Yöntem makalesi

Bitki çözünür Protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği, Mısır (Zea mays) kullanarak bir suret olarak miktarının

DOI:

10.3791/58164

⸱

6 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokoller bir açık ve ulaşılabilir metodoloji çözünür protein ve bitki dokularında sindirilebilir (yapısal olmayan) karbonhidrat içeriği ölçmek için sağlar. Bu iki bitki macronutrients ölçmek için yetenek bitki fizyolojisi, beslenme ekoloji, bitki-otobur etkileşimleri ve gıda-web ekoloji alanlarında ilerlemek için önemli etkileri vardır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temel veri otobur için bir kaynak olarak bitki kalite anlaması için yaygın olarak kullanılır. Ancak, aynı anda her yerde biomolecules karbon, azot içeren bitki savunma bileşikleri ve species-specific korelasyon azot ve bitki protein içeriği tüm arasında varyasyon varlığı bu çıkarımlar doğruluğunu sınırı. Ve ayrıca, bitki üzerinde araştırma odaklı/veya otobur Fizyoloji gerektiren korelasyon kullanarak elde değil doğruluk düzeyine Genelleştirilmiş. Burada sunulan yöntemleri doğrudan bitki çözünür proteinler ve sindirilebilir karbonhidrat, en yakın hayvan fizyolojik performans bağlı iki bitki macronutrients ölçmek için net ve hızlı bir iletişim kuralı araştırmacılar sunuyoruz. Protokoller de karakterize Renkölçer deneyleri kesin ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için en iyi duruma getirilmiş özel bitki sindirim adımları ile birleştirin. Farklı dokular bu deneyleri değişimini algılamak için hassasiyet gösteriyor ki Mısır bizim analizlerini çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği birden çok kayma ölçekler arasında bitki. Bunlar bölgeler ve bitki türleri ve çeşitleri arasında büyüyen bitki arasında farklılıklar içerir, aynı zamanda içinde-doku türü farklılıkları ve aynı doku içinde bile pozisyonel farklılıklar bitki. Çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği ile temel veri birleştirerek bitki mineral beslenme bitki fizyolojik işlemleri ile bağlamak için yeni fırsatlar bitki biyoloji sağlar potansiyeline sahiptir. Bu analizler de çözünür protein ve besin ekoloji, bitki-otobur etkileşimleri ve sırayla fizyolojisi ve ekolojik araştırma artıracaktır gıda-web dinamikleri, çalışma için sindirilebilir karbonhidrat verilerini oluşturmak yardımcı olur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki Biyokütle hemen hemen tüm karasal gıda-ağları temelini oluşturur. Bitki kökleri sistemleri aracılığıyla topraktan besin öğeleri kazanmak ve güneş ışığında biomolecules sentezlemek için onların yaprak dokuları kullanmak. Özellikle, karbon ve azot karbonhidratlar, proteinler (amino asitleri oluşur) oluşturmak için kullanılır ve bitki biyokütle (Bu içinde terim "macronutrient" N gibi toprak öğeleri sık sık başvurduğu fizyolojisi bitki olması gerekmektedir için gerekli lipidler inşa P, K ve S, ancak, bu kağıt bu terim biomolecules, proteinler, karbonhidratlar ve yağlar gibi sevk edecektir). Otobur bitki materyali tüketmek zaman bitki dokularda bulunan macronutrients kurucu onların parçaya ayrılmış ve sonra tüketici fizyolojik süreçleri çevirirdi. Bu şekilde, bitki macronutrients daha yüksek sipariş ekolojik etkileşimleri ve gıda-web dinamikleri için önemli sonuçları ile birlikte tüketici fizyolojisi üzerinde güçlü bir etkisi var.

Hayvanlar alemi arasında en çok hayatta kalma ve üreme performansı1' e bağlı macronutrients çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat vardır. Ayrıca, hayvanlarının çoğu aktif olarak kendi fizyolojik talepleri1,2karşılamak için bu iki macronutrients onların alımını düzenleyen. Bu sırayla beslenme davranışı yönlendirir özellikle şeker ve amino asitleri konsantrasyonları bitki dokularda algılamak böcek otobur için geçerlidir. Sonuç olarak, çözünür protein bitki ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği bitki böcek etkileşimleri evriminde güçlü bir rol oynamıştır.

Veri bitki çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği nispeten nadirdir (ama bkz.6,7,8,9,10,11), orada iken bir üstünlüğü veri bitki elemental içerik (karbon, azot ve fosfor) kullanılabilir. Oyun elemanları bir birincil rolü bitki mineral beslenme3,4,5' te büyük ölçüde olmasıdır. Öğeleri ölçülür, korelasyon çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat miktarını tahmin için kullanılan, ama doğru hesaplamalar kez elde etmek zordur. Örneğin, karbon tüm organik bileşikler ubiquitously bulunduğundan karbon bitki sindirilebilir karbonhidrat içeriği bir göstergesi olarak kullanmak mümkün değildir. Elemental azot ve bitki çözünür protein içeriği arasında güçlü bir ilişki var ve jeneralize azot protein dönüştürme faktörlerini sık sık kullanılmaktadır. Ancak, azot protein dönüşümler Genelleştirilmiş dönüşüm kullanımı büyük olasılıkla yapmak son derece species-specific12,13,14,15, olduğuna dair güçlü bir kanıt yoktur yanlış. Bu nedenle, azot protein dönüştürme faktörleri genellikle hassas, özellikle otobur beslenme çalışmaları için gerekli ölçüde değildir. Ayrıca, N içeren bitki allelochemicals, alkoloidler ve çoğu kez otobur için toksik glucosinolates gibi varlığı bu dönüşümleri yıkmak.

Burada, çözünür proteinler ve bitki dokularında sindirilebilir karbonhidrat konsantrasyon ölçmek için iki kimyasal deneyleri sunuyoruz. Bu deneyleri ayrı olarak sunulur, ancak bu onlar aynı anda aynı bitki örnekleri analiz etmek için bitki macronutrients daha kapsamlı bir analizini gerçekleştirmek için kullanılması önerilmektedir. Her ikisi de benzer yöntemleri, miktar tarafından absorbans takip bir ayıklama adım oluşan istihdam. Bitki örnek hazırlık da her iki analizleri tandem çalıştırmak kolaylaştıran her iki protokoller için aynıdır. Bu deneyleri programı-değil kök kendi yenilik--dan onlar büyük, itimat gibi (Bradford, Jones, Dubois) biz düzenlenen bir açık ve takip etmek kolay köklü Renkölçer deneyleri16,17,18, ama burada Bu yöntemlerin daha karanlık bitki özel ayıklama teknikleri17,19 ile bir araya getiren bu deneyleri uygulanması için bitki ilgili alanları daha erişilebilir hale getirmek için iletişim kuralı.

Her iki deneyleri için bitki macronutrients ilk fiziksel olarak buz gibi lyophilizing ve bitki materyali taşlama ayıklanır. Çözünür protein tayini için daha fazla kimyasal ayıklama17,19 vortexing ve NaOH çözüm örnekleri Isıtma birkaç tur üzerinden yapılır. Coomassie parlak mavi G-250, kullanan tanınmış Bradford tahlil daha sonra çözünür proteinler ve polipeptitler 3000-5000 Dalton16,17arasında ölçmek için kullanılır. Bu tahlil Mikroplaka başına 1-20 µg toplam proteinler arasında bir algılama mesafesi de vardır veya < 25 µg/mL, ama değil ölçü birimi serbest amino asitleri. Ayıklama adım sindirilebilir karbonhidrat testin Smith et al. seyreltik asit yöntemini temel alır 20 ve çözünür şekerler, nişasta ve fructosan- ama değil yapısal karbonhidratlar izolasyonu için sağlar. Fenol sülfürik asit miktar yöntemi Dubois ve ark. alınır 18 ve tüm mono-, oligo-ve polisakkaritler (yanı sıra metil türevleri) ölçer. Bu tahlil belirli şekerler ölçmek, ama burada toplam sindirilebilir karbonhidrat içeriği bir göstergesi olarak kullandığımız (Smith et al. bkz: 20 daha ayrıntılı analiz için). Birlikte, bu deneyleri Eko-Fizyoloji ve otobur performans, önemli veri kaynak kalite karasal gıda-ağları üssünde sağlayan bitki güçlü bağlı iki macronutrients ölçü. Bu protokoller sunulması bitki macronutrient veri kümeleri nesil bitki fizyolojisi, otobur beslenme ekoloji ve bitki-otobur etkileşimleri daha kapsamlı bir anlayış elde etmek için teşvik etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bitki toplama ve işleme

  1. Toplamak ve bitki örnekleri işleme
    1. Bitki örnekleri topladıktan sonra flash-örnekleri forseps ve-80 ° C'de mağaza sıvı azot bitki materyali daldırma donma Eğer bitki numuneleri flaş donma, hızlı bir şekilde serin kuru buz ve transfer-80 ° C dondurucu için en kısa zamanda kullanarak örnekleri için fazla büyüktür. Sonra en kısa zamanda toplandıktan sonra bitki örnekleri dondurmak önemlidir bu yüzden bitki, doku ayrılır bitki materyali macronutrient içeriğini değiştirebilirsiniz.
      Uyarı: Sıvı azot ne zaman cilt ile temasında ciddi donma neden olabilir. Lütfen onaylı kaplarda sıvı azot taşıma ve uygun KKE cryo-eldiven, göz googles, yüz kalkan, önlük ve önlük gibi kendi işleme sırasında giymek emin olun.
    2. Bitki materyali su kaldırılmakta iken dokularda metabolik olarak aktif olmasını sağlamak için donma kurutma makinesi kullanarak lyophilize. Tüm su kaldırıldığından emin olmak için örnek kitle kadar kuru stabilize.
    3. Bir kez kuru olduğu, bir değirmeni veya değirmen kullanarak ince bir toz eziyet. Örnekleri analiz kadar ancak bir dolapta saklamak.

2. çözünür Protein tahlil

  1. Numune hazırlama
    1. Her doku, yaklaşık 20 mg her, Çoğalt örnekleri tartmak 1,5 mL polistren microcentrifuge tüpler ve etiket tüpler içine. Bu örnekler daha sonra bilinmeyen örnek olarak sevk edilecek. Bu bilgi her bilinmeyen örnek % çözünür protein hesaplamak için gerektiği şekilde her örneğinin tam kitle kaydedin. Sigara kilitleme kapağı kaybı örnek çözümü ile sonuçlanan sonraki Isıtma adım sırasında açılabilir gibi microcentrifuge tüpler kilitleme kapağı ile kullanın.
  2. Solubilize ve bilinmeyen örnek protein izole
    1. Bir mikro-pipettor kullanarak, 0.1 M NaOH 500 µL her tüp için ekleyin. Kapaklarını sıkıca kapatın ve 30 dakika için solüsyon içeren temizleyicide. Bir sıcak su onceden 90 ° C. banyo
      Uyarı: Sodyum hidroksit güçlü bir başlangıç noktasıdır ve zaman cilt ile temasında yanıklara neden. Her ne kadar düşük bir konsantrasyon 0.1 M NaOH temsil eder, cilt tahrişi önlemek için koruyucu eldiven giymek.
    2. Tüpler 15 dakika boyunca sıcak su banyosu bir rafa yerleştirin.
    3. 15.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi 10 dakika boyunca. Her örnek için yeni bir pipet ucu kullanarak yeni etiketli microcentrifuge tüpler içine süpernatant sıvı pipette. 300 µL 0.1 M NaOH Pelet ve santrifüj tekrar 15.000 x g de 10 dakika boyunca içeren tüp ekleyin. Yine, süpernatant sıvı toplamak ve aynı örnekten diğer süpernatant sıvı ile birleştirin. Bu nokta durdurma bir potansiyel ve örnekleri 4 ° C'de gecede gerekirse depolanabilir.
  3. Bitki proteinleri çökelti
    1. Turnusol kağıdı her örnek çözüm daldırma tarafından 5,8 M HCl. Onayla ~ 7 pH 11 µL ekleyerek süpernatant çözüm pH nötralize.
      Uyarı: Hidroklorik asit cilt zaman (Cilt uygulama veya inhalasyon) ile temasında yanıklara neden güçlü bir aşındırıcı asittir. Lütfen HCl işleme sırasında cildi tahriş önlemek için eldiven tak.
    2. Her tüpün 90 µL % 100 trichloroacetic asit (TCA) ekleyin ve buz üzerine boruları 30 dakika boyunca kuluçkaya. Proteinlerin yağış çözüm net için opak dönecek. Bu 30 dakika sonra oluşmazsa, tüpler için 1 saat buzdolabında bekletin. Bu nokta durdurma bir potansiyel ve örnekleri 4 ° C'de gecede gerekirse depolanabilir.
      Uyarı: Trichloroacetic asit aşındırıcı. Lütfen Ciltle temas önlemek ve inhalasyon önlemek için işlerken eldiven.
    3. Santrifüj örnekleri 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de Dikkatli bir şekilde TCA süpernatant ince cam micropipette bahşiş (aynı uç örnekler üzerindeki kullanılabilir) bağlı bir vakum hattı numaralarını kullanarak suctioning tarafından çıkarın. Protein Pelet ağır emme kaçınarak ve Pipet Ucu ve Pelet arasında uygun bir mesafeyi tarafından rahatsız etmeyin.
    4. Pelet hızlı 100 µL-20 ° C aseton ile yıkayın. Bu adım ile sonraki Bradford tahlil engelleyebilir Pelet herhangi bir geri kalan TCA kaldırır; Ancak, Aseton Aseton sonra hızlı bir şekilde Pelet 5 saniye içinde çıkarılan eklenmesi gerektiğini böylece kişide çok uzun bırakılırsa protein Pelet çözülmeye başlar.
    5. Aseton bir duman hood veya buzdolabı tüpler yerleştirerek buharlaşır izin. O zaman, protein Pelet her tüp için 1 mL 0.1 M NaOH ekleyerek geçiyoruz. Tam olarak pelet eriterek Isıtma sıcak su birkaç tur gerektirebilir Hamamı, vortexing ve sonicating.
      Not: Uzun tüpler duman mahallede oturmak ya da buzdolabı ve Kuru granül, daha zor onlar yeniden solubilize için olacak. 30 dakika boyunca Pelet Makinası için önerilen ve aseton varlığı için kontrol her 10-15 dakika bu kadar temizleyin aseton buharlaşıp vardır (hiçbir aseton duman tespit).
  4. Standart çözümler karıştırmak, bilinmeyen örnek çözümler sulandırmak ve Bradford tahlil kullanarak bilinmeyen örnekleri toplam protein içeriği ölçmek.
    1. Sığır immünoglobulin G (IgG) standart çözümler (liyofilize veya IgG hisse senedi çözüm her toplama ulaşmak için deiyonize su ile karıştırılabilir) Tablo 1 ' deki listelenen konsantrasyonları göre hazırlayın. Standartları 4 ° C'de depolayın Bir 96-şey tabak içinde 160 µL onaylatılacak iyi plaka A1 konumdan başlayarak her IgG standart çözüm Ekle (0 µg/µL A1, A2, A3 konumlandırın, B1, B2, B3 0.0125 µg/µL pozisyonlar, vb).
    2. Seyreltilmiş NaOH çözüm için 950 µL distile su 50 µL 0.1 M NaOH ekleyerek hazırlayın. Boş bir negatif kontrol bu çözümün 60 µL nüsha (G1, G2, G3 pozisyonlar) iyi plaka ekleyin.
    3. Dilutions bilinmeyen örneklerinin her örnek çözüm 50 µL 950 µL distile su yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyerek hazırlayın. Daha sonra seyreltilmiş her örneğinin 60 µL nüsha, H1 konumdan başlayarak iyi plaka ekleyin. 96-şey plaka 6 standartları, 1 boş ve ne zaman nüsha okumak 25 bilinmeyen örnek analizi için izin vermelidir. Analiz her iyi plaka kendi IgG standart ve boş örnekleri içermelidir.
    4. 100 µL distile su tüm boş ve bilinmeyen örnekleri wells için ekleyin. Şimdi her şey toplam 160 µL. bir çok kanallı pipet (8 kanal), kullanarak içermelidir Coomassie parlak mavi G-250 protein 40 µL boya her şey iyi plaka ilk sütunda ekleyin. Boya örnekleri ile birkaç kez dalan tarafından karıştırın. Pipet ipuçları kirlenmesini önlemek için eski yerine koymak tüm diğer sütunlar için yineleyin.
      Uyarı: Coomassie parlak mavi G-250 bir tahriş edici ve ciltle, eyes, temas ya da akciğerler kaçınılmalıdır. Lütfen Ciltle temas önlemek için eldiven tak. Ciltle temas ortaya çıkarsa, bu ürün leke.
    5. Mikroplaka spektrofotometre okuma ile girişime neden olabilir gibi wells, varsa kabarcıkları pop için bir iğne kullanın. İğneyi kuyular arasında kirlenmesini önlemek için temizlemek. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya Mikroplaka izin.
    6. Mikroplaka spektrofotometre kullanarak kayıt 595 her kuyuda absorbans değerleri nm.
    7. Üç boş kuyuları için Ortalama absorbans kaydedebilir ve her standart ve bilinmeyen örnek okumalar bu değerden çıkarmak. Sonra her standart ve bilinmeyen örnek için Ortalama absorbans kaydedin.
      Not: Standart eğri kullanarak bilinmeyen her örnekte mevcut protein miktarı hesaplamak için bu her standart protein her standart mevcut mikrogram karşı ortalama absorbans gerileme en kolay, ama bir protein konsantrasyonu (µ çizebilirsiniz g/µL) Eğer arzu edilen her standart. Ancak, aşağıdaki hesaplamaları mikrogram, değil konsantrasyonları (µg/µL) dayalı standart bir eğri bakın.
    8. Her standart karşı protein her standart iyi (Tablo 1) mevcut toplam miktarı ortalama absorbans arsa. Bir doğrusal regresyon çizgisinin bu verilere uygun ve denklemi protein (µg) iyi ortalama absorbans (Şekil 1a) dayalı bilinmeyen her örnek miktarı hesaplamak için kullanın.
      Not: Bu satırın korelasyon katsayısı (r değeri) 0,98 daha ve rutin olarak 0,99 yakınındaki büyük olmalıdır. Standart regresyon her plakasına belirli olacak, bu nedenle her plaka bilinmeyen örnek wells ayrı ayrı analiz gerekir.
    9. Bir kez ortalama protein miktarı için her bilinmeyen örnek iyi hesaplanır, protein (µg) özgün her örnek içinde toplam miktarı hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp µg orijinal örnekteki protein =
      Wp µg bilinmeyen örnek proteinin de =
      1. Sonra aşağıdaki denklemi her örnek protein yüzdesini belirlemek için kullanın:
        Pp = ((Mp/1000) /Mi) * 100
        Pp örnek % protein =
        Mben ilk örnek (mg) kütlesi =
        Not: bazı durumlarda, örnek üst absorbans eşiğini aşan. Eğer öyleyse, örnek çözümler daha fazla seyreltme adımda 2.4.3 gereken.
        Ek dilutions sonra için sonraki hesaplamalarda muhasebesi gerekir. Bazı Mikroplaka Okuyucu markalar da otomatik olarak standart eğri verilere göre bilinmeyen her örnek ortalama protein konsantrasyonu hesaplar bilgisayar yazılımı sağlar.

3. sindirilebilir karbonhidrat tahlil

  1. Numune hazırlama
    1. İçine 15 mL tüpler vidalı kapakları (100 mm uzunluk) kauçuk kaplı cam, her doku, yaklaşık 20 mg Çoğalt örnekleri tartın. Bu örnek daha sonra bilinmeyen örnek olarak sevk edilecek. Borular su geçirmez bir marker ile veya kaset kapakları etiketleme ile etiket ve bu bilgileri bilinmeyen her örnek % karbonhidrat hesaplamak için gerektiği şekilde her örneğinin tam kitle kaydedin.
  2. Sindirilebilir karbonhidrat bilinmeyen her örnekten ayıklayın.
    1. 4 her tüp ve vidalı kapakları üzerine sıkıca Tüpler 1 mL 0.1 M H2ekleyin. Bir kaynar su banyosunda 1 saattir yerleştirin.
      Uyarı: Sülfürik asit çok aşındırıcı. Lütfen H2çok işlerken eldiven, göz googles ve bir önlük giymek4 ve duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
    2. Ilık su banyosu tüplerde serinleyebilirsiniz. Tüp içeriği (bitki bazı maddi kalıntıları cam tüplerde Eğer endişe etme) microcentrifuge tüpler etiketli 1,5 mL dökün.
    3. 15.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi 10 dakika boyunca. Bir mikro-pipettor ve yer ile süpernatant sıvı yeni etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine kaldırın. Tüpler gecede bu noktada buzdolabında. Tahlil ile devam eden, 3.3.2 adıma bakın.
  3. Standart çözümler mix ve bilinmeyen örnekleri toplam sindirilebilir karbonhidrat içeriği ölçmek.
    1. D(+) glikoz konsantrasyonu ile standart çözümler Tablo 2' de listelenen hazırlamak. Her standart çözüm 400 µL altı cam test tüplerini hazırlayın.
    2. 15 µL bilinmeyen her örneğinin kendi test tüpüne pipet ve her biri için her test tüpü içinde 400 µL toplam hacmi 385 µL distile su ekleyin. Duman hood, 400 µL % 5 fenol, her standart ve bilinmeyen bir örnek test tüpü ekleyin ve sonra hızlı bir şekilde 2 mL konsantre H2SO4 her tüpün içine pipet. Pipet Ucu tüp içeriği dokunmatik değil, sadece (tekrarlayıcı pipet en iyi bunun için çalışır) çözüm yüzey ekleyin.
    3. 10 dakika için kuluçkaya tüpler izin ve sonra dikkatle girdap içeriğini karıştırmak için tüpler. Ek bir 30 dakika kuluçkaya.
      Uyarı: Fenol ve sülfürik asit aşındırıcı tahriş edici vardır. Cilt, göz ve inhalasyon maruz korumak için bu adımı içerir uygun KKE kullanarak bir kimyasal duman mahallede yapılmalıdır: yüz kalkan ya da göz gözlük, lastik eldiven, laboratuvar önlüğü ve bot. Fenol sülfürik asit ile de bir Ekzotermik reaksiyon sonuçlarında karıştırma, hangi sıcak olma tüplerde neden olur.
    4. Örnek her tüp 800 µL pipet her 3 polistren 1,5 mL yarı mikro cuvettes (örnek başına 3 Teknik çoğaltır). Spektrofotometre 490 okumak için ayarla nm. Standartlar ya da bilinmeyen örnekleri okumadan önce ve zaman zaman örnek okuma boyunca distile su içeren boş bir küvet için kalibre edin. Her küvet bir Spektrofotometre ile çalıştırabilir ve absorbans kayıt yapabilirsiniz. Ortalama teknik arasında bilinmeyen her örnek için çoğaltır.
      Not: bazı durumlarda, üst absorbans eşik örnekleri aşmak. Eğer öyleyse, örnekleri 3.2.3 adımda seyreltilmiş. Dilutions da için sonraki hesaplamalarda muhasebesi gerekir.
    5. Her standart için Ortalama absorbans hesaplayın.
      Not: sindirilebilir karbonhidrat bilinmeyen örnekleri standart eğri kullanarak mevcut toplam miktarı hesaplamak için bu her standart D (+) glikoz her standart mevcut mikrogram karşı ortalama absorbans gerileme en kolayıdır, ama bir de her standart D (+) glikoz konsantrasyonu (µg/µL) Eğer arzu edilen arsa. Ancak, aşağıdaki hesaplamaları mikrogram, değil konsantrasyonları (µg/µL) dayalı standart bir eğri bakın.
    6. Ortalama absorbans D (+) glikoz (µg) her standart çözüm toplam miktarı karşı komplo tarafından standart eğri hesaplamak. Bir doğrusal regresyon çizgisinin bu verilere uygun ve karbonhidratlar (µg) bilinmeyen her örnek içinde toplam miktarı hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      Mc = (((x -A b)/m)/(15)) * 1000
      Mc µg karbonhidrat örnek =
      X = ortalama absorbans bilinmeyen örneği
      b y kesişim noktası (Standart regresyon çizgisinin) =
      m = eğim (Standart regresyon çizgisinin)
      Bu satırı korelasyon katsayısı daha 0,98 ve rutin olarak 0,99 yakınındaki büyük olmalıdır. Sonra aşağıdaki denklemi her örnek karbonhidrat yüzdesini belirlemek için kullanın:
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc % karbonhidrat =
      Mben ilk örnek (mg) kütlesi =

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemler kullanışlılığı göstermek için çözünür protein ve dört farklı alan ve böcek otobur farklı potansiyel besin kaynakları olarak hizmet Mısır dokuların sindirilebilir karbonhidrat içeriği analiz. (Minnesota, Kuzey Carolina ve Texas), Amerika Birleşik Devletleri üç tarım bölgede Mısır kulakları toplanan tatlı Mısır (Yani, genotip) beş farklı çeşitleri ve alan Mısır bir değişiklik olarak bir outgroup kapsayan. Tablo 3 Özeti Bu Mısır örneklerinin ve toplanan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Köklü Renkölçer deneyleri etkili bitki özel ayıklama iletişim kuralları ile birleştirerek, aşağıda gösterildiği deneyleri bitki çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği ölçmek için makul ve doğru bir yöntem sağlar. Nasıl bu protokollerin bir suret gösterildiği gibi Mısır kullanarak bizim sonuçları farklı biyolojik ilgili kayma ölçekler arasında hassas ölçümler elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, biz bitki çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği coğrafi bölgeler, çeşitleri (veya genotip),...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sayesinde tüm kim Mısır alan koleksiyonları ile yardımcı olması bizim ortak çalışanlar, Dominic Reisig ve Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi'nde Dan Mott ve Pat Porter Texas A & M Üniversitesi'nde Lubbock, TX de dahil olmak üzere. İçin teşekkür ederiz Fiona Clissold iletişim kuralları en iyi duruma getirmek için yardımcı ve düzenlemeleri bu el yazması için sağlamak için. Bu eser kısmen Texas A tarafından desteklenmiştir & M C. Everette Salyer Bursu (Entomoloji bölüm) ve biyoteknoloji Risk değerlendirmesi hibe programı rekabetçi No 2015-33522-24099 ABD Tarım Bakanlığı izni (gaz için verilmiştir ve STB).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
mikroplaka okuyucu (spektrofotometre)Bio-RadModel 680 XR
Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif konsantresiBio-Rad#5000006450mL

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

z n r Protein NicelendirmesiSindirilebilir Karbonhidrat AnaliziBitki Dokusu AnaliziKolorimetrik Protein AnaliziFenol S lf rik Asit Y ntemiCoomassie Brilliant BlueSpektrofotometrik l mMakrobesin erik AnaliziBitki Makrobesin NicelendirmesiBesinsel Ekoloji Y ntemleri

İlgili makaleler