Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur. Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Amiloid-β (Aβ) bellek bozuklukları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) neden olur. Tedavi gösterilen rağmen reklam hastaların beynindeki Aβ düzeyleri azaltmak için bunlar hafıza fonksiyonları geliştirmek değil. Bellek bozuklukları görünümünü önce beyinde Aβ toplar beri Aβ hedefleme zaten bellek açıkları sergileyen reklam hastaları tedavi etmek için verimsiz olabilir. Bu nedenle, aşağı akım Aβ birikimi nedeniyle sinyal reklam geliştirme önce engellenmelidir. Aβ aksonal dejenerasyon, nöronal ağlar ve bellek bozuklukları kesintiye uğraması için önde gelen neden olmaktadır. Aβ toksisite mekanizmalar üzerinde birçok çalışma olmasına rağmen kaynak Aβ toksisitesi bilinmemektedir. Kaynağını belirlemeye yardımcı olması için mikroskopi, gen transfection ve canlı hücre tarafından Aβ kültürlü nöronların aksonal büyüme koni içinde neden erken değişiklikleri öğrenmek için Imaging kullanan yeni bir iletişim kuralı öneriyoruz. Bu iletişim kuralı Aβ endositoz inhibisyonu Aβ toksisite engel olduğunu gösteren clathrin aracılı endositoz büyüme koni çöküntü, takip aksonal büyüme koni içinde indüklenen saptandı. Bu iletişim kuralı Aβ erken etkileri okumak yararlı olacaktır ve daha verimli ve önleyici reklam tedavi neden olabilir.
Giriş
Amiloid-β (Aβ) mevduat Alzheimer hastalığı (Ah) hastalarda beyin bulunur ve nöronal ağlar, bozabilir reklam1 bellek bozuklukları2,3,4' e giden kritik bir nedeni olarak kabul edilir. Birçok klinik ilaç adaylarının etkili amiloid-β (Aβ) üretim önlemek veya Aβ mevduat kaldırma gösterilmiştir. Ancak, hiçbiri reklam hastalar5işlevinde bellek iyileştirmede başarılı olması. Aβ bellek bozuklukları6başlangıcından önce beyinde yatırılır; Bu nedenle, hastaların beyinlerinin seviyelerinde Aβ azalan sergileri bellek b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Toyama Üniversitesi Sugitani kampüsünde yapılmıştır ve hayvan bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Sugitani kampüsünde Komitesi tarafından kabul edildi Üniversitesi, Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. Daralt tahlil
- Poli-D-lizin kaplama
- 8-şey kültür slaytlar ile 5 μg/mL poli-D-lizin (PDL) 400 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kat ve onları gece 37 ° C'de kuluçkaya.
- PDL çözümü kaldırmak ve wells 3 kez distile su ile yıkayın.
- Nöron kültürü24
- Embriyonik gün 14 (E14) ddY fareler mi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kuluçka Aβ1-42 toksik formları27,28,30,35üretmek için ihtiyaç vardı çünkü bu protokol için kullanmadan, 7 gün için 37 ° C'de Aβ1-42 inkübe. Bu kuluçka sonra Aβ toplanan formları (Şekil 1A) tespit edildi. Bu Aβ1-42 benzer kuluçka Aβ36fibriller şeklinde üretilen bildirilmiştir. Bu toplanan Aβ1-42 ile tedavi son.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada açıklanan protokol aksonal büyüme koniler erken olayları gözlem Aβ1-42 tedaviden sonra etkin. Aβ1-42 endositoz aksonal büyüme koni içinde 20 dk içinde indüklenen ve büyüme koni Daralt tedavinin içinde 1 h gözlendi. Bu endositoz muhtemelen clathrin tarafından aracılık. Bu iletişim kuralını kullanarak, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1 42 bağlı büyüme koni çöküşü ve kültürlü nöronlar27aksonal dejenerasyon önlemek için doğrulandı. Ayrıca, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu A.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Teşekkürler
Bu eser kısmen JSP'ler gelen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir (KAKENHI 18K 07389), Japonya, Takeda Bilim Vakfı, Japonya ve Kobayashi ilaç Co., Ltd., Japonya.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ddY fareler | SLC | ||
| Sekiz kuyulu kültür slaydı | Falcon | 354108 | |
| poli D lizin | Wako | 168-19041 | |
| Kültür ortamı, Nörobazal ortam | Gibco | 21103-049 | |
| ev serumu | Gibco | 26050-088 | |
| glikoz | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamin | Wako | 074-00522 | |
| %0.05 tripsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soya fasulyesi tripsin inhibitörü | Gibco | 17075-029 | |
| 70 & mikro filtreli; m ağ boyutu, hücre süzgeci | Falcon | 352350 | |
| B-27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| CO2< / sub> inkübatör | Astec | SCA-165DS | |
| Amiloid ve beta; 1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehit | Wako | 162-16065 | |
| sükroz | Wako | 196-00015 | |
| Sulu montaj ortamı, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Ters mikroskop A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | AxioCam MRm, Isıtma Ünitesi XL S, CO2 Modülü S1 ve TempModule S1 ile bağlantılı |
| Objektif Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objektif Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objektif, CFI Planı Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG Abcam | ab32454 | ||
| anti-tau-1 IgG Chemicon | MAB3420 | ||
| anti-amiloid ve beta; antikor | IBL | 10379 | klonu 11A1 |
| normal keçi serumu | Wako | 143-06561 | |
| sığır serum albümini | Wako | 010-25783 | |
| t-oktilfenoksipolietoksietanol | Wako | 169-21105 | |
| AlexaFluor 594 ile konjuge keçi anti-fare IgG AlexaFluor 488 ile | konjuge Invitrogen | A11032 | |
| keçi anti-tavşan IgG | Invitrogen | A11029 | |
| sıcak plaka | NISSIN | NHP-M30N | |
| kapak camı | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm çanak | IWAKI | 1000-035 | |
| Silikon RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| el zımbası | Roper Whitney | No. | |
| Floresan membran probu, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- ve Mg2+ içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi | Gibco | 14175-095 | |
| Transfeksiyon çözeltisi, Nükleofektör çözeltisi | Lonza | VPG-1001 | |
| Elektroporatör, Nükleofektör I | Amaxa | ||
| Ters mikroskop B | Keyence | BZ-X710 | |
| Görüntü yazılımı, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Kaynaklar
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
