Method Article

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

DOI:

10.3791/58268

⸱

September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İkili transkripsiyon sistemleri görselleştirme ve hücre kader ve gen ifade hücrelerin belirli gruplar veya model organizmalar içinde doku manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan güçlü genetik araçlardır. Bu sistemlerde iki bileşeni ayrı transgenik çizgiler olarak bulunmaktadır. Bir sürücü çizgi transkripsiyon bir aktivatör doku özel Rehberleri/arttırıcılar kontrolünü ve hedef gen aşağı transkripsiyon harekete geçirmek bağlama sitesine yerleştirilen bir muhabir/efektör satır limanları altında ifade eder. Her iki bileşenin yataklık hayvan doku özgü transactivation bir hedef Gen ifadesinin neden. Kesin kronolojik zamanmekansal gen hedeflenen dokularda hücre/gen etkinliğini tarafsız yorumlanması için kritik ifadesidir. Bu nedenle, özel hücre/doku özel sürücü satırları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek esastır. Burada istihdam ederek yüksek doku özel hedeflenmiş ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut bir "düzenli olarak kümelenmiş Interspaced kısa palindromik tekrar/CRISPR-ilişkili" (CRISPR/CA)-Teknik düzenleme genom dayalı. Bu yöntemde, bir genin iki iplikçikli kırılmalar (DSB) oluşturmak için Drosophila genom içinde ilk kodlama exon belirli sitelere RNA'ların (gRNA) yol Cas9 chimeric iki tarafından hedeflenen endonükleaz. Daha sonra transactivator sıra içeren bir eksojen donör plazmid kullanmak, hücre özerk onarım makineleri Homoloji yönetmen onarım (HDR) kesin silme ve değiştirme exon transactivator ile sonuçlanan DSB, sağlar sıra. Knocked olarak transactivator sadece hücrelerde ifade edilir nerede CIS-eski yerine koymak gen düzenleyici elemanlarının fonksiyonel. Burada ikili bir transkripsiyon sürücü Drosophila fgfiçinde ifade oluşturmak için sunulan ayrıntılı adım adım Protokolü /branchless-epitel/nöronal hücreleri üreten kabul için herhangi bir gen veya doku özel ifade.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik toolbox için hedeflenen Gen ifadesinin de dahil çok çeşitli hücresel genlerin işlevi araştırmak için en iyi model sistemleri biri haline Drosophila, geliştirilmiştir. Maya Gal4/UAS (ters yönde harekete geçirmek sıra) gibi ikili ifade sistemleri ilk doku özgü artırıcı bindirme ve gen misexpression Drosophila genetik model1 (Şekil 1) için kabul edilmiştir. Bu sistem çok sayıda gen overexpression, misexpression, seçili grup hücreleriyle de olduğu gibi hücre ablasyon, hücre işaretleme, hücresel ve moleküler canlı izleme nakavt kronolojik zamanmekansal düzenlenmesi gibi teknikleri geli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. tasarlama ve gRNA ifade vektör oluşturma

  1. Tam bir exon uzun tanımlanmış bir bölgenin değiştirmek için her gRNA özellikle ilgi seçili bölgenin iki ucu hedefleyebilirsiniz bir çift gRNA yaklaşım6, kullanın. Sürücünün doğru bir gen özgü kronolojik zamanmekansal ifade elde etmek için iki gRNA hedef site içinde ilk kodlama exon genin seçin.
  2. Drosophila melanogasteriçin flyCRISPR en iyi hedef bulma aracını (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) kullanarak gRNA hedef siteleri seçin. Diğer kullanılabilir CRISPR tasarım araçları de, en iyi duruma getirilmiş CRISPR tasarım aracı (http://crispr.mit.ed....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı başarıyla hedeflenen ikili ifade muhabir sistem belirli hücreleri5ifade bnl için bir oluşturmak için kullanılan. BDT-karmaşık kronolojik zamanmekansal bnl ifade kontrol düzenleyici elemanlarının (CREs) değil karakterize. Bu nedenle, kronolojik zamanmekansal ifade endojen bnl Düzenleyici sıralı denetim altında elde etmek için yalnızca ilk kodlama exon bnl , bakteriyel LexA transactivator sıra i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, Drosophila artırıcı tuzakları iki farklı yöntemlerle üretilen. Bir yolu bir sürücü rasgele yerleştirilmesi içerir (örneğin., Gal4) genom tarafından devralınmasına sırayla (e.g., P-eleman transpozisyonu)1 . Alternatif olarak, sürücü dizileri sonra genom3,11ektopik bir siteye entegre bir plazmid yapısında bir sözde artırıcı/organizatörü bölgesinin transkripsiyon kontrolü altında yerleştirilebilir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. F. liman, Dr. K. O'Connor-Giles ve Dr. S. Feng CRISPR strateji üzerine tartışmalar için teşekkürler; Dr. T.B. Kornberg ve reaktifler Bloomington stok merkezi; UMD görüntüleme çekirdek tesis; ve NIH finansman: R00HL114867 ve R35GM124878 SR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218klonlama
LB-AgarBD, DifcoBD  244520klonlama
Tris-HClSigma AldrichT3253Moleküler Biyoloji
EDTASigma AldrichE1161Moleküler Biyoloji
NaClSigma AldrichS7653Moleküler Biyoloji
UltraPure DNase/RNaz İçermeyen SuThermoFisher Scientific10977-023Moleküler Biyoloji
%10 SDSSigma Aldrich71736Moleküler Biyoloji
KOAcFisher-ScientificP1190Moleküler Biyoloji
EtOHFisher-Scientific04-355-451Moleküler Biyoloji
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plazmid Maxipep kitleriThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539SRestriksiyon enzimi
PrimerleriIDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabDNA şablonu ve gRNA için vektör
KAPA HiFi Sıcak Başlangıç- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-yüksek sadakat TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611DNA montajı
pBPnlsLexA:p65UwLexA amplifikasyonuAddgene
Proteinaz KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, boya ile (kırmızı)SydlabMB067-EQ2RMoleküler Biyoloji
Jel elüsyon kitiZymo Research (Genesee Scientific)11-300Moleküler Biyoloji
TRI reaktifiSigma-AldrichMoleküler Biyoloji
Direct-zol RNA saflaştırma kitleriZymo Research (Genesee Scientific)11-330Moleküler Biyoloji
OneTaq Tek Adımlı RT-PCR KitiNEBE5315SMoleküler Biyoloji
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly hattı
UAS-CD8:GFPKornberg laboratuvarıUçuş hattı
btl-Gal4Kornberg laboratuvarıUçuş hattı
MKRS/TB6BKornberg laboratuvarıSinek
hattı Konfokal Mikroskop SP5XLeicaGörüntüleme ifade modeli
CO2 istasyonuGenesee Scientific59-122WCUsinek itme
Stereo mikroskopOlympusSZ-61sinek itme
Mikrotüp homojenleştirici tokmaklarFisher-Scientific03-421-217genomik DNA izolasyonu
NanoDrop spektrofotometresiThermoFisher ScientificND-1000DNA miktar tayini
,, , için DNA şablonu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

Related Articles