Bu iletişim kuralı çıkarma ve miktar hücre süspansiyonlar C. arabica L., kafein için verimli bir metodoloji ve kafein synthase enzimatik aktivite ile ifade düzeyini değerlendirmek için deneysel bir işlem açıklar Bu enzimi kodlayan gen.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) bir pürin alkaloid popüler içecekler kahve ve çay gibi mevcut olduğunu. Bu Antimikrobiyal aktivite ve doğal bir böcek ilacı olarak kabul edilir çünkü bu ikincil metaboliti kimyasal bir savunma olarak kabul edilir. Kafein Ayrıca çevredeki bitkilerin büyüme engelleyen olumsuz allelopathic etkileri üretebilir. Buna ek olarak, dünyanın her yerinden insanlar kafein analjezik ve uyarıcı etkileri için tüketmek. Kafein teknolojik uygulamalar ilgi nedeniyle bu bileşik biyosentetik yol üzerinde araştırma büyüdü. Bu çalışmalar öncelikle kafein biyosentezi düzenleyen biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları anlama üzerinde odaklanmıştır. Vitro doku kültürü biyosentetik bu yolu çalışmak için kullanışlı bir sistem haline gelmiştir. Bu makale için miktar kafein ve kafein synthase (CS) kodlama transkript düzeyleri gen (CCS1) ölçmek için adım adım bir protokol içinde hücre süspansiyonlar C. arabica L. hem de faaliyete anlatacağız.
Giriş
Kafein bitkilerin cins Coffea1tarafından uzarlar olan ikincil bir metaboliti olduğunu. Bu alkaloit methylxanthine ailesine ait ve bu patojenler ve otobur2,3olumsuz etkilerine karşı hareket edebilir çünkü bir kimya fabrikası savunma olarak kabul edilir. Buna ek olarak, bu metaboliti yaygın olarak tüketilen dünya çapında4,5kahve içecek uyarıcı özellikleri için sorumludur. Onun özellikleri nedeniyle, birkaç araştırma grubu biyosentetik yolu ve katabolizma kafein6,7....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. kafein çekme içinde hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
- C. arabica hücre süspansiyonlar9kullanın. Sürekli 100 sürekli ışık (8.3 W/m2) altında 25 ° C'de sallayarak rpm ile pH 4,3 Murashige ve Skoog ortamda iki haftada bir altkültürler tarafından süspansiyonlar bakımını yapar.
- 11 µm gözenek filtre kağıdı ve bir Buchner huni kullanarak vakum filtrasyon altında hücre hasat.
- Bir ölçek kullanarak kendine hakim hücre taze ağırlığını kayıt, alüminyum folyo poşete, onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C'de analiz kadar tutun.
- 72 h için dondurulmuş hücresel malzeme lyophilize.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan oluşum yolu ile elde edilen kafein özleri TLC-Dansitometresi tarafından Kromatografi Şekil 1' de gösterilen düzenine göre plaka örnekleri subjecting tarafından analiz edildi. Bu bileşik için hücre özleri kafein, bir eğri seviyeleri çeşitli ticari standart konsantrasyonları ile ölçmek için (Şekil 2A) kullanılır. Kafein absorbans desen görünür ışık spektrumu (UV-VIS) maksimum emilim tepe 273 kullanarak analiz nm (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada içerik kafein değerlendirmek için en uygun koşulları mevcut, CS etkinlik ve transkript düzeyleri bir vitro doku kültürü, C. arabicahücre süspansiyonlar gibi bitki. Önceki raporlar Bakımı hücreleri ışık ışınlama altında ve theobromine kültür orta huzurunda kafein, kafein ayırma yöntemleri değerlendirmek edinerek düzeyini artırmak için uygun parametreler olduğunu doğruladı ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanarak. Şu anda hücre süspansiyonlar içinde biyosentezi kafein e.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bizim Laboratuvar çalışmalarını Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS için bir hibe tarafından finanse edildi. Bu araştırma RJPK (No. 37938) CONACyT ve Sistema Nacional de Investigadores (4422) tarafından verilen bir arkadaş grubu tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar CIATEJ Bu makale yazma sırasında onun teçhizatları kullanım için teşekkür ederiz. Özel teşekkür Dr Víctor Manuel González Mendoza tesisleri için moleküler biyoloji bölümü ve Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM tüm öneriler için bu makalenin çekimler sırasında genişletilir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Murashige & Skoog Bazal tuz karışımı | FitoTeknoloji Laboratuvarları | M524 | Paket Boyutu: 50 L Reaktif (mg/L) Amonyum Nitrat (1650) Borik asit (6.2) Kalsiyum klorür, susuz (322.2) Kobalt Klorür ve boğa; H2O (0.025) Bakır Sülfat & boğa; 5H2O (0.025) Na2EDTA&boğa; 2H2O (37.26) Demir Sülfat & boğa; 7H2O (27.8) Magnezyum Sülfat, Susuz (180.7) Manganez Sülfat & boğa; H2O (16.9) Molibdik Asit (Sodyum Tuzu) & boğa; 2H2O (0.25) Potasyum İyodür (0.83) Potasyum Nitrat (1900) Potasyum Fosfat, Monobazik (170) Çinko Sülfat ve boğa; 7H2O (8.6) < > miyo-inositol (100) tiamin (10) sistein (25) sükroz (30000) 2,4-diklorofenoksiasetik asit (3) 6-benzilamin pürin (1) |
| Kafein | SIGMA | C0750-5G | STANDART-5g |
| Teobromin | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Tarayıcı-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Düzlemsel Kromatografi Yöneticisi yazılımı | CAMAG | 1.4.10 | Yazılımı |
| İzoamil alkol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Sikloheksan | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Aseton | JT BAKER | 4 L | |
| Metanol | JT BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Kloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silika jel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plaka |
| ve beta; -merkaptoetanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+) - sodyum L-askorbat | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma bazı | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hidroklorik asit %36.5-38 | JT Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | Termo bilimsel | 232227 | Kiti |
| Metil [3H] -S-adenosil metiyonin | Perkin Elmer | NET155 | 15 Ci / mmol |
| Sıvı sintilasyon şişelerinin | SIGMA | Z253081 | |
| Termostatik banyo / sirkülatör | Cole Parmer | 60714 | |
| Mikro santrifüj tüpü | 1,5 mL Eppendorf | ||
| Kriyojenik şişeler | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Santrifüj 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vorteks | Termolin, | LR 5947 | |
| Porselen harç | Fisherbrand | FB961B | |
| Filtre kağıdı | Whatman | Z274844 | Gözeneklilik ortamı |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analitik terazi | VE | HR-120 | Model HR-120 |
| Sintilasyon sayacı | Beckman Coulter | 6500 | |
| Jel fotoğraf dokümantasyon sistemi | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Kompakt UV lambası | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner hunisi | SIGMA | 2419907 | Tip 37600 karıştırıcı |
| TRIzol reaktifi | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Ters transkriptaz | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 astar | Thermo scientific | #S0131 | 100 &mikro; M |
| DNase I, RNaz içermeyen | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnezyum klorür | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Etilendiamintetraasetik asit | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP karışımı | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Yeşil qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | 25 ve mikro'nun 200 reaksiyonu için; L |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Yazılım |
| Fenol, pH 8.0, dengeli, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultra saf | USB | J75829 | 100 mL |
| İzopropil alkol | Karal | 2040 | 1 L |
| Etil alkol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Dietil pirokarbonat | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Döndürücü | LW Bilimsel | Mod. LW210 |
Kaynaklar
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sled....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
