Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sığır Serum albümin Gold(III) bağlama tarafından çeşitli biçimler Luminophore oluşumu

6.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58141

⸱

31 Ağustos 2018

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Bu makalede

Özet

Altın katyonlar (Au(III)). Sığır serum albumin (BSA) de konformasyon bağımlı benzersiz BSA-Au floresans karakterize gelince sunulan çeşitli biçimler için bağlama eğitimi iletişim kurallarını

Özet

Sunulan iletişim kurallarının amacı biçimi değişikliği indüklenen kırmızı floresans verimli BSA, Au(III) bağlama işlemi incelemektir (λem 640 = nm) BSA-Au(III) kompleksleri. Yöntem kırmızı floresans ortaya çıkması BSA biçimler denge pH kaynaklı geçişler ile ilişkili göstermek için pH ayarlar. Kırmızı floresan BSA-Au(III) kompleksleri sadece BSA "A-biçimli" biçimi için karşılık gelen pH ya da 9,7 üzerinde bir ayarlama ile oluşmuş olabilir. Au molar oranı BSA ayarlamak için ve Au(III) bağlama işlemi saat ders izlemek için iletişim kuralı açıklanmıştır. Au(III) kırmızı floresans üretmek için BSA, başına en az sayıda daha az yedi yaşında. Biz iletişim kuralı birden çok Au(III) bağlayıcı siteleri BSA içinde varlığını göstermek için adımlar açıklanmaktadır. İlk, bakır ekleyerek (Cu(II)) veya nikel (Ni(II)) Özellikler Au(III) tarafından takip, bu yöntem ortaya bir bağlama sitesi kırmızı fluorophore değil Au(III). İkinci olarak, BSA ajanlar kapatma thiol tarafından değiştirerek, başka bir nonfluorophore oluşturan Au(III) bağlama site ortaya çıkıyor. Üçüncü olarak, BSA conformation fizyon ve disülfür bağları kapatma değiştirme, mümkün Au(III) bağlama site (ler) gösterilmiştir. Diğer proteinler ve metal katyonlar etkileşimler çalışmaya, BSA biçimler ve Au(III) bağlama, kontrol etmek için açıklanan protokol genel olarak uygulanır.

Giriş

Bir ultraviyole (UV) sergileyen bir BSA-Au bileşik-dikkat çekici ile heyecanlı kırmızı floresans shift stokes, başlangıçta Xie ve arktarafından sentezlenen. 1. benzersiz ve istikrarlı kırmızı floresans alanlarda2,3,4,5,6,7görüntüleme veya nanomedicine8 algılama gibi çeşitli uygulamalar bulabilirsiniz ,9,10,11,12,13. Bu bileşik, nano-bilim son yıllarda14,15,16, alanında birçok araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. BSA-Au bileşik Au25 nanoclusters yorumlanır. Bu bileşik ayrıntılı incelemek ve kırmızı floresans kökenini anlamak için sunulan Yöntem hedefidir. Sunulan yaklaşım takip ederek, birden çok Au bağlayıcı siteleri, varlığı ve floresan, Au25 nanoclusters, tek-site çekirdekleşme alternatif kökeni resimli. Aynı yaklaşım diğer proteinler17,18,19 Au(III) ile complexed içsel floresan özelliklerini değiştirebilirsiniz nasıl eğitim için istihdam edilebilir.

Kırmızı-floresan BSA-Au bileşik sentezi BSA floresan yoğunluğu ve uyarma-emisyon harita (EEM)20Peaks'e konumunu en üst düzeye çıkarmak için Au (BSA:Au) için molar oranları dar bir denetimi gerektirir. Bu birden çok bağlayıcı siteleri Au(III) bağlamak, mevcut Asparagine parçası (veya Asp parça, ilk dört amino asit kalıntıları, N-terminus, BSA) de dahil olmak üzere gösterilebilir21,22. BSA (Cys-34) 34th amino asit de Au(III) koordine etmek ve kırmızı fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20yönteminde dahil olmak gösterilir. Tüm Cys-Cys disülfür bağları fizyon ve tüm thiols, kırmızı floresans kapatma üzerine üretilen ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). değil Bu kırmızı floresans üretmek için Au(III) bağlama site olarak Cys-Cys disülfür bağları gerekliliğini gösterir.

Protein Kimya teknikler yaygın olarak BSA-Au(III) kompleksleri nano-bilim toplumda eğitim için kullanılmış değil. Ancak, BSA Au(III) bağlama sitelerin detaylı bilgi sahibi olarak bu komplekslerin, de bazı yönlerini anlamak için bu teknikler istihdam için değerli olacaktır. Bu makalede bazı teknikler göstermek için tasarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. BSA-Au(III) kompleksinin sentezi

  1. BSA 25 mg 1 ml 5 mL tepki şişe yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sınıf suda çözülür.
    Not: Çözüm net görünmesi gerekir.
  2. HPLC sınıf suda 5 mM bir konsantrasyon için altın (III) klorür trihidrat (chloroauric asit) geçiyoruz.
    Not: Çözüm sarı görünmesi gerekir. Chloroauric asit solüsyonu bu konsantrasyonu hazırlanan bir BSA Au oranı 1:13 neden olur.
    1. Alternatif olarak, chloroauric asit bir çözüm herhangi bir yerde bir konsantrasyon ile hazırlamak 0,38 mM arasında (BSA:Au = 1:1) 20 mm (BSA:Au = 1:50) içinde HPLC sınıf su.
      Not: BSA farklı oranlarda altın uyarma-emisyon haritanın büyük ölçüde farklı kırmızı floresans desenleri neden olur.
  3. Bir 37 ° C su banyosunda BSA tepki şişe yerleştirin ve 750 bir manyetik karıştırıcı kullanarak devir / dakikada karistirin.
  4. Hemen karıştırma başladıktan sonra 1 mL chloroauric asit ekleyin. Belgili tanımlık eriyik rengini net sarıya dönüştürmek.
  5. 2 min için karışımı ilave edin 37 ° C'de ve 750 rpm bir manyetik karıştırıcı kullanarak.
  6. Reaksiyon şişe 100 μL 1 M NaOH pH 12'ye getirmek için çözüm ekleyin.
    Not: Hemen NaOH eklendikten sonra çözüm biraz sarı-kahverengi için karartmak ve daha sonra geri dönmek için sarı.
  7. 2 h için 750 rpm ve 37 ° C'de karıştırmaya devam Çözüm yavaş yavaş sarıdan koyu sarı/kahverengi renk için değiştirmeniz gerekir. Bu renk değişikliği kırmızı Floresanda BSA-Au(III) karmaşık oluşumu gösterir.
  8. Örnek oda sıcaklığında 2 gün boyunca oturmak izin ve çözüm bir kehribar Brown'a koyulaştırmak devam edecek ve floresan yoğunluğu artacaktır.
    1. Alternatif olarak, çözüm rengini bir amber kahverengi geliştikçe daha fazla h 12 37 ° C'de karıştırmaya devam örnek ver.

2. BSA-Cu(II)-Au(III) sentezi

  1. BSA 25 mg 1 mL HPLC sınıf su içinde çözülür. Çözüm net görünmesi gerekir.
  2. Bakır (II) klorür dihydrate HPLC sınıf su konsantrasyonu 5 mm geçiyoruz. Çözüm ışık görünmelidir mavi.
  3. Sulu BSA çözüm 1 mL 5 mL tepki şişe ekleyin ve bir su banyosu 37 ° C'de yer Karışımı 750 devir / dakikada ilave edin.
  4. Hemen 0,5 mL bakır (II) klorür dihydrate çözeltisi tepki flakon ve 2 min için karıştırın. Çözüm ışık kalır mavi.
  5. 12'ye pH getirmek ve 2 h için karıştırmak için izin vermek için 1 M NaOH 75 μL ekleyin. Belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak mor.
  6. Chloroauric asit konsantrasyonu 5 mm HPLC sınıf suda çözülür.
  7. 0.5 mL sulu chloroauric asit reaksiyon şişeyi ekleyebilir ve pH geri 12 1 M NaOH kullanarak ayarlayabilirsiniz.
  8. 2 h reaksiyon karışımı ilave edin.
    Not: Çözüm için kahverengi bir renk gelişmesi gerektiğini.

3. BSA-Ni(II)-Au(III) sentezi

  1. BSA 25 mg 1 mL HPLC sınıf su içinde çözülür. Çözüm net görünmesi gerekir.
  2. HPLC sınıf su konsantrasyonu 5 mm nikel (II) klorür hekzahidrat geçiyoruz. Çözüm ışık görünmesi gereken yeşil.
  3. Sulu BSA çözüm 1 mL 5 mL tepki şişe ekleyin ve bir su banyosunda 37 oC. heyecan 750 rpm karışımı yerleştirin.
  4. Hemen tepki flakon ve 2 min için karışımı 0.5 mL nikel (II) klorür hekzahidrat çözeltisi ekleyin.
    Not: Çözüm ışık kalır yeşil.
  5. 12'ye pH getirmek ve 2 h için karıştırmak için izin vermek için 1 M NaOH 75 μL ekleyin.
    Not: Çözüm koyu sarı olacak.
  6. Chloroauric asit konsantrasyonu 5 mm HPLC sınıf suda çözülür.
  7. 0.5 mL sulu chloroauric asitin reaksiyonu şişeyi ekleyebilir ve geri ile 12 pH ayarlayabilirsiniz.
  8. 2 h reaksiyon karışımı ilave edin.
    Not: Çözüm için kahverengi bir renk gelişmesi gerektiğini.

4. [Cys34-capped-BSA]-Au(III) sentezi

  1. N-ethylmaleimide (NEM) 2 mg fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) 1 mL geçiyoruz.
  2. BSA 2 mg 1 mL PBS-NEM çözeltisi içinde çözülür.
  3. Çözüm 5 mL tepki şişe aktarmak ve 20 ° c için 1 h 500 rpm'de ilave edin.
  4. PBS, 50 rpm'de unreacted NEM kaldırmak için bir manyetik karıştırıcı ile gecede karıştırarak 500 ml 12 kDa diyaliz boru kullanarak çözüm diyaliz.
  5. Chloroauric asit konsantrasyonu 0.4 mM için PBS çözülür.
    Not: Bir soluk sarı çözüm olacaktır.
  6. Reaksiyon şişe su banyosu 37 ° C'de transfer 750 devir / dakikada ilave edin.
  7. Reaksiyon flakon 1 mL chloroauric asit çözeltisi eklenir ve 2 min için karıştırmak için izin.
  8. 75 μL 1 M NaOH pH 12'ye getirmek ve 2 h için karıştırmak için izin vermek için tepki şişe ekleyin.

5. [all-thiol-capped-BSA]-Au(III) sentezi

  1. 2 M üre ve 50 mM Amonyum Bikarbonat (NH4HCO3, pH 8.0) HPLC sınıf su çözeltisi hazırlamak.
  2. BSA 3.3 mg 1 ml Yukarıdaki çözüm ve 5 mL tepki şişe transfer geçiyoruz.
  3. Bir hisse senedi çözüm 0.25 m olun tris(2-carboxyethyl) TCEP 62,5 mg 1 mL HPLC su içinde eriterek tarafından fosfamin (TCEP).
  4. TCEP son konsantrasyonu 8 mM olana TCEP hisse senedi çözüm tepki şişe ekleyin.
  5. Bir su banyosu için 1s 50 ° C'de çözümde kuluçkaya Manyetik karıştırıcı kullanarak 500 rpm'de karıştırın.
  6. Çözüm için tamamen oda sıcaklığında soğumaya izin verin.
  7. Bir hisse senedi çözüm 100 mm NEM NEM 12.5 mg 1 ml HPLC sınıf su çözülerek hazırlayın.
  8. NEM son konsantrasyonu 16 mM kadar NEM hisse senedi çözüm tepki şişe ekleyin.
  9. 20 ° C'de 2 h için birleştirmek çözüm izin verin 500 rpm'de karıştırın.
  10. Çözüm 50 rpm'de aşırı TCEP, NEM ve üre kaldırmak için bir manyetik karıştırıcı ile geceleme 500 mL 50 mM NH4HCO3 karıştırarak bir 12 kDa diyaliz boru kullanarak çözüm diyaliz.
  11. Bir su banyosu 37 ° C'de tepki şişe taşımak ve 750 devir / dakikada ilave edin.
  12. Chloroauric asit 0,66 mM bir konsantrasyon için HPLC sınıf suda çözülür.
  13. Reaksiyon flakon 1 mL chloroauric asit çözeltisi eklenir ve 2 min için karıştırmak için izin.
  14. Çözüm pH 12 kadar 1 M NaOH ekleyin ve 2 h için karıştırmak devam etmek çözüm sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

BSA-Au(III) karmaşık floresans, o bu gözlenmiştir BSA içsel mavi floresans çevrimi (λem 400 = nm) kırmızı floresans için (λem 640 = nm) pH 9,7 bir denge ile ilgili oluşur geçiş (Şekil 1). EEM BSA-Au(III) Au molar oranları farklı BSA, Şekil 2' de gösterilen ve bu verileri nasıl molar oranı değiştirme aynı emisyon dalga boyu farklı uyarma dalga boylarında, verimleri gösterir. Cu(II), Ni(II) v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PH 12 hazırlanan BSA-Au(III) bileşikler kırmızı floresans bir emisyon dalga boyu λemadlı sergi 640 = ultraviyole (UV) ışık λexile heyecanlı zaman nm = 365 nm (Şekil 1A). Kırmızı floresans ortaya çıkması yavaş bir süreçtir ve bir kaç gün için maksimum yoğunluğu artırmak için oda sıcaklığında alacak. Yüksek sıcaklık kırmızı floresans daha hızlı üretmek için kullanılan rağmen tepki 37 ° C'de çalıştıran optimum sonuçlar verecektir. Geri dönüşü olmayan bozulma prote...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

S.E. Duke bağış özel girişim Fonu, Wells Fargo Fonu, ilaç Vakfı yanı sıra başlangıç fonlar üzerinden University of North Carolina, desteğinden Charlotte kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA),% 96Sigma-AldrichA5611
altın (III) klorür trihidrat,% 99.9Sigma-Aldrich520918
Bakır (II) klorür dihidrat,% 99.999Sigma-Aldrich459097
Nikel (II) klorür hekzahidrat,% 99.9Sigma-Aldrich654507
N-Etilmaleimid (NEM),%>99.0Sigma-Aldrich4259
Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP), %>98.0Sigma-AldrichC4706
Sodyum hidroksit, %>98.0Sigma-AldrichS8045
Üre, %99.5Chem-Implex Int'l30142
Fosfat tamponlu salin (PBS)CorningMT21040CV
Amonyum bikarbonat, 99.5%Sigma-Aldrich9830

Kaynaklar

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Altın(III) BağlanmasıFloresan OluşumupH AyarlamasıKonformasyonel DeğişimMetal Bağlanma AlanlarıTiyol KaplamaDisülfit Bağı KoparılmasıÜre UygulamasıTCEP İndirgemesi
Sığır Serum albümin Gold(III) bağlama tarafından çeşitli biçimler Luminophore oluşumu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.