Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Proprotein konvertaz subtilisin/kexin 9 (PCSK9) türüdür serum düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri düzenleyen bir tek-ciro proteaz ve sonuç olarak, kalp-damar hastalıkları. PCSK9 proteolizis tam hypercholesterolemic etkisi için gerekli olmasına rağmen proteolitik işlevini değerlendirilmesi zordur: PCSK9 sadece kendisini ayırmak için bilinen, sadece tek bir ciro uğrar ve proteolizis sonra substrat korur onun aktif bir otomatik inhibitörü olarak. Burada sunulan yöntemleri bu zorlukların üstesinden gelir bir tahlil açıklanmaktadır. Cins proteolizis bir hücre tabanlı içerik ve bağlantılar başarılı bölünme klimalı ortamda kolayca okunabilir salgılanan luciferase etkinlik için tahlil odaklanır. Via sıralı adımları mutagenesis, geçici transfection ve bir luciferase okuma tahlil PCSK9 proteolizis ya da moleküler genetik pertürbasyon koşullar altında bir yüksek-den geçerek şekilde sonda. Bu sistem klinik olarak keşfedilen missense tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs), de PCSK9 proteolizis küçük molekül inhibitörleri ile taranması gelince biyokimyasal değerlendirme için son derece uygundur.
Giriş
PCSK9 hedefi LDL reseptör (LDL-R) bozulması için LDL kolesterol (LDL-C) yükselterek ve aterosklerotik kalp hastalığı1,2sürüş. Tedavi hedefleme PCSK9 sağlam LDL-C daha düşük ve kardiyovasküler sonuçlar hastalar için bile bir saldırgan lipid düşürücü tedavi statinler3,4ile eklendiğinde geliştirmek. Şu anda onaylanmış tedaviler antikor tabanlı yaklaşımlar, sınırlı ancak ve maliyet-etkililik5,6bir eksikliği muzdarip. Bu sorunu çözmek için daha az maliyetli tedavi alternatifleri, hastalar daha büyük....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. site yönettiği Mutagenesis proteaz vektör
- Bir mutasyon ilgi standart site yönettiği mutagenesis protokolleri12bir değişiklik kullanarak yüklemek için tasarım ve düzen özel sentez oligonucleotides. (Olmadan ek arıtma) standart desalted astar tamamen kabul edilebilir.
Not: Astar tasarımlar için genel bir yaklaşım faiz polimeraz için belirli bir erime sıcaklık (Tm) hesaplama kullanarak Tablo 1, gösterildiği gibi kısmen üst üste astar oluşturma içerir. - Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) kadar site yönettiği mutagenesis için buza, Tablo 2' de gösterildiği gibi ayarlayın. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yüksek işlem hacmi proteolizis tahlil üç büyük zorlukların üstesinden üzerine dayanır. İlk olarak, bir tek-ciro PCSK9 proteaz inhibitör eksik bir PCSK9 proteaz özünde düşük çıktı aşmak için prodomain, bölünme serisi prodomain kuyruğunu, salgılanan14olabilir bir luciferase bağlantılı kullanılır. İkinci olarak, pas proteaz ihtiyacını karşılamak için onun inhibitör kompleksi prodomain, iki polipeptitler olan trans içinde bir hücresel bağlam1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda açıklanan deneysel prosedürler tek-ciro proteaz PCSK9 özünde düşük etkinlik üstesinden gelmek ve proteolitik işlevini sağlam bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Tahlil anahtar kavramı enzimatik güçlendirilmiş bir okuma bir tek-ciro olay dönüştürme üzerine dayanır. Güçlü bir tahlil nispeten kısa zaman dilimi ve rahatlık-in kullanma luciferase muhabir, hem de onun ölçeklenebilirliği yüksek üretilen iş yaklaşımlara içerir. Buna ek olarak, tahlil proteolizis onun yerli, hücresel bağlamda değerlendirir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar NHLBI/NIH (K08 HL124068 ve LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü Catalyst programı (UL1 TR000004), UCSF akademik Senato Hellman Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteğinden teşekkür bir Gilead Sciences araştırma bilim adamı Ödülü, bir Pfizer ASPIRE kardiyovasküler Ödülü (tüm John S. Chorba) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (için Adri M. Galvan ve Kevan M. Shokat).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PCR Tüpleri | USA Scientific | 1402-2900 | PCR |
| Q5 Hot Start | için New England Biolabs | M0493L | Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz |
| Deoksinükleotid Çözelti Karışımı | New England Biolabs | N0447L | dNTP'ler (PCR için) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Yazarlar | n/a | Yazarlardan edinilebilir |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Yazarlar | n/a | Yazarlardan temin edilebilir |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | DNA jelleri için |
| Mavi Işık Bazlı E-Jel Görüntüleyici Sistemi | ThermoFisher Scientific | 4466612 | DNA jellerini görüntülemek için |
| SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi | ThermoFisher Scientific | S33102 | DNA jelleri için |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | DNA jeli çalışan tampon için |
| Buzlu asetik asit | ThermoFisher Scientific | A38-500 | DNA jel çalışma tamponu için |
| Etilendiamintetraasetik asit çözeltisi | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, DNA jeli çalışan tampon |
| için 1 kb DNA merdiveni | Altın Biyoteknoloji | D010 | DNA merdiveni |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Kısıtlama enzimi |
| 100 & mikro ile LB Agar plakaları; g/mL karbenisilin | Teknova | L1010 | LB-Karbonhidrat plakaları |
| Tek Atış Mach1 T Faj Dirençli Kimyasal Olarak Yetkin E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Kimyasal olarak yetkin hücreler |
| LB Et suyu, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Karbenisilin | Altın Biyoteknoloji | C-103-5 | Seçici antibiyotik |
| E.Z.N.A. Plazmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Saflaştırma Miniprep kiti |
| NanoDrop 2000 Spektrofotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spektrofotometre |
| 293T Hücreleri | Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T hücreleri |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, memeli hücresi medya |
| Fetal Sığır Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Tripsin, hücre ayrışması için |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Kontes otomatik hücre sayacı | ThermoFisher Scientific | C10227 | Otomatik hücre sayımı |
| Kontes hücre sayma odası slaytları | ThermoFisher Scientific | C10228 | Hücre sayımı için slaytlar |
| CELLSTAR Doku Kültürü Plakaları, Beyaz, Beyaz Altlı, Kapaklı | Grenier Bio-One | 655083 | Beyaz, beyaz tabanlı 96 kuyulu plaka |
| TempPlate eteksiz 96 oyuklu PCR plakası, doğal | USA Scientific | 1402-9596 | Ana plazmid plakası için 96 oyuklu plaka |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plakalar | ThermoFisher Scientific | 278743 96 kuyu derin kuyu plakası | |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfeksiyon reaktifi, Lf3K |
| P3000 Reaktifi | ThermoFisher Scientific | L3000008 | ile sağlanan DNA ön kompleksleştirme reaktifi |
| ThermoFisher Scientific | 31985062 | Azaltılmış serum ortamı transfeksiyon için | |
| (+) - Sodyum L-askorbat | Millipore Sigma | A4034 | Sodyum askorbat |
| Sodyum klorür | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albümin, Sığır Serumu, Fraksiyon V, Düşük Ağır Metaller | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Metanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hidroklorik asit | VWR | JT9535-2 | Konsantre HCl |
| Coelenterazine | Altın Biyoteknoloji | CZ2.5 | Lusiferaz substrat |
| Şırınga Filtresi, Steril | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Steril filtre, PVDF, 0.22 ve mikro; m gözenekli |
| Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Çok Kanallı pipet |
| Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Çok Kanallı Pipet |
| Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Çok Kanallı pipet |
| Reaktif rezervuarı | Corning | 4870 | Reaktifler |
| için olukSantrifüj tüpleri, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tüpler |
| Santrifüj tüpleri, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tüpler |
| Spark Mikroplaka Okuyucu | Tecan | N/A | Plaka Okuyucu |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Elektronik tablo yazılımı |
| Prism | GraphPad Yazılımı | v7 | Bilimsel veri analiz yazılımı |
Kaynaklar
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
