Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

6.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58244

⸱

13 Eylül 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Bu makalede

Özet

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Özet

RNA müdahale - ve genom düzenleme-tabanlı platformlar tarama virüs çoğaltma kısıtlamak konak hücre faktörleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bu ekranlar genellikle viral patojen altında eğitim için doğal olarak keyfi olan hücreler yapılmaktadır. Bu nedenle, virüs denetimi koşullarında güçlü çoğaltma bu ekranlar dinamik aralığını sınırlayabilir. Ayrıca, bu ekranlar virüs çoğaltma virüs iyi adapte ana bilgisayara ve antiviral savunma mücadele yeteneğine ise sınırlandıran hücresel savunma yolları kolayca belirleyemiyor olabilir. Bu makalede, biz arboviruses gibi vesicular Stomatit virüs (VSV) tarafından üzerinde doğal olarak başarısız enfeksiyonlar virüs-ana etkileşimler merkezi ekranlar aracılığıyla keşfetmek için yeni bir paradigma tanımlamak. Çeşitli dipteran böcek ve memeli ev sahibi çoğaltmak yeteneği VSV rağmen VSV Lepidoptera böcekler, gypsy moth (Lymantria dispar) gibi türetilmiş hücre hatları çeşitli sonrası giriş, başarısız bir enfeksiyon uğrar. "Ne zaman konak hücre antiviral Savunma virüs olduğundan Ancak, bunlar abes VSV hastalık kurtarıldı". Biz nasıl VSV kodlama uygun reporter genler ve kısıtlayıcı L. dispar suşları tarif hücre hatları ana faktörler Abdovirüs sınırlama içinde katılan tanımlamak için kurulum ekranları için eşleştirilmiş. Ayrıca, biz de bu tarama araçları yarar VSV çoğaltma veya ektopik ifade memeli virüsler tarafından kodlanmış dahil olmak üzere, coinfection sırasında kurtarma virally kodlanmış faktörler tanımlaması gösterir. L. dispar hücrelerdeki VSV çoğaltma doğal sınırlamasının VSV kurtarma, böylece izlemek için basit ışıma ve floresan tabanlı deneyleri kullanımını teşvik koşulları için eleme yüksek sinyal gürültü oranı sağlar VSV çoğaltma değişiklikleri. Bu metodolojileri ana bilgisayar antiviral yanıt ve viral bağışıklık kaçırma faktörler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir.

Giriş

Bir virüs verimli belirli bir ana çoğaltmak yeteneği kısmen destek viral giriş ve çoğaltma1konak hücre faktörler kullanılabilirlik tarafından yönetilmektedir. Aksi takdirde viral çoğaltma2,3engel olur sayaç hücresel antiviral savunma için bir virüs kapasitesi tarafından virüs ana bilgisayar aralığı da dikte. Sonuçta bir virüs yaşam döngüsünün belirli bir ana içinde tamamlamak mümkün olacak olup olmadığını karar bu karmaşık virüs-ana etkileşimler sonucu olur. Eğer viral çoğaltma ensues ana bilgisayara ilişkin potansiyel patojenik sonuçları göz önüne alındığında, bu abes ve üretken arasındaki dengeyi ipucu anahtar virüs-ana etkileşimler anlayışımız daha fazla için deneysel stratejiler geliştirmek için önemlidir enfeksiyonlar. Virüs ana bilgisayar etkileşimi moleküler özelliklerinin elucidating yeni ve alternatif antiviral tedavi stratejilerinin geliştirilmesi vesile olacaktır.

RNA müdahale (RNAi)4,ve advent ile5 ve genom düzenleme araçları (Örn., CRISPR-Cas9, çinko parmak nükleaz, TALENs)6,7, değiştirmek için deneysel olarak mümkün olmuştur hücresel genom çapında faktörlere ifade ölçekler ve virüs çoğaltma hakkında bu değişiklikleri etkisini keşfedin. Gerçekten de, çok sayıda RNAi ve ekranlar genom-düzenleme-tabanlı virüs-ana etkileşimler8,9,10, yeni esaslarını açıkladı omurgasız ve omurgalı konak hücre tiplerinde yapılmıştır 11 , 12. bu ekranlar genellikle gazetecilere, ateş böceği luciferase (LUC) veya floresan proteinler gibi kodlama virüs istihdam (Örn., GFP, DsRed), bir okuma olarak viral gen ekspresyonu kantitatif değerlendirilmesi uygun aracı sağlayan viral çoğaltma9,12. Bu strateji araştırmacılar ya teşvik veya viral çoğaltma tarafından artar ya da azalır, sırasıyla kanıtlandığı düşman,9,12viral muhabiri sinyalleri ana faktörleri belirlemek için sağlar. Ancak, büyük çoğu durumda, bu ekranlar hangi onlar incelendiği ana hücre tipi iyi adapte virüs kullanılarak yapılmıştır. Bu strateji viral patojenler ve onların doğal ana bilgisayarlar arasında coevolutionary ilişkiler anlamak için önemli olabilir de, açığa çıkarmak ana bilgisayar antiviral faktörleri onların kullanımı ile ilgili temel sorunları teşkil etmez. Bu gibi durumlarda, bir donanım virüs muhabir olarak sinyal RNAi nakavt için baktı ediliyor veya viral çoğaltma normalde engellemektedir hücresel bir faktör inactivation. İlk olarak, bir virüs zaten sağlam kontrol koşullar altında incelenmektedir ana bilgisayar hücredeki çoğaltmak mümkün ise (Örneğin, arka plan ve gelişmiş viral muhabir sinyalleri arasında ayrım yapmak yeteneği) ekranın dinamik alan sınırlı olabilir. İkinci olarak, bu sorun daha fazla virüs iyi adapte konak hücre ve içinde belgili tanımlık perde hedef alınmaktadır konak savunma yolları ortaya koydu, etkili olduğu durumlar tarafından bileşik olduğunu.

Eleme yöntemleri geleneksel virüs-ana bilgisayar etkileşimi ile ilgili yukarıdaki kaygıları nedeniyle doğal olarak başarısız Abdovirüs enfeksiyonlar Lepidoptera böcek hücrelerinde yararlanmak virüs-ana etkileşimler çalışmak için yeni bir paradigma geliştirdik. Bu strateji iyi okudu insan Abdovirüs, VSV, gypsy moth (L. dispar)13türetilmiş hücrelerdeki abes bir enfeksiyon uğrar bir gözlem türetilmiştir. VSV doğal memeli ana dipteran böcekler (yani, kum sinekleri) tarafından iletilir ve deneysel olarak geniş bir omurgasız bulaştırmak için gösterilmiştir ve omurgalı konaklarda her iki14kültür ve in vivohücre. 11-kb olumsuz anlamda tek iplikçikli RNA genomu VSV her saran virion kadar yapmak proteinler çevriliyor beş subgenomic mRNA'ların kodlar. Ancak, VSV ters genetik sistemler çoğaltma yetkili suşları LUC veya floresan proteinler, ek olarak beş doğal VSV gen ürünleri15,16,17kodlama yaratılması için izin. Bu muhabir proteinler VSV virion dahil değil çünkü onlar sonrası giriş oluşur VSV gen ekspresyonu için uygun bir okuma sağlar. VSV suşları GFP veya LUC kodlama kullanarak, biz daha önce VSV gen ekspresyonu ciddi LD652 hücreleri girişte sınırlıdır ve VSV titreleri 72 saat sonrası enfeksiyon (HPI) artırmayın göstermiştir. Buna ek olarak, LD652 hücreleri VSV ve memeli poxvirus, vaksinia virüs (VACV), coinfection VSV gen ekspresyonu ve titreleri Logaritmik artar bu zaman noktası tarafından yol açar. VACV erken gen ekspresyonu, DNA ikileşmesi ve geç gen ekspresyonu LD652 hücre enfeksiyonlar geçer ama VACV çoğaltma döngüsü nedeniyle eksik virion morfogenetik18sonuçta başarısız. Büyük ~ 192 kb DNA genom VACV, bunların çoğu viral çoğaltma ana bilgisayar bağışıklık yanıtı19bastırılması yoluyla teşvik immunomodulatory özelliklerini görüntülemek > 200 protein kodlayan. Bu nedenle, biz bu VACV coinfection tarafından LD652 hücrelerdeki VSV çoğaltma "kurtarma" büyük olasılıkla L. dispar yanıt normalde VSV çoğaltma sınırlama inhibe VACV immunomodulators tarafından aracılı olan. Bu destek, ana bilgisayar RNA polimeraz II inhibitörü actinomycin D LD652 hücrelerle tedavi de LD652 hücrelerde transkripsiyon-bağımlı ana bilgisayar yanıt VSV çoğaltma sonrası giriş13blok gösteren VSV çoğaltma kurtarır.

Yukarıdaki gözlemleri VSV enfeksiyona LD652 hücrelerin doğal olarak kısıtlayıcı doğa nispeten düşük bir arka plan ne zaman muhabir VSV kodlu sinyalleri (yani, bu ana bilgisayar inhibe geliştirmek koşulları için eleme sağlayabilir öneririm Antiviral savunma). Burada, floresan veya LUC tabanlı deneyleri ekrana VSV kısıtlama Lepidoptera hücrelerdeki rahatlatmak koşulları için kullanma yöntemleri sağlamak. İlk olarak, bu deneyleri VSV kısıtlama aday viral etkenler ektopik ifade veya her iki coinfection deneyler sırasında break virally kodlanmış immunomodulatory faktörleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Örnek olarak, biz nasıl biz bu tarama teknikleri poxvirus kodlanmış A51R protein diğer poxvirus faktörler13yokluğunda VSV çoğaltma kurtarmak immunomodulatory faktörler yeni bir aile tanımlamak için kullanılan göstermektedir. İkinci olarak, RNAi kısıtlayıcı VSV-LD652 hücre enfeksiyonları eleme doğrudan ökaryotik ana faktörler Abdovirüs kısıtlama13' te katılan tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. genel Lymantria dispar (LD652) hücre ile virüs kültür

  1. LD652 hücre kültürü çalışmalarının ve kaplama
    1. Kültürüne L. dispar-türetilmiş LD652 hücreleri, normal atmosfer altında 27 ° C'de inkübe bir büyüme orta (Tablo reçetesi) hücrelerinin monolayer korumak. 10 cm doku kültürü tedavi edilen yemekleri hücreleri korumak ve % 80 confluency ulaşan üzerine hücreleri geçiş.
    2. Plaka, plaka yapisan LD652 hücrelerden art arda (Bu hücreler trypsinization çıkarmak için gerekmez) monolayer üzerine medya pipetting tarafından çıkarmak ve örnek 1 x 105 hücre/mL yaklaşık bir yoğunluğunun büyüme medyada sulandırmak için. 1 mL sulandırılmış kültür/iyi bir 24-şey plaka pipet. En az üç Çoğalt kuyu/tedavi türü her zaman noktası (en fazla sekiz tedaviler/plaka) için tohum.
    3. Hücreleri en az 1 h için yerleşmek için izin verir.
  2. Vaksinia virüs hazırlık
    1. VACV hisse senetleri hazırlamak mı, virüs HeLa içinde yükseltmek için20 hücreleri veya Afrika yeşil maymun böbrek hücreleri (lisans-1 veya BSC-40 hücreleri)20,21,22.
      Not: Burada açıklanan deneyleri içinde de VACV zorlanma Western Reserve (VACV-WR) çalışır.
    2. VACV zorlanma ile plak tahlil BSC-1 veya BSC-40 hücreleri20,22titre.
      Not: Tüm VACV çokluğu enfeksiyon (MOI) hücre enfeksiyonlar titreleri BSC-40 plak deneyleri elde edilen temel alan LD652 için burada açıklanan belirtti.
  3. Vesicular Stomatit virüs hazırlık
    1. VSV stokları hazırlamak için virüs BHK hücreleri23yılında yükseltmek.
    2. Plak tahlil BSC-40 veya BHK hücre monolayers13,23tarafından VSV titre.
      Not: Tüm VSV MOIs hücre enfeksiyonlar titreleri BSC-40 plak deneyleri elde edilen temel alan LD652 için burada açıklanan.

2. floresans tabanlı VSV kurtarma tahlil Co enfeksiyon ve canlı hücre düşsel kullanma

  1. Tohum ve enfeksiyon LD652 hücre
    1. 40.000 LD652 hücreler/iyi bir 8-şey odasının plaka.
    2. Floresans tabanlı canlı hücre görüntüsü için VSV suşları floresan protein kodlama kullanmak. Burada sunulan deneyler VSV-DsRed17, diğer VSV protein için erimiş değil ücretsiz DsRed protein ifade eder bir rekombinant VSV yük kullanın.
      Not: VSV enfeksiyon LD652 hücre tarafından 96 HPI cytopathic değildir ve böylece, hücre ölümü bir karıştırıcı faktör bu zaman dilimi içinde VSV çoğaltma değerlendirirken değil.
    3. Serum ücretsiz bir medya (SFM; VSV-DsRed ve VACV-FL-GFP hazırlık Tablo malzeme) 1 ve 25, bir MOI, anılan sıraya göre.
      Not: VACV-FL-GFP LUC ve GFP24arasında bir füzyon ifade eder bir rekombinant VACV yük olduğunu. 25 veya daha büyük bir MOI VACV suşları için kullanarak tüm LD652 hücreleri enfekte13olmasını sağlar. Eğer farklı bir coinfecting virüs istimal, MOI ampirik olarak Kullanıcı tarafından belirlenecektir gerekir. Her enfeksiyon tedavi yinelenen wells ayarlanmalıdır ve sahte enfekte tedavi sadece SFM hücrelere eklenir içerir.
    4. İnoculum 27 ° C'de 2 h için 0.2 mL hücrelerde kuluçkaya
    5. Hücreleri 0.5 mL/büyüme ortamının iyi yıkayın.
    6. Hücre canlılığı boya (Tablo reçetesi) 25 mikron hücrelerde büyüme medya 27 ° C'de 45 dk için kuluçkaya
    7. Medya Aspire edin ve kuyu 1 yıkama x 0.5 mL/de fazla boya kaldırmak için.
    8. 0.3 mL/de büyüme ortamının hücreleri korumak.
  2. Canlı hücre görüntü yakalama
    1. Bir confocal mikroskop 30 dk önceden açmak ve bir 8-şey odası yemek yükleyin.
      Not: Oda sıcaklığında 20-25 ° C arasında değişen LD652 hücreleri görüntüsü, ama optimal koşullar için oda sıcaklığını 27 ° C'ye ayarlanması gerektiğini
    2. Yansıması için uygun uyarma/emisyon ayarları her floresan marker protein için hem de faz kontrast görüntü ayarlarını ayarlayın.
    3. Her kanal için lazer yoğunluğunu ayarlayın.
      Not: Bu son deneyde kullanılacak saat ders boyunca gözlenen floresan sinyal yoğunluklarda aralığını belirlemek için bir pilot deneme gerçekleştirme gerektirebilir.
    4. 10 X objektif kullanarak istediğiniz zaman noktaya kadar enfeksiyon süresince her şey her 1 – 5 h faz kontrast ve floresan görüntülerini yakalamak (Örn., 48-72 HPI).
      Not: Enfeksiyon oranları kültür boyunca doğru bir şekilde tahmin etmek için her iyi görünümünde birden çok alan yakalamak önemlidir.
  3. Görüntü Analizi
    1. Görüntü analiz yazılımı uygun floresan kanalları otomatik görüntü analizi için kullanın (Örn., 405 nm, 488 nm, 568 nm).
    2. Enfekte hücreleri yüzdesini hesaplamak için floresan hücreleri VSV enfeksiyon gösteren toplam sayısına bölün (e.g., DsRed-pozitif hücreler VSV-DsRed enfeksiyonlar için) tarafından hücre canlılığı boya için etiketli hücrelerin toplam sayısına göre tüm tedaviler arasında her alanı elde edersiniz.

3. genel Viral enfeksiyon Protokolü VSV ışıldama tabanlı kurtarma deneyleri LD652 hücrelerdeki için

  1. İnoculum hazırlanması
    1. 30 enfeksiyon önce tezcan stokları VSV-LUC16 (bir rekombinant VSV zorlanma ücretsiz ateş böceği luciferase protein diğer VSV protein için erimiş değil o ifade eder). VSV-LUC kurtarmak için VACV coinfection sırasında raporlaması, ayrıca VACV-WR virüs buz çözme.
      Not: Diğer virüsler (yanında VACV-WR) VSV-LUC coinfection sırasında kurtarmak, ancak bu ampirik olarak her kullanıcı tarafından belirlenecektir gerekir.
    2. Öyle ki bir MOI 10 ve 25, sırasıyla, 0.2 mL toplam inoculum hacmi ekleyerek elde edilir varlığı veya yokluğu VACV-WR SFM içine VSV-LUC sulandrarak inoculum hazırlamak/iyi.
  2. Enfeksiyon hücreleri
    1. Dikkatle monolayer rahatsız edici önlemek için olgun LD652 medya Aspire edin ve virüs/iyi 0.2 mL ile aşılamak. Bu sefer 0 HPI tanımlanır. Steril SFM "sahte-enfekte" negatif kontrol tedaviler hizmet etmek için ek wells ekleyin.
    2. İnoculum 27 ° C'de 2 h için hücrelerde kuluçkaya
    3. 2 HPI, at inoculum aspirasyon tarafından kaldırmak ve 1 mL ile değiştirmek/LD652 büyüme medya iyi.
    4. Enfeksiyon 24-72 HPI devam etmek izin verir.

4. luciferase tahlil

  1. Hücre lysates hazırlanması
    1. Dikkatle süpernatant Aspire edin ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) 1 mL ekleyin / iyi.
    2. 1 mL şırınga pistonu kullanarak, hücreleri DPBS kazı.
    3. Microcentrifuge tüp ve 4 ° C'de 20 dk 400 x g , santrifüj hücreleri transfer
    4. Bu arada, 5 gazeteci lizis arabellek (RLB) steril H2o x 1 x seyreltme hazırlamak
    5. Santrifüjü hücre Pelet bozmadan DPBS Aspire edin.
    6. Her pelet 1 150 µL içinde resuspend x RLB.
    7. Donma-çözülme oda sıcaklığında su banyosu içinde hızlı bir çözülme ardından bir-80 ° C dondurucu bir dakika 5 kuluçka kullanarak x örnekleri 1. -80 ° C'de lysates analiz etmek için hazır kadar saklayın.
  2. Luciferase tahlil
    1. Lysates buz çözme.
    2. Bir katı siyah ya da beyaz 96-şey Mikroplaka bir kuyuya lysate, 20 μL pipet.
    3. Luciferase tahlil reaktif 100 μL her şey için ekleyin.
    4. Hemen bir luminometer kullanarak ışık yoğunluğunu ölçmek (belirli Luminometreler için uygun ayarları Kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenecek olacak).
  3. Luciferase tahlil analiz
    1. LU sinyalleri kontrol tedavisi (Temsilcisi sonuçları) elde edilen LU okumalar her tedavi için normalleştirmek. En az üç bağımsız deneyler gerçekleştirdikten sonra LU her tedavi/kontrol grubundan elde edilen ortalama uygun istatistiksel testler tarafından çözümlenebilir.

5. Immunoblot

  1. SDS-sayfa ve uygun reaktifler ve Araçları'nı kullanarak sonraki immunoblotting için LUC deneyleri için çıkarılan lysates kullanın.

6. LD652 hücre kültürlerden VSV titresi

  1. LD652 hücreleri adım 1.1 göre plaka.
  2. Viral enfekte hücreleri göre adım 3.
  3. İstenen saat noktalarda supernatants steril microcentrifuge tüpler içine toplamak.
  4. 4 ° C'de 10 dakika 1000 x g kullanarak hücreleri cips ve supernatants yeni tüpler için transfer.
  5. Supernatants-80 ° C'de depolayın veya plak tahlil BSC-40 hücreleri tarafından titrasyon ile devam edin.
    Not: VACV bulunan LD652 hücre kültürleri VSV titrating Eğer 2 HPI BSC-40 monolayers13tarihinde plaklar artık VACV parçacıklar önleyebilirsiniz, BSC-40 kültür ortamlara 100 μg/mL sitozin arabinoside (araç) eklemek için tavsiye edilir. Araç VACV DNA çoğaltma25 engeller, ancak VSV çoğaltmayı etkilemez bir viral DNA polimeraz engelleyici olduğunu.

7. ışıldama tabanlı VSV varyasyonları kurtarmak LD652 hücrelerdeki deneyleri: RNAi ve plazmid Transfection deneyleri

  1. RNAi aracılı nakavt, viral dsRNA hazırlanması veya ana transkript
    1. Tasarım gene özgü astar kuyruklu T7 organizatörü sıra (TAATACGACTCACTATAGGG) ya da hedef ile 5' sonunda coinfecting virüs (Örneğin, VACV) veya L. dispar mRNA transkript ilgi. Bu astar 400-600 bp etkili RNAi aracılı nakavt için PCR ürünü üretmek gerekir. Tavla ve ark. görmek 13 astar serileri için aşağıda devirme VACV veya L. dispar için transkript dsRNA-aracılı RNAi LD652 hücrelerdeki tarafından kullanılır.
      Not: L. dispar mRNA transkript üzerinden tanımlanabilir L. dispar transcriptome veritabanları26,27,28yayınlandı.
    2. Bir DNA şablon üzerinden RT-PCR oluşturmak (cDNA sentezi: 1 50 ° C çevriminde 30 dk; PCR: 94 ° c 40 devredir 15 s, 30 50 ° C s ve 68 ° C 45 için s her).
    3. PCR arıtma seti kullanarak PCR ürünü arındırmak.
    4. Arıtılmış PCR ürünü bir şablon olarak kullanıp, içinde vitro uyarlamak ve vitro transkripsiyon ve arıtma seti kullanarak dsRNA arındırmak.
  2. Transfection dsRNA veya plazmid DNA LD652 hücre içine
    1. Tohum 1 x 105 hücreleri/bir 24-şey tabak iyi ve en az 1 h için yerleşmek hücreleri izin.
    2. Her şey transfected için transfection reaktif 4 μL SFM 100 μL oranında seyreltin. En fazla 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Bunun yapılması tüm transfections için ana bir karışımını yapmak için ölçeklenebilir.
    3. Transfected için SFM her şey için 100 μL ile dsRNA veya toplam plazmid DNA 1 μg kadar sulandırmak. En fazla 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Biz daha önce 1 μg dsRNA/105 LD652 hücre transfection için yeterli olduğunu bulduk > % 80'i devirme ya da viral veya ev sahipliği transkript13, dsRNA doz ama deneysel değişiklik için set ups/koşullar zorunda kalacak ampirik olarak kararlı olmak.
    4. Transfection reaktif ve dsRNA/plazmid DNA dilutions 1:1 oran ile birleştirmek (Örneğin, seyreltilmiş dsRNA 100 μL karıştırılır ile seyreltilmiş transfection reaktif 100 μL) ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
    5. Bu arada, kuyu 1 mL/SFM, iyi yıkama ve her şey için SFM 500 μL ekleyin.
    6. Yavaş yavaş transfection reaktif dsRNA (veya plazmid DNA) eklemek karışımı her kuyuya dropwise.
    7. 5 h için hücreler transfection reaktif kuluçkaya.
      1. RNAi için (Örneğin, VACV), coinfecting bir virüs tarafından kodlanmış transkript nakavt içeren deneyler yerine transfection reaktif 5-h transfection kuluçka süresinden sonra virüs inoculum VSV-LUC içeren (veya VACV olmadan veya başka bir coinfecting virüs) (adım 3). Daha sonra VSV-LUC tam büyüme medya 2 HPI ile içeren virüs inoculum değiştirin. LUC deneyleri (adım 4) o zaman hulâsa lysates virüs transkript coinfecting nakavt VSV-LUC kurtarma bir kaybına neden Eğer belirlemek için çeşitli zaman noktalarda gerçekleştirilebilir.
      2. RNAi deneyler, RNAi L. dispar transkript içeren için tam büyüme ortamı ile transfection mix değiştirin ve nakavt VSV-LUC (adım 4) ile enfeksiyon önce 24 h için doğmak izin verir. LUC deneyleri (adım 4) o zaman hulâsa lysates L. dispar transkript nakavt VSV-LUC kurtarma teşvik Eğer belirlemek için çeşitli zaman noktalarda gerçekleştirilebilir.
      3. Plazmid ifade vektörlerin aday immunomodulators ifade transfections içeren deneyler için transfection reaktif değiştirin ve protein ifade VSV-LUC (adım 4) ile enfeksiyon önce 24 h için izin vermek. LUC deneyleri (adım 4) o zaman hulâsa lysates Ifade aday immunomodulatory proteinlerin VSV-LUC kurtarma teşvik olup olmadığını belirlemek için çeşitli zaman noktalarda gerçekleştirilebilir.
        Not: burada 1 μg/iyi plazmid DNA sonucu 40-%6013transfection verimliliği kullanılarak açıklanmıştır transfection koşulları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Canlı hücre görüntüleme uygulamaları VSV kurtarma VACV coinfection üzerine izlemek için bir örnek olarak, LD652 hücreleri bir 8-şey odacıklı tabak içinde kaplama ve sahte enfekte veya VSV-DsRed ile enfekte (MOI = 1) varlığı veya yokluğu VACV-FL-GFP (MOI = 25). VSV-DsRed DsRed ücretsiz bir protein olarak ifade eder ve yapısal VSV proteinler (Şekil 1A) erimiş değil çünkü, VSV giriş ve gen ifade başlattıktan sonra sadece algılanır. Tüm hücreleri sonra serbestçe ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada basit floresan ışıma-temelli ve deneyleri VSV çoğaltma kısıtlayıcı Lepidoptera hücre kültürlerinde kurtarmak koşulları için ekran anlatmıştık. Mükemmel bir sinyal-gürültü oranı VSV gen ekspresyonu için raporlaması VSV Lepidoptera hücrelerdeki abes enfeksiyon oluşturur. Örneğin, lysates--dan tek VSV-LUC hastalık tespit LU sinyalleri edildi ~ 1000 kat daha fazla daha yüksek lysates, sahte enfekte içinde bu sinyalleri sadece yaklaşık iki kat 72-h saat boyunca değişti. henüz. Buna ek olarak, gelişmiş VSV-LUC VACV ile ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

D.G. University of Texas Southwestern Tıp Merkezi donatılmış akademisyenler programdan fon tarafından desteklenmiştir. Yazar Michael Whitt (Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi) ve Sean Whelan (Harvard Medical School) VSV-DsRed ve VSV-LUC sağlanması için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Gary Luker (Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi) VACV-FL-GFP zorlanma tür hediye için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 oyuklu doku kültürü plakalarıCELLTREAT229106
24 oyuklu doku kültürü plakalarıCELLTREAT229124
10 cm doku kültürü kaplarıCorningC430167
Grace' s Böcek OrtamıSigmaG8142
EX-CELL 420Sigma14420C
Fetal Sığır Serumu - OptimaAtlanta BiologicalsS12450
Büyüme ortamı1:1 Grace's Insect Medium ve EX-Cell 420 Serum-Free Medium karışımı ayrıca %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon ve %10 Fetal sığır serumu
Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon (100&zaman;)SigmaA5955
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)SigmaD8662
Serum Ücretsiz Ortam (SFM)Thermo Fisher10902096
Sitozin arabinositSigmaC1768
Transfeksiyon reaktifiThermo Fisher10362100
Corning cellgro DMSO (Dimetil Sülfoksit)Corning25950CQC
Raportör lizis tamponu 5xPromegaE3971
Lusiferaz Test ReaktifiPromegaE1483
96 Kuyucuklu MikroplakalarCorning3915
Fare anti-FLAG antikoruWako014-22383
Tavşan anti-ateşböceği lusiferaz antikoruAbcamab21176
Fare anti-aktin antikoruSigmaA2066
Fare anti-VSV MN/AN/A Dr. John Connor (Boston Üniversitesi)
Fare anti-VACV I3LN/A N/ADr. David Evans (Alberta Üniversitesi)
8 kuyulu Odacıklı çanakLab-Tek II155409
Hücre canlılığı boyasıThermo FisherC12881
FLUOstar mikroplaka okuyucuBMG LabtechFLUOstar
Konfokal mikroskopOlympusFV10i-LIV
Görüntü analiz yazılımıOlympusv1.18cellSens yazılımı
Eppendorf 5702 ventilasyonlu santrifüjEppendorf22628102
Odyssey Fc Kızılötesi Görüntüleme SistemiLi-COR BiosciencesOdyssey Fc
LD652 hücreleriN/AN/ADr. Basil Arif (Doğal Kaynaklar Kanada)
BSC-40 hücreleriATCCCRL-2761
BHK hücreleriATCCCCL-10
HeLa hücreleriATCCCCL-2
BSC-1 hücreleriATCCCCL-26
in vitro< / em> transkripsiyon ve saflaştırma kitiThermo FisherAM1626
PCR saflaştırma kitiQiagen28104

Kaynaklar

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), Maywood, NJ. 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera,, J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394(2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522(2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190(2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vezik ler Stomatit Vir sLepidoptera B cek H creleriL minesans AnalizleriFloresan AnalizleriRNA nterferans TaramasGenom D zenleme TaramasVir s Konak Etkile imleri
Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.