Yöntem makalesi

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

7.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58265

⸱

28 Ağustos 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Özet

Proprotein konvertaz subtilisin/kexin 9 (PCSK9) türüdür serum düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri düzenleyen bir tek-ciro proteaz ve sonuç olarak, kalp-damar hastalıkları. PCSK9 proteolizis tam hypercholesterolemic etkisi için gerekli olmasına rağmen proteolitik işlevini değerlendirilmesi zordur: PCSK9 sadece kendisini ayırmak için bilinen, sadece tek bir ciro uğrar ve proteolizis sonra substrat korur onun aktif bir otomatik inhibitörü olarak. Burada sunulan yöntemleri bu zorlukların üstesinden gelir bir tahlil açıklanmaktadır. Cins proteolizis bir hücre tabanlı içerik ve bağlantılar başarılı bölünme klimalı ortamda kolayca okunabilir salgılanan luciferase etkinlik için tahlil odaklanır. Via sıralı adımları mutagenesis, geçici transfection ve bir luciferase okuma tahlil PCSK9 proteolizis ya da moleküler genetik pertürbasyon koşullar altında bir yüksek-den geçerek şekilde sonda. Bu sistem klinik olarak keşfedilen missense tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs), de PCSK9 proteolizis küçük molekül inhibitörleri ile taranması gelince biyokimyasal değerlendirme için son derece uygundur.

Giriş

PCSK9 hedefi LDL reseptör (LDL-R) bozulması için LDL kolesterol (LDL-C) yükselterek ve aterosklerotik kalp hastalığı1,2sürüş. Tedavi hedefleme PCSK9 sağlam LDL-C daha düşük ve kardiyovasküler sonuçlar hastalar için bile bir saldırgan lipid düşürücü tedavi statinler3,4ile eklendiğinde geliştirmek. Şu anda onaylanmış tedaviler antikor tabanlı yaklaşımlar, sınırlı ancak ve maliyet-etkililik5,6bir eksikliği muzdarip. Bu sorunu çözmek için daha az maliyetli tedavi alternatifleri, hastalar daha büyük yararlar elde etmek büyük olasılıkla tanımlamak için bir yol ya da her ikisi, gereklidir.

Küçük molekül yaklaşımlar hücre içi PCSK9 hedef, geliştirilmiş bir rota yönetim sağlamak ve onları yapma "Kutsal kase" içinde bu alan7maliyetleri azaltmak. Ancak, PCSK9 küçük moleküller tarafından uyuşturucu için zor kanıtlamıştır. Öz-proteolizis PCSK9 olgunlaşma8 hızı sınırlaması adım ve LDL-R9üzerindeki maksimal etkisi için gerekli gibi bir proteaz PCSK9'ın proteolitik işlevi hedefleme çekici bir strateji vardır. Bugüne kadar ancak, bu strateji büyük olasılıkla PCSK9'ın benzersiz Biyokimya nedeniyle başarılı olmamıştır: PCSK9 cleaves yalnızca kendisini10, bir tek-ciro tepki gerçekleştirme ve öz-bölünme sonra prodomain PCSK9 aktif bölgesinde bağlı kalır bir herhangi bir daha fazla proteaz aktivitesinin okuma engelleyen otomatik inhibitörü11.

Bu makale PCSK9 proteolitik işlevi yüksek üretilen iş moda8değerlendirmek için bir yöntem sunar. Site yönettiği mutagenesis Müfettişler bu tahlil onları proteolizis, PCSK9 olgunlaşma hızı sınırlaması adım üzerindeki etkileri için değerlendirmek için klinikte buldum SNPs kodlama etkilerini araştırmak için kullanabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem hangi sonuçta LDL-r PCSK9 sunumunu bozabilir (ve PCSK9'ın hypercholesterolemic etkisi modüle için) beklenen PCSK9 proteolizis, modülatörler tanımlamak için yüksek üretilen iş ekranlar tasarımında yararlı olacaktır . Son olarak, i) bir belirli substrat-proteaz çift bulunabilir ve uygun II) bir hücre içi bağlantı için belgili tanımlık substrate kurulabilir koşuluyla bu iletişim kuralı ile özünde düşük etkinlik, diğer proteaz için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. site yönettiği Mutagenesis proteaz vektör

  1. Bir mutasyon ilgi standart site yönettiği mutagenesis protokolleri12bir değişiklik kullanarak yüklemek için tasarım ve düzen özel sentez oligonucleotides. (Olmadan ek arıtma) standart desalted astar tamamen kabul edilebilir.
    Not: Astar tasarımlar için genel bir yaklaşım faiz polimeraz için belirli bir erime sıcaklık (Tm) hesaplama kullanarak Tablo 1, gösterildiği gibi kısmen üst üste astar oluşturma içerir.
  2. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) kadar site yönettiği mutagenesis için buza, Tablo 2' de gösterildiği gibi ayarlayın.
  3. PCR Tablo 3' te gösterildiği gibi döngüsü.
  4. Her PCR 2-5 µL % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak ve başarılı bir amplifikasyon onaylamak için ürünler görselleştirin.
    Not: Başarılı bir PCR şablonu (~7.8 kB) yaklaşık boyutu işareti bir tek, önde gelen DNA bant gösterecektir.
  5. DpnI (başına 25-µL reaksiyon) 0.5 µL ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
  6. Reaksiyon kimyasal olarak yetkili Escherichia coliiçine 2 µL dönüşümü.
    Not: Bir hızlı büyüyen e.coli suşu kuluçka süreleri azaltmak ama klonlama herhangi bir zorlanma kabul edilebilir olacaktır.
  7. 50-100 µg/mL carbenicillin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerine dönüşümleri plaka. Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  8. 2-4 kolonileri küçük ölçekli Kültür (2-5 mL LB orta ile 50-100 µg/mL carbenicillin) büyümeye seçin. Bulanık kadar 220 rpm'de 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
  9. Plazmid üretici yönergelerine göre bir plazmid DNA arıtma (yani, "miniprep") kit kullanarak hücrelerden DNA izole et. Eluted DNA microvolume spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek.
  10. Plazmid DNA kapsamlı bir Sanger sıralama Servisi (çekirdek veya gibi ticari tesis) kullanarak sıra. DNA örnekleri hizmetin belirtimlerine göre hazırlayın. Önceki sıralama tepkileri başarıyla kullanılan astar Tablo 4' te belirtilmiştir.
    Not: tüm plazmid PCR güçlendirme nedeniyle tüm PCSK9 Kodlayıcı bölge sıralama her mutant için önerilir.

2. yüksek-den geçerek Luciferase tabanlı proteolizis tahlil

  1. Hücre kaplama (0 gün)
    1. Düşük-geçit HEK293T hücreleri deneyler için kullanın ve Dulbecco'nın bir kültür kartal Orta (DMEM) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS) değiştirilebilir. Gerçekleştirmek tüm cep doku kültürü başlıklı steril koşullarda iş luciferase etkinliği tahlil için hazır kadar. Wells ve transfections nüsha test her koşul için gerçekleştirilecek tahmin deney için gerekli tabak sayısını tahmin ediyoruz.
    2. Bir üst şişesi HEK293T hücrelerden en az hacmi % 0.05 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA hücreleri kapsayacak şekilde) ile tedavi bunları ayırmak. Tripsin-EDTA DMEM FBS ve transferi ile desteklenmiş 2 hacimleri ile devre dışı bırakabilirsiniz bir steril tüp hücrelere. Hücreleri saymak bir otomatik hücre sayaç (ve trypan ile mavi boyama). 500 x g hücreleri kurtarmak 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi.
    3. Tripsin içeren orta Aspire edin ve 2 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon kültür ortamına hücrelerde sulandırmak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücrelerin 100 µL 2 x 104 hücreleri/iyi bir son tohum konsantrasyon verir bir beyaz (opak-alt) 96-şey plaka, her şey için transfer.
      Not: ilk deneyler için bir kız kardeşi, temiz-alt 96-şey plaka, hücre büyümesi ve bağlılık iletişim kuralı ve sorun giderme kılavuzu gelecekteki sırasında izlemek için Ayrıca temel yararlı olabilir.
    4. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.
    5. Plazmid bir 96-iyi biçimde ana bir tabak hazırla. Her plazmid elüsyon arabelleği (Tris-HCl, pH 8,5) 50 ng/µL bireysel bir iyi bir 96-şey plaka için sulandırmak.
      1. 4 kuyu olumlu denetim (WT) plazmid8, negatif kontrol (S386A) plazmid8ve plazmid ücretsiz tampon (için sahte transfections) hazırlayın. Eğer ilaç ya da diğer hücresel dayalı tedaviler planlanmaktadır, o zaman her şey olumlu denetim (WT) plazmid ile ana plaka hazırlamak, 4 ile birlikte her negatif kontrol (S386A) plazmid ve plazmid ücretsiz tampon kuyuları.
  2. Transfection (1. gün)
    1. Derin-şey 96-şey plakaları kullanarak bir 96-şey plaka biçimde transfection karışımı hazırlayın. Transfections pipetting ve transfer kayıplar için hesabınıza yeterli reaktifler hazırlamak emin olun nüsha gerçekleştirin.
      Not: Aşağıdaki hesaplamaları (420 kuyular için konservatif tahmini) nüsha bir 96-şey plaka çalıştırmak için yeterli reaktif hazırlayın.
      1. Reaktif 50.4 µL azaltılmış-serum orta 2050 µL için ekleme bir seyreltilmiş lipid transfection reaktif ana bir karışımını yapmak. Bir DNA precomplexation reaktif reaktif 33.6 µL azaltılmış-serum orta 1730 µL ekleme, ana bir karışımını yapmak.
      2. Bir çok kanallı pipet, aliquot 16.8 µL derin-şey plaka her kuyuya seyreltilmiş DNA precomplexation reaktif karışımı kullanarak.
      3. Bir çok kanallı pipet, aliquot 3.2 µL kullanarak (160 ng), her plazmid derin-şey plaka her kuyuya ana plaka.
      4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her seyreltilmiş lipid transfection reaktif karışımı aliquot 20 µL tabak iyi ve her şey çok kanallı pipet kullanarak içeriği karıştırın. Kuruyucu ve onlara oda sıcaklığında (RT) oturup formu lipid: DNA komplekslerinde için 10-15 dk için.
        Not: transfection iyi başına son bileşenleri aşağıdaki gibi olacaktır: 40 ng DNA, transfection reaktif 0,12 µL ve 0,08 µL DNA pre-complexation reaktif ve içerik her şey-ecek var olmak 10 µL toplam hacim (azaltılmış-serum orta).
    2. Yavaşça hücreleri bozmaya değil dikkat çekici bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plakaları 293T hücrelerde ortamda değişimi. DMEM % 10 ile desteklenen 95 µL emişli orta yerine FBS.
      Not: Bu ilgi herhangi bir ilaç hücrelerle tedavi için uygun bir zaman olacaktır.
    3. Her uygun iyi üzerinden için çok kanallı pipet 10 µL transfection karışımı ekleyin. Yavaşça kuyuları içeriğini karıştırmak için plaka girdap. Plaka %5 CO2 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Wells son hacim 105 µL için buharlaşma için 24 h üzerinden hesap gelir.
  3. Tahlil (2 gün)
    1. Bir hisse senedi çözüm coelenterazine kimyasalları hazırlamak: [taze hazırlanan fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS), çözünmüş] 3 M sodyum askorbat, 5 M NaCl, 10 mg/mL Sığır serum albumin (BSA; içinde çözünmüş PBS, taze hazırlanmış) ve 2 mM coelenterazine (içinde çözünmüş acidified metanol) 3 N HCL 10 mL başına 200 µL içeren.
      Not: 2 mM coelenterazine 2 hafta ne zaman-80 ° c ve ışık yokluğunda tutulur depolanabilir.
    2. 2 x coelenterazine reaktifler bir ayrı reaktif her hücre ve orta, ile luciferase okuma için Tablo 5göre hazırlayın. İlk coelenterazine kurtarmak tüm reaktifler karışımı karışımı bir 0,22-µm şırınga filtre ve coelenterazine ekleyin. Plakalar için eklenecek hazır olana reaktifleri ışıktan korumak.
      Not: eriyik--dan filtrasyon kaybı nedeniyle, filtrasyon, hem de transferler için kaybı her iki hesap için yeterli reaktif olun. Tablo 5 son konsantrasyonu 2 x reaktifler (aynı zamanda bir reaktif bir 96-şey plaka okumak için eklemek için hisse senedi çözüm miktarı) gösterir.
    3. Hücreleri kuluçka 24 saat sonra transfection kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 50 µL şartına orta her kuyudan taze, beyaz popolu (opak) bir 96-şey plakasına aktarın.
      1. Tabak ister orta veya hücreleri içeren olarak etiketleyin. Eğer birden fazla 96-şey plaka transfected, böylece her Orta içeren plaka hücreleri onun üst plaka ile eşleştirilmiş olan sağlamak için tabak etiketleyin.
    4. Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik sigara coelenterazine reaktif 50 µL sadece şartına orta içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak
    5. Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik coelenterazine reaktif 50 µL hücreleri içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak
    6. Kuluçka sonra plaka okuyucu yalnızca orta plaka ışıldama okumak. Sonra aynı plaka okuyucu hücreyi içeren plaka ışıldama okumak.
    7. Tabakları atmak ve veri analizi için dosyaları kaydetmek.

3. veri analizi

  1. Elektronik tablo yazılımı kullanarak bir ilk veri çözümlemesi gerçekleştirin. Hücre ve orta plakaları sonuçlarını içeren bir elektronik tablo oluşturun.
  2. El ile kötü transfected kuyu tanımlamak için hücre plakaları verilerden inceleyin. < %5 - 10 göstermek Wells % negatif kontrol (S386A) plazmid okuma kabul edilmelidir olarak kötü transfected, bu veri şüpheli yorumu yapma.
  3. Her plaka sahte transfected kuyulardan ortalama arka plan ışıldama hesaplayın. Bu plaka değerleri her tabaktan arka plan çıkarma.
    Not: Bu değer kullanılan plaka okuyucu bağlı olarak önemsiz olabilir.
  4. İşlem luciferase etkinliği genel luciferase faaliyet her şey için karşılaştırıldığında orta oranda hesaplayarak verileri. Çünkü her iki klimalı ortam ek olarak hücreleri hücre plaka içeren ve salt orta plaka hücre plaka şartına orta aynı miktarı içerir, aşağıda ki formül kullanmak uygundur:
    figure-protocol-1
    Burada, RLU göreli ışıldama birimleri, arka plan düşülen okuma plaka okuyucu =.
  5. Ortalama salgılanan luciferase pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A) kuyu hesaplayın.
  6. Bir Z-faktör13hesaplayarak deneme genel kalitesini değerlendirmek:
    figure-protocol-2
    Not: Etkin değerleri pozitif denetiminden (WT) ve etkin olmayan değerler negatif kontrol (S386A) kuyulardan gelir. 1'e yakın değerler daha deneysel kaliteli belirtir. Deneme yinelenen veya değeri 0 ise iş akışı en iyi duruma getirme düşünün.
  7. Verileri elektronik tablo programından bilimsel veri analiz yazılımı aktarın.
  8. Pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A), ortalama değerleri pozitif kontrol 1 ve negatif kontrol 0 ayarlanması salgılanan luciferase faaliyete normalleştirmek.
  9. En büyük yanlış bulma oranı % 1'e ayarlama regresyon ve aykırı kaldırma (bozgun) yöntemini kullanarak outliers için verileri temizlemek.
  10. İçin istatistiksel olarak anlamlı fark mutant her koşul (veya mutant) için verileri karşılaştırarak WT etkinliği (1 değeri için normalleştirilmiş) ortalaması değerlendirin. Birden çok unpaired tgerçekleştirmek-α ve Holm-Sidak yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltme testleri, 0,05 =.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yüksek işlem hacmi proteolizis tahlil üç büyük zorlukların üstesinden üzerine dayanır. İlk olarak, bir tek-ciro PCSK9 proteaz inhibitör eksik bir PCSK9 proteaz özünde düşük çıktı aşmak için prodomain, bölünme serisi prodomain kuyruğunu, salgılanan14olabilir bir luciferase bağlantılı kullanılır. İkinci olarak, pas proteaz ihtiyacını karşılamak için onun inhibitör kompleksi prodomain, iki polipeptitler olan trans içinde bir hücresel bağlam1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda açıklanan deneysel prosedürler tek-ciro proteaz PCSK9 özünde düşük etkinlik üstesinden gelmek ve proteolitik işlevini sağlam bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Tahlil anahtar kavramı enzimatik güçlendirilmiş bir okuma bir tek-ciro olay dönüştürme üzerine dayanır. Güçlü bir tahlil nispeten kısa zaman dilimi ve rahatlık-in kullanma luciferase muhabir, hem de onun ölçeklenebilirliği yüksek üretilen iş yaklaşımlara içerir. Buna ek olarak, tahlil proteolizis onun yerli, hücresel bağlamda değerlendirir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar NHLBI/NIH (K08 HL124068 ve LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü Catalyst programı (UL1 TR000004), UCSF akademik Senato Hellman Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteğinden teşekkür bir Gilead Sciences araştırma bilim adamı Ödülü, bir Pfizer ASPIRE kardiyovasküler Ödülü (tüm John S. Chorba) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (için Adri M. Galvan ve Kevan M. Shokat).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PCR TüpleriUSA Scientific1402-2900PCR
Q5 Hot Startiçin New England BiolabsM0493LYüksek Kaliteli DNA Polimeraz
Deoksinükleotid Çözelti KarışımıNew England BiolabsN0447LdNTP'ler (PCR için)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTYazarlarn/aYazarlardan edinilebilir
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386AYazarlarn/aYazarlardan temin edilebilir
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100DNA jelleri için
Mavi Işık Bazlı E-Jel Görüntüleyici SistemiThermoFisher Scientific4466612DNA jellerini görüntülemek için
SYBR Güvenli DNA Jel LekesiThermoFisher ScientificS33102DNA jelleri için
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1DNA jeli çalışan tampon için
Buzlu asetik asitThermoFisher ScientificA38-500DNA jel çalışma tamponu için
Etilendiamintetraasetik asit çözeltisiMillipore Sigma3690EDTA, DNA jeli çalışan tampon
için 1 kb DNA merdiveniAltın BiyoteknolojiD010DNA merdiveni
DpnINew England BiolabsR0176SKısıtlama enzimi
100 & mikro ile LB Agar plakaları; g/mL karbenisilinTeknovaL1010LB-Karbonhidrat plakaları
Tek Atış Mach1 T Faj Dirençli Kimyasal Olarak Yetkin E. coliThermoFisher ScientificC862003Kimyasal olarak yetkin hücreler
LB Et suyu, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
KarbenisilinAltın BiyoteknolojiC-103-5Seçici antibiyotik
E.Z.N.A. Plazmid Mini Kit IOmega BioTekD6942-02DNA Saflaştırma Miniprep kiti
NanoDrop 2000 SpektrofotomerThermoFisher ScientificND-2000CSpektrofotometre
293T HücreleriAmerikan Doku Kültürü Koleksiyonu (ATCC)CRL-3216HEK 293T hücreleri
DMEM, yüksek glikoz, piruvatThermoFisher Scientific11995065DMEM, memeli hücresi medya
Fetal Sığır SeraAxenia BiologixF001FBS
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific25300062Tripsin, hücre ayrışması için
Fosfat tamponlu salin (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Kontes otomatik hücre sayacıThermoFisher ScientificC10227Otomatik hücre sayımı
Kontes hücre sayma odası slaytlarıThermoFisher ScientificC10228Hücre sayımı için slaytlar
CELLSTAR Doku Kültürü Plakaları, Beyaz, Beyaz Altlı, KapaklıGrenier Bio-One655083Beyaz, beyaz tabanlı 96 kuyulu plaka
TempPlate eteksiz 96 oyuklu PCR plakası, doğalUSA Scientific1402-9596Ana plazmid plakası için 96 oyuklu plaka
Nunc 2.0mL DeepWell PlakalarThermoFisher Scientific278743 96 kuyu derin kuyu plakası
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008Lipid transfeksiyon reaktifi, Lf3K
P3000 ReaktifiThermoFisher ScientificL3000008ile sağlanan DNA ön kompleksleştirme reaktifi
ThermoFisher Scientific31985062Azaltılmış serum ortamı transfeksiyon için
(+) - Sodyum L-askorbatMillipore SigmaA4034Sodyum askorbat
Sodyum klorürMillipore SigmaS9888NaCl
Albümin, Sığır Serumu, Fraksiyon V, Düşük Ağır MetallerMillipore Sigma12659BSA
Metanol (HPLC)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
Hidroklorik asitVWRJT9535-2Konsantre HCl
CoelenterazineAltın BiyoteknolojiCZ2.5Lusiferaz substrat
Şırınga Filtresi, SterilThermoFisher Scientific09-720-3Steril filtre, PVDF, 0.22 ve mikro; m gözenekli
Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-200XLS+Rainin17013810Çok Kanallı pipet
Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-20XLS+Rainin17013808Çok Kanallı Pipet
Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-10XLS+Rainin17013807Çok Kanallı pipet
Reaktif rezervuarıCorning4870Reaktifler
için olukSantrifüj tüpleri, 15 mLThermoFisher Scientific05-539-1215 mL tüpler
Santrifüj tüpleri, 50 mLCorning43082950 mL tüpler
Spark Mikroplaka OkuyucuTecanN/APlaka Okuyucu
ExcelMicrosoft2016 for MacElektronik tablo yazılımı
PrismGraphPad Yazılımıv7Bilimsel veri analiz yazılımı
Lf3K OptiMEM I İndirgenmiş Serum Ortamı

Kaynaklar

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PCSK9 ProteoliziY ksek Kapasiteli TaramaHEK293 H creleriGe ici TransfeksiyonKoelenterazin ReaktifiKondisyonlu MedyumKesim DizisiSNP AnaliziK k Molek ll nhibit rler

İlgili makaleler