir petri çanağı için buz gibi sükroz tabanlı çözüm beyinde daldırma. Bir jilet ile anterior ve posteiror kesitli için alana kısımları kaldırmak kesme transvers düzlemde dilimler.
7. Beyin dokusu rostral kendi tarafında kalan bloğunu tutkal ve beyin dilimleri (350 µm kalınlığında) bir vibratome kullanarak sükroz tabanlı ortamda kesmek için devam edin. O zaman, carbogenated aCSF, oda sıcaklığında (RT) kadar kullanılmak üzere hazır dolu odası tutan bir kurtarma toplanan dilimleri transferi (en az 1 saat kurtarma için izin).
   Not: Alanındaki son gelişmeleri uzun süreli kuluçka kadar izin 24 h vitro beyin dilim koşulları¹⁷.

2. Sulforhodamine 101 Astrocytes (SR-101) etiketleme

1. Önceden bir su banyosu ile 34 ° C ısı ve iki dilim kuluçka odaları yerleştirin. Bir dilim kuluçka chambers 1 mikron içeren aCSF bir çözüm ile doldurmak SR-101 ve diğer sadece aCSF ile doldurun.
2. 1 µM içeren kuluçka odasında dilimleri kuluçkaya SR-101 20 min ve o zaman transferi onlara ikinci kuluçka odası aşırı SR-101 kimden doku dışarı durulama için. 20 dk için kuluçkaya izin veya daha 34 ° C'de, o zaman tutmak onlar kadar RT, dilimler içeren kuluçka odası¹⁸gerekli.

3. astrocyte yama ve Biocytin dolum

1. Bir dilim seçin ve mikroskop kayıt odasında yerleştirin. Astrocytes patch, elektrotlar 4-6MΩ potasyum glukonat dayalı bir çözüm ile dolu bir direnç ile kullanmak için (bkz. Tablo 3).
2. Görsel rehberlik ve bir micromanipulator kullanarak altında kayıt elektrot bir SR-101-etiketli astrocyte Şekil 1' de gösterildiği gibi doğru yönlendirin. Onlar daha fazla zarar görmüş veya bağlantıları komşu hücrelere kaybetmiş olasılığı olduğundan dilim yüzeyde bulunan hücreleri kaçının.
3. Biocytin doku kaçağı önlemek için yama pipet eklendi pozitif basınç en aza indirmek ve yalnızca yamalı olabilir astrocyte yakın olduğunda uygulanacak (0,1-0.4 mL şırınga 1 ml).
4. Yama önce pipet ve onun kapasitans uzaklığı ayarlayın. Doğru ve hassas voltaj komutları için deneyler¹⁹kritik olduğundan sıvı kavşak potansiyeller için düzeltin.
5. Pipet yeterince pozitif basınç nedeniyle depresyon gözlemlemek için astrocyte yakın hareket. O zaman, pozitif basınç kaldırmak ve yavaş yavaş bazı negatif basınç uygulayın. -70 için astrocyte kelepçe mühür 100 MΩ ulaştığında mV. 1-3 GΩ mühür ulaşıncaya kadar bekleyin. Hücre içine breaking kadar negatif basınç uygulamaya devam. Astrocytes çok hassas olduğundan negatif basınç uygularken dikkatli olun.
6. Yamalı hücresinin elektrofizyolojik özelliklerini değerlendirmek. Gerilim tipi kelepçe modunda, tüm hücreli akım-gerilim protokolü için 110 -120 değişen 600 ms süresinin bir rampa gerilim komutla gerçekleştirmek mV. Geçerli-kelepçe modunda 1000 ms geçerli adımları 100 PA -1 den 1 nA, tüm hücreli kayıtları örnekleme oranı için enjeksiyon 10 kHz olduğu bir adım IV protokol gerçekleştirin.
   Not: Astrocytes her türlü ( Şekil 1Badımında gösterildiği gibi) düzeltme ve membran depolarizasyon (Şekil 1 c) ateş yok Aksiyon potansiyeli olmayan bir doğrusal akım-gerilim profilini göster. İstirahat membran potansiyeli (RMP)-meli var olmak istikrarlı ve için - 60mV olumlu değil. Bazı beyin bölgelerde astrocytes RMP içinde NVsnpr daha hyperpolarized.
7. Astrocyte 30 dk içinde bir adım IV protokolü her 5 dk gerçekleştirirken diffüz biocytin izin verir.
8. Geri çekmek ve yama pipet dikkatle yamalı astrocyte zarar vermeden bağlantısını kesin ve hemen pipet uzaklığı kayıt odadan çekmeden önce dikkat edin. Bu değeri membran potansiyeli kayıtlarından çıkarma.
9. Beyin dilim yamalı astrocyte üzerinden izleyici tüm ağa eşleşmiş hücrelerinin Yayilim izin vermek için en az 15 dk (ek 30 dk enjeksiyon için) kayıt odasında dinlenmeye bırakın.
   Not: bir ağ eşleşmiş hücre ortaya çıkarmak için sadece tek bir hücre faiz çekirdeğinde uygulanması. Başarılı bir yama elde etmek için birden çok deneme gerekiyorsa, davayı iptal et ve kontralateral tarafında veya başka bir beyin dilim yama çalışın.
10. Dilimin hangi tarafı yukarı bakacak şekilde tanımlamak için dokusunda bir işareti veya kesi yapmak ve dilimi ilk normal aCSF, o zaman %4 paraformaldehyde (PFA) bir çözümde içeren petri kabına aktarın. 4 ° C'de dilim gecede kuluçkaya.
    Dikkat: İngiltere'de yılın son derece zararlıdır. Koruyucu ekipman havalandırılmış bir mahallede kullanın. PFA ile temas halinde olan tüm malzemeler (fırçalar, tüpler, vb) odası, kuluçka odası veya taze doku kaydetmek için kullanılan diğer malzemeler tutan kurtarma ile değil emin olun.

4. Biocytin Vahiy

1. Vahiy ile floresan streptavidine
   1. Beyin yıkama RT., 0.1 M fosfat tampon serum (PBS) içinde 2 x 10 dk dilimler O zaman, biocytin bir fluorophore ile % 4 non-iyonik deterjan RT. 4 h için PBS içinde 1/200 seyreltme, Birleşik streptavidine ile beyin dilimleri kuluçka tarafından ortaya
   2. RT, 0.1 M PBS beyin dilimler 3 x 10 dk yıkayın ve bölümleri cam slaytlara bir sulu montaj orta kullanarak bağlayabilirsiniz. Yukarı doğru coverslip enjekte edildi taraf slaytları yerleştirin ve onları tırnak-cila ile mühür.
2. Vahiy ile DAB
   Not: DAB (3,3-diaminobenzidine) vahiy floresans kullanıldığında kullanılabilir. Bu durumda, yalnızca bir vahiy yöntemi karşılaştırmaları yapmak için istihdam edilmelidir.
   1. 3 x 10 dk içinde RT. adlı PBS Beyin dilimleri RT. 1 saat₂O_%2 0.5 PBS + H dilimleri kuluçkaya yıkama
   2. PBS, RT. dilimler 3 x 10 dk durulama O zaman, kuluçkaya dilimleri PBS ve %0,1 non-iyonik deterjan + avidin-biotin karmaşık peroksidaz standart boyama seti reaktifler 1/100 RT. 24 saat oluşan bir çözümde avidin-biotin karmaşık boyama
   3. PBS RT, dilimler 3 x 10 dk durulama, onları PBS bir çözümde kuluçkaya + RT %0.05 20 dk için DAB ve onları PBS bir çözümde transfer + %0,05 + H₂O_%2 0.5 DAB.
      Dikkat: DAB son derece zararlıdır. Koruyucu ekipman havalandırılmış bir mahallede kullanın. Zaman dilimleri içinde PBS aktarılır renk reaksiyonu durdurulur.
   4. PBS RT, dilimleri 5 x 10 dk durulama, bölümleri (yüz yukarı doğru enjekte edildi taraf) cam slaytlarda takma ve onlara bir slaytta tezgah gecede 34 ° C'de kurutma makinası
   5. Ksilen 1 dk 1 dk içinde banyo ile % 70, % 95'i ve % 100 ve sonunda birkaç alkol hamam cam slaytlarını daldırın.
   6. Orta montaj bir Toluen-sentetik reçine bazlı kullanarak cam slaytlar bağlayın. Coverslips slaytlar üzerine yerleştirin ve onları tırnak vernik ile mühür.

5. ağ görüntüleme

1. Astrositik ağları tarama confocal mikroskop 20 X ve 4 X hedefleri (veya ağ nerede tüm çekirdeği görselleştirmek için uygun bir amaç ile) donatılmış kullanarak görselleştirmek ve fluorophore tespit etmek için bir lazer (Bu durumda, Alexa-594 olduğunu kullanılan).
2. 20 X büyütme etiketli hücre ağ yığınını z olun 12.5 μs/piksel hızı tarama ve 800 x 800 piksel çözünürlük kullanın.
   Not: tüm ağ görüntü için birden çok yığınları genellikle gereklidir ve yığın sayısından her ağ için ayarlanması gerekiyor. Çözünürlük ve inceden inceye gözden geçirmek hız, tüm veri görüntü için aynı ayarları kullandığınızdan emin olun değiştirilebilir.
3. 4 X büyütme ağ ve faiz bölgesinin görüntülerini almak için kullanın.
   Not: 4 X görüntüleme ilgi içinde çekirdek ağ konumunu belirlemek için kullanılır. Her zaman alanındaki iletilen ışık görüntü. Bu görüntü confocal floresan görüntü çekirdeğinde kenarlığını belirleyemiyorsa faydalı olacaktır.

6. görüntü analizi

1. Veri hazırlama
   1. Kullanma bilgisayar yazılımı ImageJFIJI (https://fiji.sc/ indirebilirsiniz). Dosyayı açıp "Biyo-formatları içe aktarma seçenekleri" penceresinde Tamam'ı tıklatın.
   2. Sadece son z-yığın için (Şekil 2A) gerekli optik dilimler içeren bir z yığın yeniden tanımlamak için "Yığın" düğmesi araç çubuğunda tıklayın (bulmak için önce stk seçin | Z Projesi). "Max yoğunluğu" projeksiyon yazın (Şekil 2A) ayarını seçin. Dosyayı kaydedin ve "dosya yığını" adını verin.
   3. Görüntü dosyası birkaç kanalları içeriyorsa, yalnızca Kanal astrositik ağ görüntüleme ile tasarruf etmek için split (görüntü | Renk | «««Split) kanalları.
   4. Görüntü piksel ayarlarını kontrol edin [resim | Özellikleri | Piksel ("1" piksel boyutu için ile)].
   5. Çıkarma arka plan aracını kullanın (işlem | Arka plan çıkarmak) biocytin etiketleme arka plan çıkarmak. Genellikle 50 piksel (Şekil 2B) ayarlanır haddeleme topu yarıçapı ayarlamak için Önizleme işlevini kullanın.
   6. Kaldır outliers aracını kullanın (işlem | Gürültü | Outliers kaldırmak) çıkarma arka plan adım takip gerekli ise. "Parlak" "Hangi Outliers" ayarında (Şekil 2C) seçin. RADIUS ve eşik ayarlamak için Önizleme işlevini kullanın. Verileri, Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi bulanıklık bu yana bu araç ile dikkatli ol.
      Not: Bu araç streptavidine belirsiz mevduat tarafından ( 2B şekil ve 2 C beyaz ok işlemden, önce ve sonra sırasıyla görüldüğü gibi) neden olduğu küçük noktalar kaldırır.
   7. Eşik ayarlayın (görüntü | Ayarlamak | Eşik). "Varsayılan" ve "siyah-beyaz" modu (Şekil 2E) seçin. Tıkırtı üstünde "uygulamak".
      Not: Otomatik ayarlama kullanılabilir, ancak el ile ayarlama iki kaydırma çubuklarıyla tercih edilir. Bu adım, etiketli hücreleri kaybetmeden maksimum gürültüyü azaltmak için amaçtır.
   8. İkili işlem aracı ile ikili bir resim görüntü dönüştürmek (işlem | İkili | İkili olun) Şekil 2Fiçinde gösterildiği gibi. Dosyayı TIFF dosyası olarak kaydedin ve "ikili dosya" adını koy.
2. Hücre sayımı
   1. Kontrol belgili tanımlık koyma ölçü işlevinin (Analyze | Set ölçüm). "Centroid" seçeneğini seçin.
   2. "İkili dosyada" "Parçacıklar analiz" aracını kullanın (Şekil 3A) üretilen önceki adımda (Analyze | Parçacık analiz) (Şekil 3 c solda). "Ana hatlarıyla" "Show" ayarında (Şekil 3 c) seçin. Bu algılama (Şekil 3B) sonucunu gösterir yeni bir dosya oluşturur.
   3. Parametreleri ile oynamak: boyutu (yalnızca hücreleri bulmak için 30 ila 6000 arasında değerleri kullanın) ve (bir aralığını belirlemek için 0-1, hangi "1" tam bir daire ve tanımlar "0" rasgele bir şekil) döngü algılama (Şekil 3 c,) bölümü yaptı iyileştirmek için. Algılama yanında tıkırtı "OK" çalıştırın.
      Not: Algılama aşağıdaki iki tablo görünür: algılanan hücreleri sağlayan "Özet" başlıklı 1) bir tablosunun ve "Sonuçlar" (Şekil 3 c, doğru bölümü) başlıklı 2) bir tablo x - ve y-koordinatlarının her hücrenin sağlar.
   4. Değerleri kopyalamak ve bir elektronik tablo uygulaması yapıştırabilirsiniz. Bu tablo "algılama tablo" adı altında kaydedin. Bir komplo algılanan hücre içeren bir dosyayı da (Şekil 3B) görünür. Bu dosyayı "algılama dosya" adı altında bir TIFF dosyası olarak kaydedin.
   5. Analiz parçacıklar aracı ile tek bir hücre oldukları için çok yakın olarak birbirlerine bir grup 2 veya daha fazla etiketli hücre ağ algılanmazsa, havza aracını kullanın (işlem | İkili | Analiz parçacıklar uygulamadan önce dönüm noktası) ikili görüntü aracı ve analiz parçacıklar adımları yeniden.
      Not: Havza Aracı 1 piksel arasında son derece yakın hücreleri geniş bir ayırma oluşturur. Bir hücre sayaç eklentisi can var olmak kullanılmış ne zaman etiketleme kesin ve el ile yapılabilir.
3. Astrositik ağ alan ölçme
   1. Ağlar yüzey alanı ölçmek için görüntü J. kullanarak algılama dosyasını kullanın
   2. Çokgen seçim aracını (sol tıkırtı üstünde seçmek için araç çubuğunda düğme) tüm hücreleri bağlayan bir çokgen ağ (Şekil 4A) dış çevre içinde bulunan izlemek için kullanın. Çokgen izleme başlatmak için sol tıklayın ve kapatmak için sağ tıklatın.
      Not: Bu Çokgen faiz (ROI) bir bölge olarak tanımlanır ve yüzeyi ağ yüzey alanını belirlemek üzere ölçülecek.
   3. Küme ölçüm penceresini açın (Analyze | Ölçüm ayarla) ve "Alan" seçeneğini belirleyin. ROI Yöneticisi'ni açın (analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi) (Şekil 4B). Ardından, '' ekle '' (Şekil 4B) tıklatarak ROI Yöneticisi'nde izlenen Çokgen ekleyin ve ölçüm ROI Yöneticisi'nde '' ölçü '' tıklayarak çalıştırın.
      Not: Alan ölçüm bir tabloda görüntülenir ve piksel cinsinden ifade edilebilir. Bu değeri bir değer μm kalınlığında²elde etmek için kullanılan mikroskop için dönüştürme faktörü ile dönüştürmek unutmayın.
4. Ana yön vektör belirlenmesi
   1. Yamalı hücre belirlenmesi
      1. ImageJFIJI içinde yığın dosyasını açın ve daha güçlü etiketleme şiddeti üzerinde (Şekil 4 c) bağlı olarak yığın dosyasını yamalı hücrede tanımlamak. Sonra bir elektronik tablo uygulamasında "algılama tablo" adlı dosyayı açın ve yamalı hücre ve karşılık gelen koordinatları ile ilişkilendirilen numarasını bulun.
      2. İse doğru yamalı hücre belirlemek, biocytin para yatırma eşleşmiş hücre, ImageJFIJI, Çokgen aracını kullanarak görüntülü ağındaki daha yoğun nerede etrafı sarın ve yamalı hücre (Şekil 4 d) olarak bu duruma bakın.
      3. ROI Yöneticisi'ni kullanın (analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi). Sonra bir yatırım getirisi yamalı hücre konumu çizmek ve yatırım getirisi yöneticisine Ekle (bkz. Şekil 4B).
      4. Bir ölçüm ayarla (Analyze | Ölçüm ayarla) ve "Centroid" seçeneğini belirleyin.
      5. ROI Yöneticisi'nde izlenen çevrenin centroid koordinatlarını elde etmek için "ölçü"'ı tıklatın. Bu koordinatlar, bu belirli ağ için referans noktası olarak kullanın.
   2. Bilgi tutarlılığına çeviri
      1. Yamalı astrocyte referans olarak her hücre koordinatlarını aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
          
         İle: olarak koordinatları için belirli bir hücrenin; olarak koordinatları yamalı hücrenin (veya ağ başvuru noktası); ve yeni başvuru belirli bir hücre için koordinatları olarak.
         Not: yamalı astrocyte vektörlerinden hesaplanmasında önemli bir adım olduğunu yamalı astrocyte referans olarak her hücre koordinatlarını dile getirdi. ImageJFIJI kullanırken dikkatli olun herhangi bir görüntü için bilgi tutarlılığına görüntünün sol üst köşesinde bulunur.
   3. Ana vektör Tercihli yönünün belirlenmesi
      1. Aşağıdaki formül ile Tercihli yönlendirme ana vektörünü koordinatları hesaplayın:
         
         İle: () Tercihli yönelim; ana vektörünü koordinatları olarak ve yamalı ile elde edilen ağ her hücresini koordinatları olarak hücre olarak başvuru.
         Not: ağ her hücre için bir vektör yamalı astrocyte koordinatları göreli olarak belirlenir. Ağ Tercihli yönünü ana vektör bu vektörel çizimler toplamıdır.
      2. (Yukarıdaki formül kullanılarak elde koordinatları tarafından sağlanan) ana Yöneyin uzunluğu eksi bir yana (yamalı hücre koordinatlarını dahil değildir), ağ hücre sayısı bölün değerleri normalize ve arasındaki karşılaştırmaları etkinleştirmek için ağlar. Bu analiz şematik Şekil 5' te gösterilmektedir.
5. Faiz çekirdeği analiz ağlarda yerleşimini
   1. 20 X ve 4 X resim hizalama
      1. 4 X resim faiz (NVsnpr) çekirdeği her ağ konumunu belirlemek için kullanabilirsiniz. 4 X görüntüyü bir vektör resim editörü ile açın.
      2. 4 X görüntü seçin ve 5 tarafından çarparak boyutunu değiştirebilirsiniz. Boyutu penceresi üst yatay araç sağ kısmında yer alır. Örneğin, 4 X görüntü için örnek 800 x 800 piksel, örnekleme çözünürlüğü 4000 x 4000 piksel olarak değiştirmek (numune piksel olarak ayarlamak için "Belge ayarları" altında Dosya sekmesine gidin: dosya | Belge Ayarları). Dosyayı TIFF formatında ve bu "4 X yeniden boyutlandırılabilir" adı verin.
      3. Görüntü sol üst köşesi ile Adobe Illustrator belgesini sol alt köşesine hizalayın.
         Not: Yazılımın koordinatlarından bir sol alt köşesindeki başvuru noktası sağlar.
      4. Ağ 20 X görüntü açın. Çünkü onlar hizalamak daha kolay '' ikili dosya '' veya '' algılama dosyasını '' kullanın. O zaman, opaklık aracıyla yeniden boyutlandırılmış 4 X ile hizalamak için 20 X görüntü '' ikili dosya '' oynamak görüntü.
         Not: Üst yatay araç çubuğunda Opaklık araçtır.
      5. Hizalama olduğunda, seçin ve ölçü aracı görünecek şekilde pipet araç tutun ve sol araç çubuğunda seçin.
      6. 20 X koordinatları başvuru almak 20 X görüntünün sol üst köşesini tıklatın için ölçü aracını yeniden boyutlandırılmış 4 X gelin kullanım görüntü.
         Not: 20 X bilgi tutarlılığına (20XR Şekil5) olarak adlandırılır, bu koordinatlar çekirdeği çizim bir şematik her ağ konumunu ifade etmek için faydalı olacaktır.
   2. Normalleştirme ilgi çekirdeği
      Not: çekirdek (NVsnpr) bir normalleştirme bir dikdörtgen olarak verileri özetlemek için kullanılır. Adımları aşağıda açıklanmıştır.
      1. Açık 4 X ImageJFIJI dosyasında yeniden boyutlandırılabilir ve Çokgen aracı çekirdek (NVsnpr) için kullanılır. Çekirdek sınırları görülmesi mümkün değilse görüntü ile iletilen ışık kullanımı; Bu durumda, ilk yeniden boyutlandırmak hatırlıyorum.
      2. ROI Yöneticisi'ni açın ve çizilmiş yatırım getirisi ekleyin. "Ayarla ölçümü", '' sınırlayıcı dikdörtgen '' seçeneğini belirleyin.
         Not: "Sınırlayıcı dikdörtgen" seçeneği en küçük dikdörtgenin etrafında çizilmiş çekirdeği hesaplar.
      3. "Ölçü"'ı tıklatın.
         Not: BX ve BY, dikdörtgenin sol üst köşesine koordinatlarını içeren bir tablo görünür: '' dikdörtgen pozisyon '' ve genişlik ve yükseklik sağlar. BX ve BY vardır olarak adlandırılır sınırlayıcı dikdörtgen başvurusal koordinatlarını ve .
   3. Normalleştirilmiş çekirdek her ağ konumu ifade
      1. 4 X bilgi tutarlılığına ( Şekil5 siyah kare) her hücre koordinatlarını hızlı aşağıdaki formülü kullanarak:
         
         Nerede: 4 X ile hücre koordinatları başvurusal; vardır hücre koordinatları 20 X bilgi tutarlılığına (turuncu kare Şekil 5'); ve 20 X 4 X görüntü (20XR) başvuru noktası koordinatlarını vardır.
      2. (Mavi olarak Şekil 5) hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru içinde hızlı aşağıdaki formülü kullanarak:
         
         Nerede: olan hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru; 4 X hücre koordinatları başvurusal; vardır ve sınırlayıcı dikdörtgenin koordinatlar 4 X görüntü başvuru.
      3. Hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen genişliğinin yüzdesi ve aşağıdaki formülü kullanarak sınırlayıcı dikdörtgenin yüksekliği için başvuru dönüşümü:
         
         Nerede: olan hücre koordinatları genişliğinin yüzdesi ve yükseklik sınırlayıcı dikdörtgenin; olan hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru; sınırlayıcı dikdörtgen yukarıda iletişim kuralında; ölçülen genişliği ve sınırlayıcı dikdörtgenin yüksekliği yukarıda iletişim kuralında ölçülür.
      4. Aynı şekilde tüm ağlarda temsil etmek için dilim (sol veya sağ tarafına) yönünü dikkate alın. Verileri standart hale getirmek için bilgi tutarlılığına dilimin sol tarafında uygulanır. Sağ tarafındaki ağ koordinatlarını sadece x-koordinatları için aşağıdaki formülü uygulayarak sol tarafına aktarın:
         
         Nerede: x-koordinatı dilim; sağ tarafında olduğunu ve  olan yeni x-koordinat başvuru içinde dilimi sol tarafındaki ifade.
         Not: Alternatif olarak, ImageJFIJI resimde analiz önce ayna (görüntü | Dönüştürme | Yatayda ters çevir).
      5. Tercihli yönlendirme ana vektörünü koordinatları ifade etmek için hücre koordinatları (adım 6.5.3.1-6.5.3.4) ile aynı adımları izleyin.
         Not: Veri derleme olarak çekirdek (NVsnpr) bir dikdörtgen olarak tasarlanmış tek bir arsa koordinat yüzdelerle ifade sağlar.
6. Çalışmanın ana vektör Tercihli yön açısal fark
   Not: Bir astrositik ağının açısal fark Tercihli yönünü faiz çekirdeği merkezine doğru olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Tercihli Yön ( Şekil 5polisi, kırmızı hat) ağının ana vektör ile P yı C'ye bağlayan çizgi arasındaki açıdır açısal farkı ( Şekil 5' te α), hesaplama için PDC (bkz: üçgen Al-Kashi teoremi uygulanır iç metin Ek yöntemlerve Şekil 5 ).
   1. İlk olarak, aşağıdaki denklemi kullanarak bir Kartezyen başvurusal içine Pisagor teoremi uygulanması kullanarak farklı uzunlukta Hesapla:
      
      : Nerede P ve C koordinatlarını ve , sırasıyla, sınırlayıcı dikdörtgen başvuru (yukarıda hesaplanan) içinde.
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak radyan açısal farkı belirlemek:
      
   3. Açısal fark derece (Örneğin, derece fonksiyonu Excel yazılımı ile) dönüştürün.
   4. Dikey çubuk grafiklerde (Şekil 7C ve 7 D) komplo tarafından açısal farklılıklar derlemek ve Tercihli yönünü astrositik ağlar olup olmadığını belirlemek.

Beyin hücreleri arasında bağlantı statik ama oldukça dinamik olarak birçok faktör tarafından düzenlenmiş değildir. Açıklanan yöntemleri astrositik ağları farklı koşullar altında ortaya çözümlemek ve NVsnpr kuruluşlarındaki anlamak için geliştirilmiştir. Bu sonuçlar zaten yayımlanmış1olmuştur. Biz üç farklı koşullarda NVsnpr dorsal parçası tek astrocytes biocytin dolum yapılan: Ca2 +(koşullarında denetim yokluğunda herhangi bir stimülasyon), istirahat-ücretsiz koşulları ve elektrik stimülasyon takip çekirdek için proje duyusal lifler. Her koşul için astrocytes biocytin doldurmak için deneysel ayarları Şekil 6A-Csol tarafı içinde gösterilmiştir.

Ağlar biocytin etiketli hücre kontrol koşullarda gözlendi ve NVsnpr astrocytes istirahat arasında kaplin hücre bazal durumunu doğruladı. 11 test durumlarda ağları 11 ± 3 hücre (orta panelinde Şekil 6A, Şekil 6D) uzanan 34737 ± 13254 µm2 (Şekil 6E) bir alan üzerinde oluşan biocytin difüzyon gösterdi. Carbenoxolone (CBX, 20 mikron), gap kavşaklar, bir non-spesifik engelleyici bir bağımsız deney grubunda gözlenen etiketleme biocytin difüzyon boşluğu kavşaklar ve alımı sızdırabilirsiniz biocytin hücreleri tarafından değil bir sonucu olduğunu emin olmak için kullanılan yapıldı. önce yama yama pipet uygulanan pozitif basınç ekstraselüler uzaydan. CBX uygulanması banyo 2 ± 0.5 hücreleri (sağdaki bölmede 6A şekil, Şekil 6D; etiketli hücre sayısı azaltılmış Iman-Conover yöntemi, P 0.016; = Holm-Sidak testi, P 0.010 =) ve biocytin alan yayılmış 2297 ± 1726 µm2 ' ye (6E rakam; Iman-Conover yöntemi, P = 0.0009; Holm-Sidak testi, P 0,025 =).

Kalsiyum kaldırma--dan çevre etkisi düşük hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu connexins ve gap kavşak20,21,22ve bu açmak için bilinir çünkü astrositik ağlar test edildi NVsnpr kullanılabilir syncytium kadar açıp izleyici difüzyon boşluğu kavşak aracılığıyla en üst düzeye çıkarmak için bir büyük ve düzgün uyarıcı. Ca2 +içinde açığa çıkarılmıştır astrositik ağlar-ücretsiz koşulları (n = 10) hücreleri daha büyük bir sayı 37 etiketli ± 10 hücrelerle (orta panelinde Şekil 6C, Şekil 6D; denetim koşullarda ortaya ağlarından daha gösterdi Iman-Conover yöntemi, P 0.016; = Holm-Sidak testi, P < 0.001) 108123 ± 27450 μm kalınlığında2 (orta panelinde Şekil 6C, 6E rakam; alanı kapsayan Iman-Conover yöntemi, P 0,009; = Holm-Sidak testi, P = 0.001).

Kalsiyum tümüyle kaldırılmasını ortamından, elektrik stimülasyonu için faiz çekirdeği afferent girdilerin doğrudan ilgi nöronal devreler içerir daha fizyolojik bir uyarıcı karşılaştırılır. Sonuç olarak, bu tür bir işleme sonuçlarından gözlenen astrositik ağlar fonksiyonel etkileri ile ilgili yararlı bilgiler sağlayabilir. Örneğin, iki farklı yollar girişten belirli bir alanda kaplin hücrelerinin bazal devlet üzerinde farklı etkileri neden olabilir veya astrocytes çekirdeğini farklı alt bölümleri arasında bağlantı çıkarmak. Bizim devrede elektriksel stimülasyon 0.2 ms 2 saniye Tren kullanarak NVsnpr proje duyusal lifler bakliyat 40-60 Hz'de (n = 11) NVsnpr astrocytes göre unstimulated koşullarla 23 ± 6 hücreler arasında bağlantı artış üretilen (orta panelinde Şekil 6B, Şekil 6D; Iman-Conover yöntemi, P 0.016; = Holm-Sidak testi, P 0.012 =) 814174 ± 15270 μm kalınlığında2 (orta panelinde Şekil 6B, 6E rakam; bir alan üzerine yayılan Iman-Conover yöntemi, P 0,009; = Holm-Sidak testi, P = 0,004).

Bu iki tür stimülasyon, kalsiyum ortamdan çıkarılması ve elektriksel stimülasyon afferent girdilerin etkileri tüm CBX tarafından kesintiye. Bu durum astrositik ağlarda Ca2 +sadece 5 ± 1 hücreleri oluşur-ücretsiz aCSF ( Şekil 6C, Şekil 6Dsağ panelde; n = 4; Iman-Conover yöntemi, P 0.016; = Holm-Sidak testi, P < 0.001) ve duyusal lifler stimülasyon ile 9 ± 2 hücreleri ( Şekil 6B, Şekil 6D' doğru kapı aynası; n = 6; Iman-Conover yöntemi, P 0.016; = Holm-Sidak testi, P = 0.023). Ağ yüzey alanlarını da ile Ca2 +2 17987 ± 9843 µm düşürüldü-ücretsiz aCSF (Şekil 6E; n = 4; Iman-Conover yöntemi, P 0,009; = Holm-Sidak testi, P = 0,004) ve duyusal lifler stimülasyon ile 39379 ± 11014 µm2 (Şekil 6E; n = 6; Iman-Conover yöntemi, P 0,009; = Holm-Sidak testi, P 0.055 =).

Anatomik çözümlemenin yalnızca NVsnpr sınırları açıkça tanımlandığı görüntüleme, X 4 durumlarda hangi 9 10 ağlar için durum elde Ca2 +ile-ücretsiz aCSF ve 8 dışarı-in 11 ağlar elde edilen elektrik stimülasyonu ile. Tüm analiz astrositik üzerindeki ağların bir teorik NVnspr komplo en hücreleri ağlarda oluşan çekirdek sınırları içinde (7A rakamlar ve 7B, soldaki ve ortadaki panelleri) sınırlı gösterir. Altında Ca2 +-4 9 astrositik ağlar ücretsiz aCSF, yaymak için NVsnpr da bulunan motor çekirdeğini yönde NVsnpr dışında. 4 bu gibi durumlarda, etiketli hücreleri büyük çoğunluğu çekirdek için sınırlı. Etiketli hücreleri duyusal lifler elektriksel stimülasyon ile elde edilen ağlar daha sınırlandı. Sadece 2 ağları içinde yayılmış bir mediodorsal sınırı yanal supratrigeminal alanına ( Şekil 7Bkoyu yeşil ağ, soldaki ve ortadaki panelleri) çekirdek sınırları üzerinden genişletilmiş. İkinci durumda, kırmızı ağdaki (Şekil 7B, soldaki ve ortadaki panelleri) 2 astrocytes NVsnpr ventral bölümünü içine geçti.

Astrositik ağlar Tercihli oryantasyon ( Şekil 7A ve 7Bdoğru kapı aynası) vektör analiz kullanılan uyarıcı bağlı olarak farklı sonuçlar üretti. Nitekim, Ca2 +ile gözlenen astrositik ağları için-ücretsiz aCSF, vektörel çizimler Tercihli yönünün biri dışında tüm NVsnpr merkezine doğru yönlendirilmiş. Ancak, elektrik stimülasyonu ile gözlenen astrositik ağlar için tercihli yönlendirme vektörel çizimler, çoğunlukla çekirdek sınırları doğru odaklı idi. Bu hesaplanan açısal farklarına Ca2 +ile elde edilen astrositik ağlar arasında Tercihli yönde gerçekleşmiştir-ücretsiz aCSF ve o duyusal lifler elektriksel stimülasyon ile elde edilen. Altında Ca2 +-ücretsiz aCSF, dikey çubuk grafikler açısal fark dağılımı gösterdi etiketli hücre ağların en 12,7 derece ( 0 ve açısal fark 39,5 ± ortalaması ile 40 derece arasındaki açısal bir fark var Şekil 7C). Duyusal lifler elektrik uyarılması ile dağıtım daha düzgün ve ortalama açısal fark (99,5 ± 17 derece) önemli ölçüde farklıdır (Şekil 7 d; öğrenci t-testi, P 0.012 =).

Bu verileri analiz etiketleme bu biocytin farklı uyaranlara astrositik kaplin oransal etkileri ayırt etmemizi sağlar gösterir. Ayrıca, vektör analizi ile takip normalleştirilmiş bir çekirdek astrositik ağlarda eşleme boyut ve bu ağların anatomik organizasyon değerli bilgiler sağlar.

Şekil 1: bütün hücreli yama-kelepçe, astrocyte. (A) astrocytes NVsnpr içinde marker sulforhodamine 101 (SR-101) yüklenmesini etiketlenir. Bir SR-101-etiketli astrocyte soma yama pipet (beyaz kesikli çizgi) ile hedeflenmektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) depolarizing bir rampa Protokolü astrocyte pasif özellikleri değerlendirmek için gerilim-kelepçe (110mV -120) üzerinden gerçekleştirilir. (C) aksiyon potansiyeli akım tipi kelepçe modunda geçerli bakliyat iğne ile astrocyte içinde ateş eksikliği değerlendirilmesi. Bu rakam Condamine vd adapte (2018) 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: tedavi ve analiz ImageJFIJI yazılımı ile astrositik ağların. (A) Z-yığın oluşturma astrositik bir ağ üzerinden confocal görüntüleme. Sol üstten, Z-yığın penceresinde ImageJFIJI. (B) arka plan çıkarma işlemi. Sol, üst ImageJFIJI penceresinde arka plan çıkarma. Noktalı çember çıkarma arka plan komutu etkisini daha açık ne zaman nerede alan görüntüye vurgular A. (C) Kaldır aykırı işlem resimdeki göre. Bu işlem bir Alexa 594 birleştiğinde streptavidine belirsiz yatakları nedeniyle küçük noktalar kaldırır. Beyaz ok (Şekil 2B) önce mevduat göstermek ve (Şekil 2Csonra) komutu işlenmiştir. Üst sol köşede, ImageJFIJI aykırı penceresinde kaldırın. (D) Kaldır outliers parametreleri yetersiz bir ayarlama tarafından üretilen bulanıklaştırma efekti örneği. Sarı oklar bazı bulanık olan hücreleri gösterir. (E) işlem eşik ayarlayın. Sol, üst ImageJFIJI penceresinde eşik ayarlayın. Kaydırma çubuklarını eşik sinyali ayarlama üzerinde hareket. (F) ikili adım olun. Görüntü ImageJFIJI bir ikili dosya dönüştürülür. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: ImageJFIJI ile hücre astrositik ağlarda algılama. (A) ImageJFIJI elde edilen astrositik ağı ikili bir resim örneği. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) "ikili dosyada analiz parçacıklar işlemi uyguladıktan sonra elde edilen algılama dosya" göstermektedir. Şekilleri ile ilişkili sayıları kırmızı algılanan tüm hücrelere karşılık gelir. (C) bölümü yaptı: ImageJFIJI parçacıklar penceresinde analiz. Bu işlev ağ hücreleri ikili görüntü algılar. Algılanan hücreleri ve onların Döngüsellik boyutu ayarlanabilir. Tatmin edici bir sonuç elde edilir kadar kullanılacak numaralarını deneme-yanılma tarafından ayarlanmalıdır. Sağ Bölüm: analiz parçacıkları işlem tarafından oluşturulan algılama tablo. X ve Y sütunları görüntü tespit her hücre koordinatlarını listeler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: ağ alan analiz ve ImageJFIJI yamalı hücreye belirlenmesi. ImageJFIJI, bir yatırım getirisi Çokgen aracında kümesi takip (a) kullanarak ağ yüzey alanını belirlemek için kullanılacak olan hücreleri (kırmızı çizgi) algıladı. (B) YG ROI Yöneticisi içine eklenir. (C) hangi yamalı hücre (beyaz ok) onun biocytin etiketleme çarpıcı yoğunluğu nedeniyle kolayca tanımlanabilen bir astrositik ağ örneği. (D) örnek astrositik ağı nerede yamalı hücre tespit, ama daha yoğun bir alanda nerede açıkça etiketleme biocytin mevduat gösterir. Bir yatırım getirisi Bu alan çizilir ve yatırım getirisi Yöneticisi için eklendi. Kendi centroid hesaplanan ve vektör analiz için kullanmak için yamalı hücrenin konumu kabul. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: astrositik ağlar çözümlemesi için kullanılan farklı referentials diyagramı. Gri Meydanı Adobe Illustrator belgesini sol alt köşesi ile uyumlu hale getirilmesi için başvuru noktası 4XR ile 4 X görüntüdür. Turuncu çevrili beyaz kareyi başvuru noktası 20XR ile 20 X görüntüdür. Her iki görüntü birbirleri ile iletişim kuralında tanımlandığı gibi hizalanır. Sınırlayıcı dikdörtgen (mavi) NVsnpr (mor kesikli çizgi) tanımlar ve başvuru noktası (BR) ile yüzde olarak ölçeklendirilir. NVsnpr dorsal parçası theoric ortasına koyu mavi nokta (C) tarafından kapsamlıdır. Astrositik ağ yamalı hücre (siyah nokta, P) tarafından kapsamlıdır ve ana vektör Tercihli Yön (kırmızı çizgi). Her kesik çizgili siyah vektör astrositik ağının her hücrenin çizgidir. Açısal astrositik ağ (α) ağ (kırmızı çizgi) ana Tercihli yönünü ve yamalı astrocyte çekirdeği teorik merkezine bağlayan siyah çizgi arasındaki açı farktır. İç metin görüntünün üçgen NVsnpr (C), yamalı hücre ve Tercihli Yön (D) ana vektör teorik Merkezi tarafından kurulan PCD gösterilen 20 X bir zum olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: astrositik ağları farklı boyutlarda gösterilen farklı koşullar altında NVsnpr içinde biocytin etiketlenir. (A-C) Sola, deneysel durumu çizim bir şematik. Her koşulda, SR-101 tarafından etiketli bir tek astrocyte bütün hücreli kayıt için hedef ve biocytin (% 0,2) ile dolu. Orta sütunda: kontrol altına alınan astrositik ağları gösteren photomicrographs koşulları (A), (2 s trenler, 40-60 Hz, 10-300 µA, 0.2 ms Bakliyat) Vinci yolu elektriksel stimülasyon sonra (B); ve sonra perfüzyon ile bir Ca2 +-ücretsiz aCSF (C). Sağ sütun: astrositik ağları gösteren photomicrographs elde edilen aynı koşullar altında ama CBX varlığında (20 mikron) içinde belgili tanımlık banyo önce. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (D ve E) Dikey çubuk grafik sayısını gösteren birleştiğinde hücreleri ve yüzey alanı, sırasıyla, astrocytes yukarıda sunulan üç deneysel koşullar altında biocytin dolu ağların (A, B ve C) (yumurtadan) varlığı ve yokluğu (masif) CBX (20 ΜM). Veri ± SEM çoklu karşılaştırmalar (Holm-Sidak testi) demek gibi gösterilir: * P = < 0,05; ** P = 0.001 <. Bu rakam Condamine vd adapte (2018) 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: Karakterizasyonu NVsnpr ağlar altında Ca2 +-ücretsiz aCSF ve Vinci sistemi elektriksel stimülasyon ile. (A ve B) Sol: Tüm hücreleri 9 ağlarda etiketli dolu perfüzyon ile Ca2 +altında-ücretsiz aCSF (A) veya 8 ağları Vinci yolu (B) uyarıcı iken dolu, bir teorik NVsnpr çekirdeği (gri dikdörtgen) konumlarına göre çizilir. Her ağ (ve iletiyi hücreleri) farklı bir renkle gösterilir. Orta: her ağ sınırları. Her alanda nokta yamalı hücreyi temsil eder. Sağ: Tercihli yönünün her ağ ana vektör temsili. Nokta tercihli Yön vektörünü ok ve yamalı hücre temsil eder. (C ve D) Tercihli yönünün ana vektör ve altında yamalı hücre (dorsoventral eksen üzerinde % 25 ve % 50 medyolateral ekseni üzerinde bulunan) NVsnpr dorsal kısmı ortasına bağlayan düz bir çizgi arasındaki açısal farklar dağılımı iki koşul okudu. Ortalama açısal fark 39,5 ± Ca2 +12,7 derece oldu-17 derece doğru tercihli bir yönelim gösteren elektrik stimülasyonu ile çekirdeği ve 99,5 ± merkezine doğru tercihli bir yönünü gösteren ücretsiz aCSF çevre (öğrenci t-testi, P 0.012 =). Bu rakam Condamine vd adapte (2018) 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: kompozisyon beyin Dilimleme için kullanılan sükroz tabanlı çözümün. (*) = pH ve Osmolarite edildi 7.3 7.4 ve 300-320 için ayarlanan mosmol/kg, anılan sıraya göre.

Tablo 2: kompozisyon dilim muhafazası ve bütün hücreli kaydı için kullanılan aCSF çözüm. (*) = pH ve Osmolarite edildi ayarlanmış 7.3 7.4 ve 290-300 mosmol/kg, anılan sıraya göre.

Tablo 3: kompozisyon bütün hücreli kayıt için kullanılan iç çözüm. (*) = pH ve Osmolarite edildi ayarlanmış 7.2-7,3 ve 280-300 mosmol/kg, anılan sıraya göre.

Yazarlar ifşa gerek yok.