Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Summary

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Abstract

Astrocytes nöronal fonksiyon sadece sinaptik ve tek hücre düzeylerinde, aynı zamanda ağ düzeyinde modüle giderek netlik kazanmıştır. Astrocytes güçlü boşluğu kavşak birbirine bağlı ve kaplin yoluyla bu kavşaklar dinamik ve son derece düzenlenir. Astrositik işlevleri uzmanlaşmış ve bunların ilişkili olduğu nöronal devre fonksiyonları için uyarlanmış bir ortaya çıkan kavramdır. Bu nedenle, astrositik ağların çeşitli parametreleri ölçmek için yöntemler daha iyi iletişim yöneten ve kaplin kuralları tanımlamak için ve daha işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.

Burada, görüntü analiz yazılımı kullanarak (Örn., ImageJFIJI), astrositik ağlar boya-kaplin tarafından ortaya confocal görüntülerini analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler 1) bir otomatik ve tarafsız algılanması için etiketli hücreleri, ağlar, 3) 4) ilgi alanı içinde ağının yeniden konumlandırma ve ağ içindeki yaymak boya Tercihli yönünü hesaplama hesaplama 2) olanak sağlar .

Bu analiz belirli bir alanda astrositik ağları karakterize, ağları farklı alanlar için farklı işlevler ilişkili karşılaştırmak veya bağlantı üzerinde farklı etkiler farklı koşullar altında elde edilen ağlar karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu gözlemler için önemli işlevsel konuları açabilir. Örneğin, biz nereye biz daha önce astrositik kaplin nöronlar tonik onların ateş desenlerini ritmik patlama¹' e geçiş yapma yeteneği için gerekli olduğunu göstermiştir trigeminal çekirdeği, astrositik ağlar analiz. Boyutunu, lohusalık ve bu çekirdek astrositik ağlarda Tercihli yönünü ölçerek, onlar çemberlemek işlevsel etki alanları hakkında hipotezler inşa edebilirsiniz. Çeşitli çalışmalarda varil korteks, yanal üstün zeytin, koku glomeruli ve duyusal çekirdeği talamus ve bir kaç isim için görsel korteksin'de dahil olmak üzere çeşitli beyin bölgeleri benzer bir analizinden yararlanabilir öneririz.

Introduction

Birçok çalışma alt hücresel veya sinaptik düzeyinde nöron-astrocyte diyalog nöronal işlevleri ve sinaptik iletimi nasıl olabilir anlatmıştık. De astrocytes nöronal aktivite çevreleyen duyarlıdır kurulur; Aslında, onlar için glutamat, GABA, asetilkolin ve ATP (daha önce yayımlanmış değerlendirmeleri^2,3,4bakınız) de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin var. Buna karşılık, astrositik ensheath sinaptik öğeleri ve etkisi nöronal aktivite var ve extrasynaptic sitelerdeki ekstraselüler iyonik homeostazı düzenleyen ve çeşitli faktörler veya vericileri glutamat, D-serin ve ATP gibi serbest işler ^{5 , 6 , 7}.

Astrocytes Ayrıca ağ düzeyinde nöronal fonksiyon modüle fikir, astrositik kaplin dağınık şekilde düzenlenmiştir ve karşılık gelen nöronal segmentasyon alanlarda açık anatomik tarafından karakterize kanıtlarla ortaya çıkmıştır Bölünebilme (gibi alanlarda duyusal temsilcilikleri ile), astrocytes diğer astrocytes aynı işlevi yerine sadece o kadar da yakın hizmet veren çift gösteren. İçinde varil korteks veya olfactoty glomeruli, astrocytes arasındaki iletişimi varil ya da glomeruli içinde çok daha güçlü ise yanal üstün olive, mesela en astrositik ağları uygun tonotopic eksen⁸' e, odaklı ve zayıf bitişik olanlar^9,arası¹⁰. Her iki durumda da, astrositik ağlar glomerule veya varil^9,10merkezine doğru odaklı vardır.

Biz son zamanlarda astrositik faaliyet nöronal ateş konsantrasyonu hücre dışı Ca^{2 +} azaltarak gelen gösterdi ([Ca^{2 +}]_e), S100β, bir Ca^{2 +}sürümü ile muhtemelen-protein¹¹bağlama. Çekirdek (NVsnpr, masticatory hareketleri üretiminde önemli bir rol oynamaktadır düşünülen), sonuçları aslında trigeminal rhythmogenic nöronların trigeminal ana duyusal sırt kısmında bir popülasyondaki sunuldu bu etki bu Bu nöronlar ritmik ateş etmeye [Ca^{2 +}]_e^11,12azalır tarafından teşvik bir kalıcı Na⁺ geçerli bağlıdır. Bu nöronlar ritmik ateş etmeye "fizyolojik" girişleri uyarılması veya yapay [Ca^{2 +}]_eazalma elicited. Biz daha fazla astrositik kaplin nöronal ritmik ateş¹için gerekli olduğunu gösterdi. Bu olasılığını astrositik ağlar nöronal aktivite nerede senkronize ve koordine sinirlari belirli işlevsel etki alanları oluşturmak kaldırdı. Bu hipotezi değerlendirmek için ilk ciddi bir şekilde NVsnpr içinde bu ağların kuruluş belgelemek için bir yöntem geliştirmeye ihtiyacımız vardı.

Astrositik ağlarda önceki çalışmalar çoğunlukla kaplin cep telefonu numarasını ve yoğunluğu ve bölgeyi açısından ölçüde anlatmıştık. Astrositik ağlar şekli ve boya-kaplin yönünü değerlendirmek için girişimleri çoğunlukla iki eksen (x ve y) varil cortex⁹, hipokampus^13,14, boyunca ağların boyutu karşılaştırarak gerçekleştirilmiştir ¹⁵, talamus¹⁶, yanal üstün zeytin⁸, koku glomeruli¹⁰ve korteks¹⁴barreloid alanlarında. Yöntem tanımlamak burada bir ağ etiketli hücrelerinin tarafsız sayıları ve çevrenin onlar kapağı bir tahmin sağlar. Ayrıca bir ağ içinde bağlantı tercih edilen yönünü belirtin ve tercih edilen yönlendirme merkezi çekirdeği veya farklı bir yöne doğru olup olmadığını değerlendirmek için araçlar geliştirdi. Önceden kullanılan yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu iletişim kuralı organizasyon ve dorsal trigeminal ana duyusal çekirdeği gibi bilinen bir açık anatomik var mı yapılarda astrositik ağlar yönünü açıklamak için bir yol sağlar. Bölünebilme. Yukarıdaki çalışmalarda, ağ yönlendirmesini şekil zaten belgelenen yapının kendisi bir ilişki olarak açıklanan (Örn., varil korteks, talamus barreloid katmanlar hipokampus ve korteks, glomeruli içinde olfaktör ampul, vb). Buna ek olarak, farklı koşullar altında ortaya yönelimleri kaplin karşılaştırmalar için vektörel analiz sağlar. Bu parametreler ağ çekirdek içindeki konumuna göre değişiklik olup olmadığını çözümlemek için Ayrıca her ağ referans olarak çekirdek sınırları değiştirmek için bir yöntem geliştirdi. Bu araçların kolayca diğer alanlar eşleşmiş hücre soruşturma ağlar için adapte edilebilir.

Protocol

Tüm yordamlar tarafından Kanada Sağlık araştırma enstitüleri kuralları abode ve Montreal Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. sıçan Beyin dilimleri hazırlanması

1. 1 litre sükroz tabanlı bir çözümü (Tablo 1) ve standart yapay beyin-omurilik sıvısı (aCSF) (Tablo 2) 1 litre hazırlamak.
2. % 95'i O₂ ve %5 CO₂ (carbogen) için 30 dk karışımı ile sükroz tabanlı çözüm çözüm soğuk ama tamamen donmuş olana bu yaklaşık 30 dk,-80 ° C'de yerleştirmeden önce kabarcık. Bu buz gibi sükroz beyni Dilimleme Kesim tampon olarak kullanın. Dondurucudan kaldırıldıktan sonra buz üzerinde tutun.
3. ACSF carbogen tüm deneyi ile kabarcık. Bu çözüm için dilim depolama ve yama sıkma ve biocytin-dolgu astrocytes yapıldığı perfusing tampon olarak kullanın. En kısa zamanda onlar kesilir Beyin dilimleri yatırmak odası tutan bir dilim kurtarma hazırlayın.
   Not: Dilim kurtarma holding odası özel yapım olabilir ve aslında bir küçük iyi bir kafes içinde alttan carbogen getirmek için bir tüp takılı olduğundan aCSF ile dolu büyük bir kuyu içinde alt ile oluşur.
4. 15 - için 21-bayat Sprague-Dawley rat herhangi bir seks ya da zorlanma özel önyargı olmadan kullanın. Hayvan isoflurane (isoflurane bir anestezi indüksiyon odasında 1 mL) ile anestezi. Anestezi derinliği hafifçe arka pençe veya kuyruk hayvan pinching tarafından kontrol edin.
5. Fareyi kullanarak bir giyotine başını kesmek, onun kafatası makasla kesme ve beyin kafatası düz bir spatula ile hızlı bir şekilde kaldırmak.
6. 30 s ve transfer hakkında kendisine (Çözümle) bir petri çanağı için buz gibi sükroz tabanlı çözüm beyinde daldırma. Bir jilet ile anterior ve posteiror kesitli için alana kısımları kaldırmak kesme transvers düzlemde dilimler.
7. Beyin dokusu rostral kendi tarafında kalan bloğunu tutkal ve beyin dilimleri (350 µm kalınlığında) bir vibratome kullanarak sükroz tabanlı ortamda kesmek için devam edin. O zaman, carbogenated aCSF, oda sıcaklığında (RT) kadar kullanılmak üzere hazır dolu odası tutan bir kurtarma toplanan dilimleri transferi (en az 1 saat kurtarma için izin).
   Not: Alanındaki son gelişmeleri uzun süreli kuluçka kadar izin 24 h vitro beyin dilim koşulları¹⁷.

2. Sulforhodamine 101 Astrocytes (SR-101) etiketleme

1. Önceden bir su banyosu ile 34 ° C ısı ve iki dilim kuluçka odaları yerleştirin. Bir dilim kuluçka chambers 1 mikron içeren aCSF bir çözüm ile doldurmak SR-101 ve diğer sadece aCSF ile doldurun.
2. 1 µM içeren kuluçka odasında dilimleri kuluçkaya SR-101 20 min ve o zaman transferi onlara ikinci kuluçka odası aşırı SR-101 kimden doku dışarı durulama için. 20 dk için kuluçkaya izin veya daha 34 ° C'de, o zaman tutmak onlar kadar RT, dilimler içeren kuluçka odası¹⁸gerekli.

3. astrocyte yama ve Biocytin dolum

1. Bir dilim seçin ve mikroskop kayıt odasında yerleştirin. Astrocytes patch, elektrotlar 4-6MΩ potasyum glukonat dayalı bir çözüm ile dolu bir direnç ile kullanmak için (bkz. Tablo 3).
2. Görsel rehberlik ve bir micromanipulator kullanarak altında kayıt elektrot bir SR-101-etiketli astrocyte Şekil 1' de gösterildiği gibi doğru yönlendirin. Onlar daha fazla zarar görmüş veya bağlantıları komşu hücrelere kaybetmiş olasılığı olduğundan dilim yüzeyde bulunan hücreleri kaçının.
3. Biocytin doku kaçağı önlemek için yama pipet eklendi pozitif basınç en aza indirmek ve yalnızca yamalı olabilir astrocyte yakın olduğunda uygulanacak (0,1-0.4 mL şırınga 1 ml).
4. Yama önce pipet ve onun kapasitans uzaklığı ayarlayın. Doğru ve hassas voltaj komutları için deneyler¹⁹kritik olduğundan sıvı kavşak potansiyeller için düzeltin.
5. Pipet yeterince pozitif basınç nedeniyle depresyon gözlemlemek için astrocyte yakın hareket. O zaman, pozitif basınç kaldırmak ve yavaş yavaş bazı negatif basınç uygulayın. -70 için astrocyte kelepçe mühür 100 MΩ ulaştığında mV. 1-3 GΩ mühür ulaşıncaya kadar bekleyin. Hücre içine breaking kadar negatif basınç uygulamaya devam. Astrocytes çok hassas olduğundan negatif basınç uygularken dikkatli olun.
6. Yamalı hücresinin elektrofizyolojik özelliklerini değerlendirmek. Gerilim tipi kelepçe modunda, tüm hücreli akım-gerilim protokolü için 110 -120 değişen 600 ms süresinin bir rampa gerilim komutla gerçekleştirmek mV. Geçerli-kelepçe modunda 1000 ms geçerli adımları 100 PA -1 den 1 nA, tüm hücreli kayıtları örnekleme oranı için enjeksiyon 10 kHz olduğu bir adım IV protokol gerçekleştirin.
   Not: Astrocytes her türlü ( Şekil 1Badımında gösterildiği gibi) düzeltme ve membran depolarizasyon (Şekil 1 c) ateş yok Aksiyon potansiyeli olmayan bir doğrusal akım-gerilim profilini göster. İstirahat membran potansiyeli (RMP)-meli var olmak istikrarlı ve için - 60mV olumlu değil. Bazı beyin bölgelerde astrocytes RMP içinde NVsnpr daha hyperpolarized.
7. Astrocyte 30 dk içinde bir adım IV protokolü her 5 dk gerçekleştirirken diffüz biocytin izin verir.
8. Geri çekmek ve yama pipet dikkatle yamalı astrocyte zarar vermeden bağlantısını kesin ve hemen pipet uzaklığı kayıt odadan çekmeden önce dikkat edin. Bu değeri membran potansiyeli kayıtlarından çıkarma.
9. Beyin dilim yamalı astrocyte üzerinden izleyici tüm ağa eşleşmiş hücrelerinin Yayilim izin vermek için en az 15 dk (ek 30 dk enjeksiyon için) kayıt odasında dinlenmeye bırakın.
   Not: bir ağ eşleşmiş hücre ortaya çıkarmak için sadece tek bir hücre faiz çekirdeğinde uygulanması. Başarılı bir yama elde etmek için birden çok deneme gerekiyorsa, davayı iptal et ve kontralateral tarafında veya başka bir beyin dilim yama çalışın.
10. Dilimin hangi tarafı yukarı bakacak şekilde tanımlamak için dokusunda bir işareti veya kesi yapmak ve dilimi ilk normal aCSF, o zaman %4 paraformaldehyde (PFA) bir çözümde içeren petri kabına aktarın. 4 ° C'de dilim gecede kuluçkaya.
    Dikkat: İngiltere'de yılın son derece zararlıdır. Koruyucu ekipman havalandırılmış bir mahallede kullanın. PFA ile temas halinde olan tüm malzemeler (fırçalar, tüpler, vb) odası, kuluçka odası veya taze doku kaydetmek için kullanılan diğer malzemeler tutan kurtarma ile değil emin olun.

4. Biocytin Vahiy

1. Vahiy ile floresan streptavidine
   1. Beyin yıkama RT., 0.1 M fosfat tampon serum (PBS) içinde 2 x 10 dk dilimler O zaman, biocytin bir fluorophore ile % 4 non-iyonik deterjan RT. 4 h için PBS içinde 1/200 seyreltme, Birleşik streptavidine ile beyin dilimleri kuluçka tarafından ortaya
   2. RT, 0.1 M PBS beyin dilimler 3 x 10 dk yıkayın ve bölümleri cam slaytlara bir sulu montaj orta kullanarak bağlayabilirsiniz. Yukarı doğru coverslip enjekte edildi taraf slaytları yerleştirin ve onları tırnak-cila ile mühür.
2. Vahiy ile DAB
   Not: DAB (3,3-diaminobenzidine) vahiy floresans kullanıldığında kullanılabilir. Bu durumda, yalnızca bir vahiy yöntemi karşılaştırmaları yapmak için istihdam edilmelidir.
   1. 3 x 10 dk içinde RT. adlı PBS Beyin dilimleri RT. 1 saat₂O_%2 0.5 PBS + H dilimleri kuluçkaya yıkama
   2. PBS, RT. dilimler 3 x 10 dk durulama O zaman, kuluçkaya dilimleri PBS ve %0,1 non-iyonik deterjan + avidin-biotin karmaşık peroksidaz standart boyama seti reaktifler 1/100 RT. 24 saat oluşan bir çözümde avidin-biotin karmaşık boyama
   3. PBS RT, dilimler 3 x 10 dk durulama, onları PBS bir çözümde kuluçkaya + RT %0.05 20 dk için DAB ve onları PBS bir çözümde transfer + %0,05 + H₂O_%2 0.5 DAB.
      Dikkat: DAB son derece zararlıdır. Koruyucu ekipman havalandırılmış bir mahallede kullanın. Zaman dilimleri içinde PBS aktarılır renk reaksiyonu durdurulur.
   4. PBS RT, dilimleri 5 x 10 dk durulama, bölümleri (yüz yukarı doğru enjekte edildi taraf) cam slaytlarda takma ve onlara bir slaytta tezgah gecede 34 ° C'de kurutma makinası
   5. Ksilen 1 dk 1 dk içinde banyo ile % 70, % 95'i ve % 100 ve sonunda birkaç alkol hamam cam slaytlarını daldırın.
   6. Orta montaj bir Toluen-sentetik reçine bazlı kullanarak cam slaytlar bağlayın. Coverslips slaytlar üzerine yerleştirin ve onları tırnak vernik ile mühür.

5. ağ görüntüleme

1. Astrositik ağları tarama confocal mikroskop 20 X ve 4 X hedefleri (veya ağ nerede tüm çekirdeği görselleştirmek için uygun bir amaç ile) donatılmış kullanarak görselleştirmek ve fluorophore tespit etmek için bir lazer (Bu durumda, Alexa-594 olduğunu kullanılan).
2. 20 X büyütme etiketli hücre ağ yığınını z olun 12.5 μs/piksel hızı tarama ve 800 x 800 piksel çözünürlük kullanın.
   Not: tüm ağ görüntü için birden çok yığınları genellikle gereklidir ve yığın sayısından her ağ için ayarlanması gerekiyor. Çözünürlük ve inceden inceye gözden geçirmek hız, tüm veri görüntü için aynı ayarları kullandığınızdan emin olun değiştirilebilir.
3. 4 X büyütme ağ ve faiz bölgesinin görüntülerini almak için kullanın.
   Not: 4 X görüntüleme ilgi içinde çekirdek ağ konumunu belirlemek için kullanılır. Her zaman alanındaki iletilen ışık görüntü. Bu görüntü confocal floresan görüntü çekirdeğinde kenarlığını belirleyemiyorsa faydalı olacaktır.

6. görüntü analizi

1. Veri hazırlama
   1. Kullanma bilgisayar yazılımı ImageJFIJI (https://fiji.sc/ indirebilirsiniz). Dosyayı açıp "Biyo-formatları içe aktarma seçenekleri" penceresinde Tamam'ı tıklatın.
   2. Sadece son z-yığın için (Şekil 2A) gerekli optik dilimler içeren bir z yığın yeniden tanımlamak için "Yığın" düğmesi araç çubuğunda tıklayın (bulmak için önce stk seçin | Z Projesi). "Max yoğunluğu" projeksiyon yazın (Şekil 2A) ayarını seçin. Dosyayı kaydedin ve "dosya yığını" adını verin.
   3. Görüntü dosyası birkaç kanalları içeriyorsa, yalnızca Kanal astrositik ağ görüntüleme ile tasarruf etmek için split (görüntü | Renk | «««Split) kanalları.
   4. Görüntü piksel ayarlarını kontrol edin [resim | Özellikleri | Piksel ("1" piksel boyutu için ile)].
   5. Çıkarma arka plan aracını kullanın (işlem | Arka plan çıkarmak) biocytin etiketleme arka plan çıkarmak. Genellikle 50 piksel (Şekil 2B) ayarlanır haddeleme topu yarıçapı ayarlamak için Önizleme işlevini kullanın.
   6. Kaldır outliers aracını kullanın (işlem | Gürültü | Outliers kaldırmak) çıkarma arka plan adım takip gerekli ise. "Parlak" "Hangi Outliers" ayarında (Şekil 2C) seçin. RADIUS ve eşik ayarlamak için Önizleme işlevini kullanın. Verileri, Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi bulanıklık bu yana bu araç ile dikkatli ol.
      Not: Bu araç streptavidine belirsiz mevduat tarafından ( 2B şekil ve 2 C beyaz ok işlemden, önce ve sonra sırasıyla görüldüğü gibi) neden olduğu küçük noktalar kaldırır.
   7. Eşik ayarlayın (görüntü | Ayarlamak | Eşik). "Varsayılan" ve "siyah-beyaz" modu (Şekil 2E) seçin. Tıkırtı üstünde "uygulamak".
      Not: Otomatik ayarlama kullanılabilir, ancak el ile ayarlama iki kaydırma çubuklarıyla tercih edilir. Bu adım, etiketli hücreleri kaybetmeden maksimum gürültüyü azaltmak için amaçtır.
   8. İkili işlem aracı ile ikili bir resim görüntü dönüştürmek (işlem | İkili | İkili olun) Şekil 2Fiçinde gösterildiği gibi. Dosyayı TIFF dosyası olarak kaydedin ve "ikili dosya" adını koy.
2. Hücre sayımı
   1. Kontrol belgili tanımlık koyma ölçü işlevinin (Analyze | Set ölçüm). "Centroid" seçeneğini seçin.
   2. "İkili dosyada" "Parçacıklar analiz" aracını kullanın (Şekil 3A) üretilen önceki adımda (Analyze | Parçacık analiz) (Şekil 3 c solda). "Ana hatlarıyla" "Show" ayarında (Şekil 3 c) seçin. Bu algılama (Şekil 3B) sonucunu gösterir yeni bir dosya oluşturur.
   3. Parametreleri ile oynamak: boyutu (yalnızca hücreleri bulmak için 30 ila 6000 arasında değerleri kullanın) ve (bir aralığını belirlemek için 0-1, hangi "1" tam bir daire ve tanımlar "0" rasgele bir şekil) döngü algılama (Şekil 3 c,) bölümü yaptı iyileştirmek için. Algılama yanında tıkırtı "OK" çalıştırın.
      Not: Algılama aşağıdaki iki tablo görünür: algılanan hücreleri sağlayan "Özet" başlıklı 1) bir tablosunun ve "Sonuçlar" (Şekil 3 c, doğru bölümü) başlıklı 2) bir tablo x - ve y-koordinatlarının her hücrenin sağlar.
   4. Değerleri kopyalamak ve bir elektronik tablo uygulaması yapıştırabilirsiniz. Bu tablo "algılama tablo" adı altında kaydedin. Bir komplo algılanan hücre içeren bir dosyayı da (Şekil 3B) görünür. Bu dosyayı "algılama dosya" adı altında bir TIFF dosyası olarak kaydedin.
   5. Analiz parçacıklar aracı ile tek bir hücre oldukları için çok yakın olarak birbirlerine bir grup 2 veya daha fazla etiketli hücre ağ algılanmazsa, havza aracını kullanın (işlem | İkili | Analiz parçacıklar uygulamadan önce dönüm noktası) ikili görüntü aracı ve analiz parçacıklar adımları yeniden.
      Not: Havza Aracı 1 piksel arasında son derece yakın hücreleri geniş bir ayırma oluşturur. Bir hücre sayaç eklentisi can var olmak kullanılmış ne zaman etiketleme kesin ve el ile yapılabilir.
3. Astrositik ağ alan ölçme
   1. Ağlar yüzey alanı ölçmek için görüntü J. kullanarak algılama dosyasını kullanın
   2. Çokgen seçim aracını (sol tıkırtı üstünde seçmek için araç çubuğunda düğme) tüm hücreleri bağlayan bir çokgen ağ (Şekil 4A) dış çevre içinde bulunan izlemek için kullanın. Çokgen izleme başlatmak için sol tıklayın ve kapatmak için sağ tıklatın.
      Not: Bu Çokgen faiz (ROI) bir bölge olarak tanımlanır ve yüzeyi ağ yüzey alanını belirlemek üzere ölçülecek.
   3. Küme ölçüm penceresini açın (Analyze | Ölçüm ayarla) ve "Alan" seçeneğini belirleyin. ROI Yöneticisi'ni açın (analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi) (Şekil 4B). Ardından, '' ekle '' (Şekil 4B) tıklatarak ROI Yöneticisi'nde izlenen Çokgen ekleyin ve ölçüm ROI Yöneticisi'nde '' ölçü '' tıklayarak çalıştırın.
      Not: Alan ölçüm bir tabloda görüntülenir ve piksel cinsinden ifade edilebilir. Bu değeri bir değer μm kalınlığında²elde etmek için kullanılan mikroskop için dönüştürme faktörü ile dönüştürmek unutmayın.
4. Ana yön vektör belirlenmesi
   1. Yamalı hücre belirlenmesi
      1. ImageJFIJI içinde yığın dosyasını açın ve daha güçlü etiketleme şiddeti üzerinde (Şekil 4 c) bağlı olarak yığın dosyasını yamalı hücrede tanımlamak. Sonra bir elektronik tablo uygulamasında "algılama tablo" adlı dosyayı açın ve yamalı hücre ve karşılık gelen koordinatları ile ilişkilendirilen numarasını bulun.
      2. İse doğru yamalı hücre belirlemek, biocytin para yatırma eşleşmiş hücre, ImageJFIJI, Çokgen aracını kullanarak görüntülü ağındaki daha yoğun nerede etrafı sarın ve yamalı hücre (Şekil 4 d) olarak bu duruma bakın.
      3. ROI Yöneticisi'ni kullanın (analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi). Sonra bir yatırım getirisi yamalı hücre konumu çizmek ve yatırım getirisi yöneticisine Ekle (bkz. Şekil 4B).
      4. Bir ölçüm ayarla (Analyze | Ölçüm ayarla) ve "Centroid" seçeneğini belirleyin.
      5. ROI Yöneticisi'nde izlenen çevrenin centroid koordinatlarını elde etmek için "ölçü"'ı tıklatın. Bu koordinatlar, bu belirli ağ için referans noktası olarak kullanın.
   2. Bilgi tutarlılığına çeviri
      1. Yamalı astrocyte referans olarak her hücre koordinatlarını aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
          
         İle: olarak koordinatları için belirli bir hücrenin; olarak koordinatları yamalı hücrenin (veya ağ başvuru noktası); ve yeni başvuru belirli bir hücre için koordinatları olarak.
         Not: yamalı astrocyte vektörlerinden hesaplanmasında önemli bir adım olduğunu yamalı astrocyte referans olarak her hücre koordinatlarını dile getirdi. ImageJFIJI kullanırken dikkatli olun herhangi bir görüntü için bilgi tutarlılığına görüntünün sol üst köşesinde bulunur.
   3. Ana vektör Tercihli yönünün belirlenmesi
      1. Aşağıdaki formül ile Tercihli yönlendirme ana vektörünü koordinatları hesaplayın:
         
         İle: () Tercihli yönelim; ana vektörünü koordinatları olarak ve yamalı ile elde edilen ağ her hücresini koordinatları olarak hücre olarak başvuru.
         Not: ağ her hücre için bir vektör yamalı astrocyte koordinatları göreli olarak belirlenir. Ağ Tercihli yönünü ana vektör bu vektörel çizimler toplamıdır.
      2. (Yukarıdaki formül kullanılarak elde koordinatları tarafından sağlanan) ana Yöneyin uzunluğu eksi bir yana (yamalı hücre koordinatlarını dahil değildir), ağ hücre sayısı bölün değerleri normalize ve arasındaki karşılaştırmaları etkinleştirmek için ağlar. Bu analiz şematik Şekil 5' te gösterilmektedir.
5. Faiz çekirdeği analiz ağlarda yerleşimini
   1. 20 X ve 4 X resim hizalama
      1. 4 X resim faiz (NVsnpr) çekirdeği her ağ konumunu belirlemek için kullanabilirsiniz. 4 X görüntüyü bir vektör resim editörü ile açın.
      2. 4 X görüntü seçin ve 5 tarafından çarparak boyutunu değiştirebilirsiniz. Boyutu penceresi üst yatay araç sağ kısmında yer alır. Örneğin, 4 X görüntü için örnek 800 x 800 piksel, örnekleme çözünürlüğü 4000 x 4000 piksel olarak değiştirmek (numune piksel olarak ayarlamak için "Belge ayarları" altında Dosya sekmesine gidin: dosya | Belge Ayarları). Dosyayı TIFF formatında ve bu "4 X yeniden boyutlandırılabilir" adı verin.
      3. Görüntü sol üst köşesi ile Adobe Illustrator belgesini sol alt köşesine hizalayın.
         Not: Yazılımın koordinatlarından bir sol alt köşesindeki başvuru noktası sağlar.
      4. Ağ 20 X görüntü açın. Çünkü onlar hizalamak daha kolay '' ikili dosya '' veya '' algılama dosyasını '' kullanın. O zaman, opaklık aracıyla yeniden boyutlandırılmış 4 X ile hizalamak için 20 X görüntü '' ikili dosya '' oynamak görüntü.
         Not: Üst yatay araç çubuğunda Opaklık araçtır.
      5. Hizalama olduğunda, seçin ve ölçü aracı görünecek şekilde pipet araç tutun ve sol araç çubuğunda seçin.
      6. 20 X koordinatları başvuru almak 20 X görüntünün sol üst köşesini tıklatın için ölçü aracını yeniden boyutlandırılmış 4 X gelin kullanım görüntü.
         Not: 20 X bilgi tutarlılığına (20XR Şekil5) olarak adlandırılır, bu koordinatlar çekirdeği çizim bir şematik her ağ konumunu ifade etmek için faydalı olacaktır.
   2. Normalleştirme ilgi çekirdeği
      Not: çekirdek (NVsnpr) bir normalleştirme bir dikdörtgen olarak verileri özetlemek için kullanılır. Adımları aşağıda açıklanmıştır.
      1. Açık 4 X ImageJFIJI dosyasında yeniden boyutlandırılabilir ve Çokgen aracı çekirdek (NVsnpr) için kullanılır. Çekirdek sınırları görülmesi mümkün değilse görüntü ile iletilen ışık kullanımı; Bu durumda, ilk yeniden boyutlandırmak hatırlıyorum.
      2. ROI Yöneticisi'ni açın ve çizilmiş yatırım getirisi ekleyin. "Ayarla ölçümü", '' sınırlayıcı dikdörtgen '' seçeneğini belirleyin.
         Not: "Sınırlayıcı dikdörtgen" seçeneği en küçük dikdörtgenin etrafında çizilmiş çekirdeği hesaplar.
      3. "Ölçü"'ı tıklatın.
         Not: BX ve BY, dikdörtgenin sol üst köşesine koordinatlarını içeren bir tablo görünür: '' dikdörtgen pozisyon '' ve genişlik ve yükseklik sağlar. BX ve BY vardır olarak adlandırılır sınırlayıcı dikdörtgen başvurusal koordinatlarını ve .
   3. Normalleştirilmiş çekirdek her ağ konumu ifade
      1. 4 X bilgi tutarlılığına ( Şekil5 siyah kare) her hücre koordinatlarını hızlı aşağıdaki formülü kullanarak:
         
         Nerede: 4 X ile hücre koordinatları başvurusal; vardır hücre koordinatları 20 X bilgi tutarlılığına (turuncu kare Şekil 5'); ve 20 X 4 X görüntü (20XR) başvuru noktası koordinatlarını vardır.
      2. (Mavi olarak Şekil 5) hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru içinde hızlı aşağıdaki formülü kullanarak:
         
         Nerede: olan hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru; 4 X hücre koordinatları başvurusal; vardır ve sınırlayıcı dikdörtgenin koordinatlar 4 X görüntü başvuru.
      3. Hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen genişliğinin yüzdesi ve aşağıdaki formülü kullanarak sınırlayıcı dikdörtgenin yüksekliği için başvuru dönüşümü:
         
         Nerede: olan hücre koordinatları genişliğinin yüzdesi ve yükseklik sınırlayıcı dikdörtgenin; olan hücre koordinatları sınırlayıcı dikdörtgen başvuru; sınırlayıcı dikdörtgen yukarıda iletişim kuralında; ölçülen genişliği ve sınırlayıcı dikdörtgenin yüksekliği yukarıda iletişim kuralında ölçülür.
      4. Aynı şekilde tüm ağlarda temsil etmek için dilim (sol veya sağ tarafına) yönünü dikkate alın. Verileri standart hale getirmek için bilgi tutarlılığına dilimin sol tarafında uygulanır. Sağ tarafındaki ağ koordinatlarını sadece x-koordinatları için aşağıdaki formülü uygulayarak sol tarafına aktarın:
         
         Nerede: x-koordinatı dilim; sağ tarafında olduğunu ve  olan yeni x-koordinat başvuru içinde dilimi sol tarafındaki ifade.
         Not: Alternatif olarak, ImageJFIJI resimde analiz önce ayna (görüntü | Dönüştürme | Yatayda ters çevir).
      5. Tercihli yönlendirme ana vektörünü koordinatları ifade etmek için hücre koordinatları (adım 6.5.3.1-6.5.3.4) ile aynı adımları izleyin.
         Not: Veri derleme olarak çekirdek (NVsnpr) bir dikdörtgen olarak tasarlanmış tek bir arsa koordinat yüzdelerle ifade sağlar.
6. Çalışmanın ana vektör Tercihli yön açısal fark
   Not: Bir astrositik ağının açısal fark Tercihli yönünü faiz çekirdeği merkezine doğru olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Tercihli Yön ( Şekil 5polisi, kırmızı hat) ağının ana vektör ile P yı C'ye bağlayan çizgi arasındaki açıdır açısal farkı ( Şekil 5' te α), hesaplama için PDC (bkz: üçgen Al-Kashi teoremi uygulanır iç metin Ek yöntemlerve Şekil 5 ).
   1. İlk olarak, aşağıdaki denklemi kullanarak bir Kartezyen başvurusal içine Pisagor teoremi uygulanması kullanarak farklı uzunlukta Hesapla:
      
      : Nerede P ve C koordinatlarını ve , sırasıyla, sınırlayıcı dikdörtgen başvuru (yukarıda hesaplanan) içinde.
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak radyan açısal farkı belirlemek:
      
   3. Açısal fark derece (Örneğin, derece fonksiyonu Excel yazılımı ile) dönüştürün.
   4. Dikey çubuk grafiklerde (Şekil 7C ve 7 D) komplo tarafından açısal farklılıklar derlemek ve Tercihli yönünü astrositik ağlar olup olmadığını belirlemek.

Results

Beyin hücreleri arasında bağlantı statik ama oldukça dinamik olarak birçok faktör tarafından düzenlenmiş değildir. Açıklanan yöntemleri astrositik ağları farklı koşullar altında ortaya çözümlemek ve NVsnpr kuruluşlarındaki anlamak için geliştirilmiştir. Bu sonuçlar zaten yayımlanmış¹olmuştur. Biz üç farklı koşullarda NVsnpr dorsal parçası tek astrocytes biocytin dolum yapılan: Ca^{2 +}(koşullarında denetim yokluğunda herhangi bir stimülasyon), istirahat-ücr...

Discussion

Astrocytes^23,24arasında kaplin fonksiyonel değerlendirmek için elektrofizyolojik yöntemlerle bir dizi vardır. Ancak, bu yöntemlerin astrositik ağlar anatomik yerleşimi hakkında bilgi sağlar. Çalışmalar bir dizi zaten "boya - veya izleyici-olarak kancası", burada, yalnızca bir kısmını içinde birleştiğinde düşündüren elektrofizyolojik yöntemleri^25,26,27tarafından algılanır...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Balıkçı Kimyasalları	S671-3
KCl	Balıkçı Kimyasalları	P217-500
KH2< / sub>PO4	Fisher Kimyasalları	P285-500
MgSO4< / sub>	Fisher Kimyasalları	M65-500
NaHCO3< / sub>	Fisher Kimyasalları	S233-500
C6H12O6 Dekstroz susuz	Fisher Kimyasalları	D16-500
CaCl2 susuz	Sigma	C70-500
Sükroz	Sigma	S9378
D-glukonik asit potasyum tuzu	Sigma	G45001
MgCl2 susuz	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Tuz	Sigma	A9062
GTPTris Tuz	Sigma	G9002
Biyosit	Sigma	B4261
Karbenoksolon disodyum tuzu	Sigma	C4790
avidin-biotin kompleksi: ABC kiti	Vestor laboratuvarları	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Moleküler Problar	S11227
Triton	Fisher Kimyasalları	BP151-500
Ksilen	Fisher Kimyasalları	X5-1
Sulu montaj ortamı 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen bazlı sentetik reçine montaj ortamı : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slayt Kurutma Tezgahı	Fisherbrand	11-474-470
Vibratom	Leica	VT 1000S
Mikroskop lamı ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Konfokal mikroskop	Olympus
40X suya daldırmalı lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X suya daldırmalı lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X suya daldırmalı lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Mikropipet çektirme	Sutter Enstrüman	P97
Mikromanipülatör	Sutter Enstrüman	MP 225
Kamera CCD	Sony	CX-ST50
Siyah beyaz monitör	Sony	SSM-125
Digidata	Moleküler cihazlar	1322A
Yama Kelepçesi amplifikatör	Akson aleti	Mulitclamp 700A
Elektrofizyoloji edinim yazılımı	Moleküler cihazlar	pClamp 8
Elektrofizyoloji analiz yazılımı	Moleküler cihazlar	Clampfit 8
Görüntüleme analiz yazılımı	ImageJFIJI	Açık kaynaklı yazılım. Eklenti paketi dahil FIJI sürümü.
Vektör görüntü düzenleyici	Adobe	Illustrator CS4
Elektronik tablo uygulaması	Microsoft Office	Excel 2010