Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma
Bu makalede
Özet
Özet
Miktar (Th1) saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve farklılaşma T yardımcı 1 için hücreleri T hücreleri bir bağışıklık yanıtındaki oynadığı rol değerlendirmek için yararlı bir yoldur. Bu iletişim kuralı granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) türetilmiş-dendritik hücreler (DC) elde etmek için kemik iliği (BM) ataları vitro farklılaşma açıklar. Protokol ayrıca ovalbumin peptid (OVAp) evlat edinen transferini açıklanır-GM-CSF-türetilmiş DCs ve saf CD4 T hücreleri OTII transgenik fareler vivo içinde harekete geçirmek, yayılması ve Th1 farklılaşma çözümlemek amacıyla yüklü Transfer edilen CD4 T hücreleri. Bu iletişim kuralı tamamen in vivo Yöntemler özellikle işlemek veya okudu hücre nüfus seçmek için yetersizlik tarafından dayatılan sınırlandırılması kaçınmanızı sağlar. Ayrıca, bu protokol çalışmaları böylece değişiklikler vitro oluşabilir fonksiyonel etkenler ve hücre tipleri ve sadece olduğu gibi organlarda bulunan diğer faktörlerin etkisi kaçınarak bir in vivo ortamda olanak sağlar. Protokol değişiklikleri DCs içinde oluşturmak için yararlı bir araçtır ve T hücreleri edinilmiş bağışıklık yanıtı, potansiyel olarak kökenli veya çok sayıda bağışıklık ilişkili hastalıkları gelişimi anlamak için önemli sonuçları sağlamanın değiştirin.
Giriş
CD4 T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) DCs gibi bağışıklık mikrobiyal patojenler1,2için gerekli ortam araçları vardır. Periferik lenfoid organlarda CD4 T hücreleri belirli antijenleri ZPT3,4,5tarafından sunulan tanınması üzerine aktif hale gelir. Aktif CD4 T hücreleri çoğalırlar ve doğru edinilmiş bağışıklık yanıtı6,7gelişimi için gerekli olan farklı belirli efektör Th hücrelerine ayırt etmek. Bu işlemlerin kontrolünü zararlı doku hasarı
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneysel prosedürler Fundación Centro Nacional de tarafından onaylanmış Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) ve Comunidad Autonoma de Madrid İspanya ve Avrupa yönergelere uygun olarak. Fare belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullarında yetiştirilen ve karbondioksit (CO2) inhalasyon tarafından euthanized.
1. yalıtım yırtılmalarıteşhis ve uyluk fare kemik iliği hücrelerinin
Not: Vahşi tipli C57BL suşlarının CD45.2 veya Ly5.2 olarak bilinen Ptprcb alleli taşıyan ise genellikle CD45.1 veya Ly5.1, olarak tanınan fark lökosit işaretçiyi Ptprcbir, C57BL/6 con....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 bu protokol için açıklanan adımları gösterilmektedir. Şekil 2 yalıtım ve fare BM hücre kültür gösterilmektedir. GM-CSF ve LPS eklenmesi için bu kültürler vitro üretimi sağlar ve farklılaşma Akış Sitometresi Analizi ve elde edilen DCs. OVAp yüklü GM-CSF BM kaynaklı DCs olgunlaşma DCs. Şekil 3 olgunlaşma gösterilmektedir ve izole hayati hücre izleme boya lekeli CD4/OTII T hücrelerinin .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı etkinleştirme, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin farklılaşma modüle için BM kaynaklı DCs kapasitesini karakterizasyonu için izin verir. Ayrıca, aynı zamanda CD4 T hücrelerinin modülasyonu karşı hassasiyeti değerlendirmek için BM kaynaklı DC'ler tarafından kullanılabilmesi için. Bu iletişim kuralı ile ölçülen vivo içindebu olaylar değişimler olabilir.
Soruşturma altında hipotez bağlı olarak, T hücreleri ve DCs çeşitli bileşimleri kullanılabilir. Örneğin, bir de vur.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa yoktur
Teşekkürler
Dr. Simon Bartlett İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada: Instituto de hibe tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Program ve Fundación Ramón Areces; Fondo Europeo de Desarrollo bölgesel (FEDER) ortak fon ile. CNIC Ekonomi Bakanlığı, sanayi ve rekabet (MEIC) ve Pro CNIC Foundation tarafından desteklenen ve bir Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505) olduğunu. RTF Fundación Ramón Areces ve CNIC, VZG ISCIII, Instituto de birimi BHF tarafından kurulan Investigación Sanitaria hastane 12 de Octubre (imas12) ve JMG-G ISCIII Miguel Servet Program ve imas12.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR Kimyasalları | 20,824,365 | 5 L |
| Makas | Güzel Bilim Araçları (FST) | 14001-12 | |
| Forseps | Güzel Bilim Araçları (F.S.T.) | 11000-13 | |
| İnce Forseps | Güzel Bilim Aletleri (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Neşter | Güzel Bilim Aletleri (F.S.T.) | 10020-00 | 100 bıçaklı kutu |
| Fetal Sığır Serumu | SIGMA | F7524 | |
| Penisilin / streptomisin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Enstitüsü ortamı (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Steril Petri kapları | Falcon | 353003 | |
| 25 gauge iğne | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml şırınga | Novico | N15663 | |
| 15 ml konik tüpler | Falcon | 352096 | |
| 50 ml konik tüpler | Falcon | 352098 | |
| 70 & mu; m naylon ağ filtresi | BD Falcon | 352350 | |
| Kırmızı kan lizis tamponu | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Sığır Serumu Albümini | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Tripan mavisi | SIGMA | 302643-25G | |
| Kültür plakaları | Falcon | 353003 | |
| 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-merkaptoetanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodyum piruvat | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamin | LONZA | BE17-605E | |
| Rekombinant murin Granülosit Makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolisakkarit (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96 kuyulu plaka | Costar | 3799 | |
| v450 anti-fare CD11b antikoru | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-fare CD64 antikoru | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-fare CD115 antikoru | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-fare CD11c antikoru | BioLegend | 117305 | |
| APC anti-fare CD86 antikoru | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-fare CD80 antikoru | BioLegend | 104713 | |
| Akış Sitometrisi tüpleri | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbümin peptit | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-fare biyotinile CD8 ve alfa; antikor | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-fare biyotinile IgM antikoru | BioLegend | 406503 | |
| anti-fare biyotinile B220 antikoru | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-fare biyotinile CD19 antikoru | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-fare biyotinile MHCII (I-Ab) antikoru | BioLegend | 115302 | |
| anti-fare biyotinile CD11b antikoru | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-fare biyotinile CD11c antikoru | BioLegend | 117303 | |
| anti-fare biyotinile CD44 antikoru | BioLegend | 103003 | |
| anti-fare biyotinile edilmiştir CD25 antikoru | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-fare biyotinile edilmiş DX5 antikoru | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin kaplı manyetik mikro boncuklar | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Manyetik hücre ayırıcı | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Ayırıcı |
| Ayırma | sütunları MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-fare CD4 antikoru | BioLegend | 100408 | |
| FITC anti-fare CD8 antikoru | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Hücre Menekşe İzleyici | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-fare CD25 antikoru | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-fare CD69 antikoru | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-fare CD45.1 antikoru | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-fare CD45.1 antikoru | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-fare CD45.1 antikoru | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-fare CD45.2 antikor | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| İyonomisin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Asetat (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehit | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Hücre içi geçirgenlik tamponu | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-fare IFNg antikoru | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-blok (anti-fare CD16 / CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. SJL CD45.1 fareler | Jackson Laboratuvarı | 002014 | |
| BD LSRFortessa ve ticaret; Hücre Analiz Cihazı | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Çözeltisi | Thermofisher | 62248 |
Kaynaklar
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
