Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar
Bu makalede
Özet
Özet
RNA müdahale - ve genom düzenleme-tabanlı platformlar tarama virüs çoğaltma kısıtlamak konak hücre faktörleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bu ekranlar genellikle viral patojen altında eğitim için doğal olarak keyfi olan hücreler yapılmaktadır. Bu nedenle, virüs denetimi koşullarında güçlü çoğaltma bu ekranlar dinamik aralığını sınırlayabilir. Ayrıca, bu ekranlar virüs çoğaltma virüs iyi adapte ana bilgisayara ve antiviral savunma mücadele yeteneğine ise sınırlandıran hücresel savunma yolları kolayca belirleyemiyor olabilir. Bu makalede, biz arboviruses gibi vesicular Stomatit virüs (VSV) tarafından üzerinde doğal olarak başarısız enfeksiyonlar virüs-ana etkileşimler merkezi ekranlar aracılığıyla keşfetmek için yeni bir paradigma tanımlamak. Çeşitli dipteran böcek ve memeli ev sahibi çoğaltmak yeteneği VSV rağmen VSV Lepidoptera böcekler, gypsy moth (Lymantria dispar) gibi türetilmiş hücre hatları çeşitli sonrası giriş, başarısız bir enfeksiyon uğrar. "Ne zaman konak hücre antiviral Savunma virüs olduğundan Ancak, bunlar abes VSV hastalık kurtarıldı". Biz nasıl VSV kodlama uygun reporter genler ve kısıtlayıcı L. dispar suşları tarif hücre hatları ana faktörler Abdovirüs sınırlama içinde katılan tanımlamak için kurulum ekranları için eşleştirilmiş. Ayrıca, biz de bu tarama araçları yarar VSV çoğaltma veya ektopik ifade memeli virüsler tarafından kodlanmış dahil olmak üzere, coinfection sırasında kurtarma virally kodlanmış faktörler tanımlaması gösterir. L. dispar hücrelerdeki VSV çoğaltma doğal sınırlamasının VSV kurtarma, böylece izlemek için basit ışıma ve floresan tabanlı deneyleri kullanımını teşvik koşulları için eleme yüksek sinyal gürültü oranı sağlar VSV çoğaltma değişiklikleri. Bu metodolojileri ana bilgisayar antiviral yanıt ve viral bağışıklık kaçırma faktörler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir.
Giriş
Bir virüs verimli belirli bir ana çoğaltmak yeteneği kısmen destek viral giriş ve çoğaltma1konak hücre faktörler kullanılabilirlik tarafından yönetilmektedir. Aksi takdirde viral çoğaltma2,3engel olur sayaç hücresel antiviral savunma için bir virüs kapasitesi tarafından virüs ana bilgisayar aralığı da dikte. Sonuçta bir virüs yaşam döngüsünün belirli bir ana içinde tamamlamak mümkün olacak olup olmadığını karar bu karmaşık virüs-ana etkileşimler sonucu olur. Eğer viral çoğaltma ensues ana bilgisayara ilişkin potansiyel patojenik sonuçları göz önüne alındığında, bu abes ve üretken arasın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. genel Lymantria dispar (LD652) hücre ile virüs kültür
-
LD652 hücre kültürü çalışmalarının ve kaplama
- Kültürüne L. dispar-türetilmiş LD652 hücreleri, normal atmosfer altında 27 ° C'de inkübe bir büyüme orta (Tablo reçetesi) hücrelerinin monolayer korumak. 10 cm doku kültürü tedavi edilen yemekleri hücreleri korumak ve % 80 confluency ulaşan üzerine hücreleri geçiş.
- Plaka, plaka yapisan LD652 hücrelerden art arda (Bu hücreler trypsinization çıkarmak için gerekmez) monolayer üzerine medya pipetting tarafından çıkarmak ve örnek 1 x 105 hücre/mL yaklaşık bir yoğunluğun....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Canlı hücre görüntüleme uygulamaları VSV kurtarma VACV coinfection üzerine izlemek için bir örnek olarak, LD652 hücreleri bir 8-şey odacıklı tabak içinde kaplama ve sahte enfekte veya VSV-DsRed ile enfekte (MOI = 1) varlığı veya yokluğu VACV-FL-GFP (MOI = 25). VSV-DsRed DsRed ücretsiz bir protein olarak ifade eder ve yapısal VSV proteinler (Şekil 1A) erimiş değil çünkü, VSV giriş ve gen ifade başlattıktan sonra sadece algılanır. Tüm hücreleri sonra serbestçe .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada basit floresan ışıma-temelli ve deneyleri VSV çoğaltma kısıtlayıcı Lepidoptera hücre kültürlerinde kurtarmak koşulları için ekran anlatmıştık. Mükemmel bir sinyal-gürültü oranı VSV gen ekspresyonu için raporlaması VSV Lepidoptera hücrelerdeki abes enfeksiyon oluşturur. Örneğin, lysates--dan tek VSV-LUC hastalık tespit LU sinyalleri edildi ~ 1000 kat daha fazla daha yüksek lysates, sahte enfekte içinde bu sinyalleri sadece yaklaşık iki kat 72-h saat boyunca değişti. henüz. Buna ek olarak, gelişmiş VSV-LUC VACV ile .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
D.G. University of Texas Southwestern Tıp Merkezi donatılmış akademisyenler programdan fon tarafından desteklenmiştir. Yazar Michael Whitt (Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi) ve Sean Whelan (Harvard Medical School) VSV-DsRed ve VSV-LUC sağlanması için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Gary Luker (Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi) VACV-FL-GFP zorlanma tür hediye için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6 oyuklu doku kültürü plakaları | CELLTREAT | 229106 | |
| 24 oyuklu doku kültürü plakaları | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm doku kültürü kapları | Corning | C430167 | |
| Grace' s Böcek Ortamı | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Sığır Serumu - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Büyüme ortamı | 1:1 Grace's Insect Medium ve EX-Cell 420 Serum-Free Medium karışımı ayrıca %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon ve %10 Fetal sığır serumu | ||
| Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon (100&zaman;) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Ücretsiz Ortam (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Sitozin arabinosit | Sigma | C1768 | |
| Transfeksiyon reaktifi | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimetil Sülfoksit) | Corning | 25950CQC | |
| Raportör lizis tamponu 5x | Promega | E3971 | |
| Lusiferaz Test Reaktifi | Promega | E1483 | |
| 96 Kuyucuklu Mikroplakalar | Corning | 3915 | |
| Fare anti-FLAG antikoru | Wako | 014-22383 | |
| Tavşan anti-ateşböceği lusiferaz antikoru | Abcam | ab21176 | |
| Fare anti-aktin antikoru | Sigma | A2066 | |
| Fare anti-VSV M | N/A | N/A Dr | . John Connor (Boston Üniversitesi) |
| Fare anti-VACV I3L | N/A N | /A | Dr. David Evans (Alberta Üniversitesi) |
| 8 kuyulu Odacıklı çanak | Lab-Tek II | 155409 | |
| Hücre canlılığı boyası | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar mikroplaka okuyucu | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Konfokal mikroskop | Olympus | FV10i-LIV | |
| Görüntü analiz yazılımı | Olympus | v1.18 | cellSens yazılımı |
| Eppendorf 5702 ventilasyonlu santrifüj | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Kızılötesi Görüntüleme Sistemi | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 hücreleri | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Doğal Kaynaklar Kanada) |
| BSC-40 hücreleri | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK hücreleri | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa hücreleri | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 hücreleri | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro< / em> transkripsiyon ve saflaştırma kiti | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR saflaştırma kiti | Qiagen | 28104 |
Kaynaklar
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
