Yöntem makalesi

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

DOI:

10.3791/58268

⸱

19 Eylül 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İkili transkripsiyon sistemleri görselleştirme ve hücre kader ve gen ifade hücrelerin belirli gruplar veya model organizmalar içinde doku manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan güçlü genetik araçlardır. Bu sistemlerde iki bileşeni ayrı transgenik çizgiler olarak bulunmaktadır. Bir sürücü çizgi transkripsiyon bir aktivatör doku özel Rehberleri/arttırıcılar kontrolünü ve hedef gen aşağı transkripsiyon harekete geçirmek bağlama sitesine yerleştirilen bir muhabir/efektör satır limanları altında ifade eder. Her iki bileşenin yataklık hayvan doku özgü transactivation bir hedef Gen ifadesinin neden. Kesin kronolojik zamanmekansal gen hedeflenen dokularda hücre/gen etkinliğini tarafsız yorumlanması için kritik ifadesidir. Bu nedenle, özel hücre/doku özel sürücü satırları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek esastır. Burada istihdam ederek yüksek doku özel hedeflenmiş ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut bir "düzenli olarak kümelenmiş Interspaced kısa palindromik tekrar/CRISPR-ilişkili" (CRISPR/CA)-Teknik düzenleme genom dayalı. Bu yöntemde, bir genin iki iplikçikli kırılmalar (DSB) oluşturmak için Drosophila genom içinde ilk kodlama exon belirli sitelere RNA'ların (gRNA) yol Cas9 chimeric iki tarafından hedeflenen endonükleaz. Daha sonra transactivator sıra içeren bir eksojen donör plazmid kullanmak, hücre özerk onarım makineleri Homoloji yönetmen onarım (HDR) kesin silme ve değiştirme exon transactivator ile sonuçlanan DSB, sağlar sıra. Knocked olarak transactivator sadece hücrelerde ifade edilir nerede CIS-eski yerine koymak gen düzenleyici elemanlarının fonksiyonel. Burada ikili bir transkripsiyon sürücü Drosophila fgfiçinde ifade oluşturmak için sunulan ayrıntılı adım adım Protokolü /branchless-epitel/nöronal hücreleri üreten kabul için herhangi bir gen veya doku özel ifade.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik toolbox için hedeflenen Gen ifadesinin de dahil çok çeşitli hücresel genlerin işlevi araştırmak için en iyi model sistemleri biri haline Drosophila, geliştirilmiştir. Maya Gal4/UAS (ters yönde harekete geçirmek sıra) gibi ikili ifade sistemleri ilk doku özgü artırıcı bindirme ve gen misexpression Drosophila genetik model1 (Şekil 1) için kabul edilmiştir. Bu sistem çok sayıda gen overexpression, misexpression, seçili grup hücreleriyle de olduğu gibi hücre ablasyon, hücre işaretleme, hücresel ve moleküler canlı izleme nakavt kronolojik zamanmekansal düzenlenmesi gibi teknikleri geliştirilmesi kolaylaştırdı embriyo ve doku, soy izleme ve mozaik analizleri geliştirme sırasında süreçleri. Bakteriyel LexAgibi ikili transkripsiyon sistemi bir dizi /LexAop sistemi (Şekil 1) ve Neurospora Q-sistem, şimdi yaygın olarak Drosophila, ek olarak kullanılan güçlü genetik Araçlar Orijinal Gal4/UAS sistemi için hedeflenen gen ifade1,2,3.

Burada, genom düzenleme tekniği istihdam ederek son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisinde son gelişmeler çok çeşitli organizmalar yönlendirilmiş genom değişiklikler yapmak eşi görülmemiş fırsat sağladı. Diğer kullanılabilir genom düzenleme teknikleri için karşılaştırıldığında, CRISPR/Cas9 sistem, verimli, ucuz ve güvenilir. Bu teknoloji bakteriyel adaptif bağışıklık sisteminin bileşenleri kullanır: bir Cas9 endonükleaz iki iplikçikli mola (DSB) oluşturan Streptococcus pyogenes ve Cas9 için belirli genom sitesine kılavuzları chimeric Kılavuzu RNA (gRNA), hedeflenen DSB4. Hücreleri farklı yollar kullanarak DSB onarmak için makine içerir. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan küçük eklemelerin veya silmelerin eksojen bir HDR donör şablon olarak kullanarak bir tanımlanmış yönetmen/arzu genomik knock-içinde/knock-out Homoloji yönetmen onarım (HDR) tanıttı iken gen işlevi, bozmaya yol açar. HDR tabanlı yedek stratejisi verimli bir şekilde geleneksel artırıcı tuzak yöntemleri tüm sınırlamalar üstesinden son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için yararlı olabilir. Biz bir Drosophila endojen transkripsiyon ve çoğu düzenleme kontrolü altında ifade edilir bir ikili transkripsiyon sürücü çizgi oluşturma HDR CRISPR/Cas9-esaslı onarım kullanımı için adım adım bir yordam tarif gen. Bu protokol için biz göstermek için belirli bir sürücü satır nesil branchless trakeal hava yolu epitel5dallanma morfogenez düzenleyen bir FGF aile protein kodlama (bnl) Gen. Bu örnekte, bir bakteriyel LexA transactivator sıra sıra tarafından herhangi bir endojen CISdeğiştirmeden ilk kodlama exon bnl gen değiştirildi- bnl gen düzenleyici diziler. Biz strateji sadece bnl - içinde LexAoperator (LexAop veya LexO) aşağı yerleştirilen bir muhabir gen ifadesi spatiotemporally denetleyen bir bnl LexA sürücü satır oluşturulan gösterir epitel/mezenkimal/nöronal hücre ifade ediyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. tasarlama ve gRNA ifade vektör oluşturma

  1. Tam bir exon uzun tanımlanmış bir bölgenin değiştirmek için her gRNA özellikle ilgi seçili bölgenin iki ucu hedefleyebilirsiniz bir çift gRNA yaklaşım6, kullanın. Sürücünün doğru bir gen özgü kronolojik zamanmekansal ifade elde etmek için iki gRNA hedef site içinde ilk kodlama exon genin seçin.
  2. Drosophila melanogasteriçin flyCRISPR en iyi hedef bulma aracını (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) kullanarak gRNA hedef siteleri seçin. Diğer kullanılabilir CRISPR tasarım araçları de, en iyi duruma getirilmiş CRISPR tasarım aracı (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 de dahil olmak üzere kullanılabilir (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) ve E-net (www.e-crisp.org/E-CRISP).
    Not: Aşağıdaki iletişim kuralları gRNA tasarım ve klonlama yöntemleri yukarıda açıklanan6,7' den kabul edilmiştir.
    1. Gerçek sırası online araç kutusu içine kopyalayın. Belgili tanımlık en geçende serbest bırakmak Drosophila melanogaster genom ek açıklama yorum, "r_6," "Select genom." açılır menüsünü seçin Alan "Select kılavuz uzunluğunu (nt)," giriş "20." "Tüm CRISPR hedefler" bulun ve "CRISPR hedefleri bulmak" tıklatın seçin.
    2. Tüm aday gRNA hedefler "Sıkılık" ve "Sadece NGG" için "Maksimum" ayarlayarak "PAM" için değerlendirin. Herhangi bir potansiyel kapalı-hedefleri veya hedefleri kapalı olası en az sayıda olmadan gRNA siteleri seçmeyi deneyin. Web aracını kullanma Doench vd. gRNAs potansiyel bir "iyi" etkinliği puan ile seçmek için 2014 8 açıklanan.
    3. Aynı anda, orada hiçbir tek nükleotit polimorfizmi gRNA hedeflere enjeksiyon (Örneğin, nos Cas9 X kromozomu, BL # 54591 üzerinde) için seçili üst sinek çizgi genomu içinde olduğundan emin. Gratz vd 20157 genomik DNA üst sinek satırından ayıklamak için açıklanan protokol izleyin. PCR yükseltmek, yaklaşık olarak, faiz ve bir yüksek-sadakat DNA polimeraz dizisi kanattan primerler kullanılarak 500 – 1000 nt bölgeler; sıra-güçlendirilmiş PCR ürünleri doğrulayın.
  3. Tandem gRNA ifade vektör oluşturmak için iki protospacer diziyi pCFD4 RNA ifade vektör tanıtmak için bir tüp ligasyonu bağımsız Kopyalama Protokolü6 izleyin. Her iki sgRNAs güçlü U6:3 Rehberleri9 (https://www.crisprflydesign.org) ifade edilir nerede bir geliştirilmiş multi-gRNA ifade vektör (pCFD5) artık kullanılabilir olduğunu unutmayın. GRNAs pCFD4 vektör clone için DNA derleme yöntemini kullanın.
    1. Tasarım ve iki protospacer diziyi RNA ifade vektör pCFD4 tanıtmak için ileriye ve geriye doğru astar sipariş (tablo 1A). Yukarıda açıklanan6, ileri astar U6-1 organizatörü ve pCFD4'gRNA core karşılık gelen bölgeler çevrili ilk protospacer sıra içerir; ters astar gRNA çekirdek ve U6-3 organizatörü pCDF4 içinde karşılık gelen bölgeler çevrili ikinci protospacer geriye doğru tamamlayıcı dizisini içerir.
    2. DNaz ve RNase free Çift Kişilik distile su (GKD2O) ile 100 mikron için astar resuspend. 10 mikron çalışma konsantrasyonu astar olun. PCFD4 plazmid şablon olarak kullanmak ve bir yüksek-sadakat polimeraz kullanarak ve PCR reaksiyon6için önerilen ayarları PCR reaksiyon ayarlayın.
    3. PCFD4 plazmid BbsI enzim ile güçlendirilmiş ürün pCFD4 clone için aşağıdaki tepki kadar ayarlayarak sindirmek: 2-5 μg pCFD4 plazmid in, 10 sindirim arabellek x 5 μL, BbsI enzim ve son hacim için 50 μL getirmek için GKD2O 1 μL. Yavaşça tüp dokunarak ve dağınık damlacıkları tüp duvardan altına tarafından kısa bir tur toplama tarafından tepki içeriği karıştırın. Reaksiyon mix 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. PCR ürünü adım 2 ve 3. adımdaki sindirilir ürün üzerinde % 1'özel jel çalıştırın. Tamamen DNA bantları ayırmak yeterli süre Elektroforez gerçekleştirin. Kesim doğru ölçekli DNA bantları bir UV trans-ışığı altında önce arındırıcı jel elüsyon sütununda üreticinin yönerge kullanarak beklenen ürünler ( Tablo malzemelerigörmek). PCR ürünü 600 olmalıdır bp ve Doğrusallaştırılmış pCFD4 plazmid ~6.4 kb 6olmalıdır.
    5. DNA derleme tepki üreticinin yönerge başına bir PCR tüp ayarlayın (bkz. Tablo malzeme).
    6. Yetkili bakteri (DH5α veya ΔrecA1, ΔendA1ile benzer suşları) derleme ürünün 2 μL dönüştürmek, plaka üzerinde ampisilin (100 μg/mL) LB (LB/Amp) ağar kaplamalar içeren ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Not DNA derleme mix bazı bakteri suşları için zehirli olabilir, ancak derleme mix sulandrarak toksisite azaltabilir.
    7. 3-4 ampisilin dayanıklı kolonileri gecede inkübe plaka almak, 3 mL 100 μg/mL ampisilin içeren LB kolonisinde aşılamak ve bakteri aşılanmış bir 37 ° C Shaker gecede büyümek. Plazmid üreticinin öğretim takip plazmid mini hazırlık seti kullanarak bir gecede kültürlü bakterilerden ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek).
    8. Plazmid T3 tandem gRNA ekleme içeren doğru klonlar için ekran için evrensel astar ile sıra. Bir sıra onaylı pCFD4-gRNA içinde % 20 gliserol ve ileride kullanmak için bir-80 ° C dondurucu mağaza ile dönüştürülmüş bakteri gliserol stokunun kurmak.

2. tasarlama ve oluşturma HDR donör

  1. Genomik knock-içinde için bir Gal4 veya LexA sırasında iki Homoloji kolu tarafından çevrili transactivator sıra içeren bir çift iplikçikli HDR donör tasarlayın.
    1. Kullanım > 1,5 kb sol ve sağ Homoloji silah gRNA hedefleme kanat site (ler). Genişletilmiş Homoloji silah sırasında onarım işlemi 10HDR verimliliğini artırmak.
    2. PCR yükseltmek Homoloji silah enjeksiyon için seçilen üst sinek satırı çıkarılan genomik DNA (gDNA) (Örneğin, nos Cas9 (üzerinde X kromozomu), BL # 54591). Bir ispat okuma sıcak-başlangıç Taq DNA polimeraz enzimi uzun PCR uzantısı için uygun kullanın (bkz. Tablo malzeme). Sıra-doğrulayın.
  2. GRNA mühendislik odağı için yeniden hedefleme önlemek için yedek donör gRNA tanıma siteleri tanıtıldı eksojen sırası tarafından kesintiye şekilde tasarlayın.
    Not: sözde CIS düzenleyici elemanlarının değiştirmekten kaçının için her zaman kodlayıcı exon bölge içerisinde gRNA tanıma siteleri seçin.
  3. Bir yedek kaset oluşturmak için dört kesimleri birlikte katılmak için DNA derleme strateji planı: omurga (Örneğin, pUC19 veya diğer vektör 5' ve 3' Homoloji silah, orta eksojen transactivator DNA dizisi ve Doğrusallaştırılmış klonlama vektörel çizimler klonlama çok kullanılan). DNA derleme için üreticinin kılavuz takip (bkz. tablo malzemeler), PCR güçlendirme ve her parçanın montajı için uygun astar tasarım. 100 μM GKD2O. olun 10 mikron çalışma konsantrasyonu astar astar resuspend. Yüksek sadakat polimeraz PCR reaksiyonları için kullanın. Aşağıdaki iletişim kuralı uygulayın:
    1. PCR yükseltmek kullanılabilir bir vektör üzerinden Gal4 veya LexA ifade kaset (Örneğin, nls-LexA:p65; ideal Gal4/LexA/QF2 ifade plazmit bulundu ve Addgene gibi ortak kaynaklardan elde edilen) kullanarak tablo 1Badımında listelenen astar.
      1. Tüm orijinal transkripsiyon ve çoğu Yönetmeliği transactivator DNA dizisi ifade üzerinde değiştirilen exon korumak için böyle bir şekilde düzenlenmiş genomik alleli chimeric mRNA Hızlı Kaset tasarım, transactivator ve Gen. Tutkallama herhangi bir sinyal korumak için hedeflenen exon 5' ve 3' sonu korumak.
      2. Bir T2A kendi kendine sıyırmada peptid sırası arasında kalan 5' exon ve chimeric protein tercüme önlemek için transactivator sıra kodlama dahil. Çeviri kodonu eksojen transactivator sırası (Şekil 5) sonra ekleyin.
    2. PCR yükseltmek Homoloji silah enjeksiyon için seçilen üst sinek satırı çıkarılan genomik DNA (gDNA) (Örneğin, nos Cas9 (üzerinde X kromozomu), BL # 54591) tablo 1Badımında listelenen primerler kullanılarak. Yüksek sadakat polimeraz gibi sistemleri kullanarak tüm PCR reaksiyonları için kullanın: 5 x reaksiyon arabellek, 10 mM dNTPs 0.5 μL, 10 mikron 1,25 μL 5 μL ileri astar, 10 mikron 1,25 μL ters astar, şablon DNA, 0,25 μL High-Fidelity DNA polimeraz 0.5 μL , GKD2O. 16.25 μL
    3. Doğrusallaştırılmış klonlama vektör pUC19 gibi kullanın. Donör vektörel çizimler bir dizi artık kullanılabilir. Aşağıdaki Web sitesi-http://flycrispr.molbio.wisc.edu, kapsamlı bir listesine bakın.
    4. PCR ürünleri üzerinde % 1'özel jel çalıştırın. İstenmeyen belirsiz bantları (varsa) istenen grubun net bir ayrılık emin olmak yeterli süre Elektroforez gerçekleştirin. Jel-beklenen DNA parçalarının arındırmak. Konsantrasyon her saf DNA parçasının bir spektrofotometre kullanarak ölçmek.
    5. Üreticinin öğretim takip DNA derleme tepki kadar ayarla. Mix Doğrusallaştırılmış klonlama vektör ve hedef parçaları kimden adım 3 ve adım 4 aşağıdaki reaksiyon: 1 μL doğrusal, klonlama vektör (50 ng/μL), 2-3 kat fazla her hedef parçasının, 2 DNA derleme ana mix, x 10 μL getirmek son tepki birim GKD ile 20 μL < C21 > 2O. Incubate reaksiyon mix 1 saat 50 ° c
    6. Derleme ürünün 2 μL yetkili bakteri, plaka üzerinde 100 μg/mL ampisilin içeren LB/Amp ağar kaplamalar dönüşümü. Ayrıca, mavi/beyaz tarama için plaka üzerinde X-Gal + IPTG ekleyin.
    7. 3-4 beyaz kolonileri gecede inkübe plaka almak, 3 mL 100 μg/mL ampisilin içeren LB kolonisinde aşılamak ve geceleme bir shaker 37 ° C'de büyümek. Özü plazmid üretici takip plazmid mini hazırlık seti kullanarak bir gecede kültürlü bakterilerden el ile (bkz. Tablo malzeme).
    8. Ekran PCR veya kısıtlama sindirim tarafından olumlu koloni.
    9. Sıra son plazmid HDR donör bölgesi doğrulayın. Gelecekteki aşılama için-80 ° C'de % 20 gliserol doğru klonlar ile dönüştürülmüş bir bakteriyel hisse senedi kaydedin.

3. embriyo enjeksiyon, sinek genetik ve genom düzenlemek için tarama

  1. Yüksek hazırlamak saflık endotoksin-Alerjik gRNA ifade vektör yanı sıra bir plazmid maxiprep kullanarak HDR donör plazmid kiti ( Tablo malzemelerigörmek).
  2. GRNA ifade plazmid (100 ng/μL) ve yedek donör (500 ng/μL) Co nos-Cas9 embriyo6germline enjekte. Not: ticari servisine enjeksiyon için kullandığımız ancak bu yordamı laboratuvarda de gerçekleştirilebilir.
  3. Genetik ve tarama (Şekil 2 ve Şekil 3) fly:
    1. Ne zaman yetişkin enjekte embriyo geliştirmek, tek her G0 dengeleyici sinekler için uçar. Hedeflenen gen içeren kromozom için uygun dengeleyici seçin.
    2. Yavru her G0 üzerinden bir CO2 yastık üzerinde çapraz ve rasgele 10-20 erkek bir stereomicroscope altında almak F1 anestezi. Onları tek tek Şekil 3' te gösterilen dengeleyici kadın için çapraz.
    3. Ne zaman F2 larva kapağı her çapraz tek F1 babadan almak ve gDNA tek sinek genomik DNA hazırlık protokolü kullanarak ayıklayın:
      1. GDNA ayıklama arabellek hazırlamak: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, mağaza oda sıcaklığında. 20 mg/mL İndinavir K hisse senedi çözüm hazırlamak ve dondurucuda saklayın.
      2. Her sinek bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yerleştirmek ve tüp etiket. -80 ° C dondurucuya gecede devam et.
      3. GDNA ayıklama arabellek İndinavir K. 200 µg/mL son konsantrasyonu içeren çalışma hacmi çok taze hazırlamak
        Not: eski bir arabellek için bu adımı kullanmayın.
      4. Her sinek 10-15 s için arabellek sıvı dağıtımı olmadan squishing 50 μL içeren bir pipet ucu ile ezmek. Tüpün içine geri kalan arabellek dağıtmak ve iyice karıştırın. 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
      5. Tüpler 95 ° C ısı blok 1-2 dk İndinavir K. devre dışı bırakabilirsiniz için koymak
      6. Spin aşağı 10.000 x gde 5 min için. Daha fazla PCR analiz hazırlık-4 ° C'de depolayın.
  4. Üzerinden bir negatif kontrol hizmet veren bir nos-Cas9 sinek gDNA hazırlamak için aynı yöntemi kullanın. Dışarı doğru "biter" HDR (Şekil 2, Şekil 5) kullanarak tanımlamak için üç adımlı temel PCR ekranlar gerçekleştirmek her F1 erkek bir şablon5olarak gDNA. DNA hazırlık 1 μL aşağıdaki PCR reaksiyon sistemi kullanım: 2 PCR Master Mix Boya, her astar (10 mikron), DNA şablonunun 1 μL ve 7 μL GKD2O. 1 μL x 10 μL
  5. Şekil 5A' de gösterildiği PCR ekleme veya değiştirme varlığı için astar fwd1 ve Değişiklik1 için ekran kullanarak gerçekleştirmek; PCR ekleme veya değiştirme bölgesinden 3' doğrulamak için fwd2 ve rev2 primerler kullanılarak gerçekleştirmek; PCR "etraf-in" HDR (Tablo 1 c) kontrol etmek için astar M13F ve rev3 kullanarak gerçekleştirin.
  6. Sinek satırlarını teyit biter-out HDR ile tutmak ve F2 kuşaktan dengeli hisse senetleri kurmak. Yine diğer kromozom üzerinde herhangi bir istenmeyen mutasyonlar kaldırmak için dengeleyici sinekler için outcross.
  7. Yüksek kaliteli gDNA üzerinden kurulan hisse senetleri uzun PCR yükseltecek için hazırlamak (> 800-1000 nt) amplicon yüksek-sadakat Taq polimeraz ve tam sırası ile mühendislik genomik bölgelerden elde edilen amplicons doğrulayın. Alternatif olarak, ham gDNA özü açıklandığı gibi daha önce daha kısa yükseltmek için kullanın (< 800 nt), sıra Düzenlenmiş genom doğrulamak için PCR ürünleri örtüşen. Kaliteli Drosophila genomik DNA hazırlamak için aşağıdaki iletişim kuralı kullanın:
    1. 1.5 mL microcentrifuge tüp 25 yetişkin sinekli hakkında koymak ve en az 1 saat-20 ° C veya-80 ° C dondurucuda dondurma.
    2. Çözüm A 250 μL ekleyin (pH 9.0 Tris HCl 0.1 M, EDTA 0.1 M, SDS % 1).
    3. Homojenizasyon dibekler microcentrifuge tüplerde kullanarak sinekler homojenize ve tüp buza koy.
    4. 70 ° c 30 dk için kuluçkaya.
    5. 35 KOAc (5 M) μL, sallamak, iyi ekleyip karıştırın, ama yapmak değil girdap.
    6. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    7. 12.000 x g 15dk için de spin.
    8. 1 mL micropipette ile dikkatli bir şekilde sadece açık süpernatant geri herhangi bir çökelti bırakarak yeni bir tüp için transfer veya Interphase.
    9. İsopropanol 150 μL süpernatant için ekleyin. INVERSION tarafından karışımı yavaşça.
    10. 10.000 x g 5 min için de spin.
    11. Dikkatle süpernatant kaldırır ve Pelet tüp içinde bırakır.
    12. Pelet 1 mL % 70 ile yıkayın alkol.
    13. 12.000 x g 5 min için de spin.
    14. Süpernatant kaldırın. Hava kuru Pelet 15-20 dk için. Üzerinde Pelet kuru değil.
    15. GKD2O. 100 μL Pelet dağıtılması
    16. Yüksek sadakat DNA polimeraz uzun amplicon için uygun kullanın (> 800 bp) tam düzenlenen bölge yükseltmek için. İdeal olarak, iki astar genomik bölge yükseltmek için eklenen kaset dışında al. Jel PCR ürünü arındırmak ve daha önce açıklandığı gibi sıra ürün birden çok örtüşen astar ile doğrulayın.
  8. Disseke dokular/embriyo mühendislik sinek satır doğru kronolojik zamanmekansal ifade desenlerini doğrula:
    1. RT-PCR hibrid mRNA ürün (Tablo 1 d) ifade doğrulamak için toplam RNA gerçekleştirin.
    2. MRNA ürün larva dokular/ifade doğrulamak için embriyo ilgi bir in situ hibridizasyon gerçekleştirin.
    3. LexO- GFP veya LexO- RFP (için ile ikili ifade driver için doğru doku özgü kronolojik zamanmekansal ifade desenleri sıra doğrulanmış biter-out satırları arasında çapraz için düzenlenen satırlarının her birindeki ekran için elde LexA sürücü) (Bloomington hisse senedi merkezlerinden temin edilir) satır ve LexA veya floresan mikroskop altında embriyo, larva ve yetişkin dokularda muhabir-gen ekspresyonu tahrik Gal4 uyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı başarıyla hedeflenen ikili ifade muhabir sistem belirli hücreleri5ifade bnl için bir oluşturmak için kullanılan. BDT-karmaşık kronolojik zamanmekansal bnl ifade kontrol düzenleyici elemanlarının (CREs) değil karakterize. Bu nedenle, kronolojik zamanmekansal ifade endojen bnl Düzenleyici sıralı denetim altında elde etmek için yalnızca ilk kodlama exon bnl , bakteriyel LexA transactivator sıra i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, Drosophila artırıcı tuzakları iki farklı yöntemlerle üretilen. Bir yolu bir sürücü rasgele yerleştirilmesi içerir (örneğin., Gal4) genom tarafından devralınmasına sırayla (e.g., P-eleman transpozisyonu)1 . Alternatif olarak, sürücü dizileri sonra genom3,11ektopik bir siteye entegre bir plazmid yapısında bir sözde artırıcı/organizatörü bölgesinin transkripsiyon kontrolü altında yerleştirilebilir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. F. liman, Dr. K. O'Connor-Giles ve Dr. S. Feng CRISPR strateji üzerine tartışmalar için teşekkürler; Dr. T.B. Kornberg ve reaktifler Bloomington stok merkezi; UMD görüntüleme çekirdek tesis; ve NIH finansman: R00HL114867 ve R35GM124878 SR.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218klonlama
LB-AgarBD, DifcoBD  244520klonlama
Tris-HClSigma AldrichT3253Moleküler Biyoloji
EDTASigma AldrichE1161Moleküler Biyoloji
NaClSigma AldrichS7653Moleküler Biyoloji
UltraPure DNase/RNaz İçermeyen SuThermoFisher Scientific10977-023Moleküler Biyoloji
%10 SDSSigma Aldrich71736Moleküler Biyoloji
KOAcFisher-ScientificP1190Moleküler Biyoloji
EtOHFisher-Scientific04-355-451Moleküler Biyoloji
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plazmid Maxipep kitleriThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539SRestriksiyon enzimi
PrimerleriIDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabDNA şablonu ve gRNA için vektör
KAPA HiFi Sıcak Başlangıç- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-yüksek sadakat TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611DNA montajı
pBPnlsLexA:p65UwLexA amplifikasyonuAddgene
Proteinaz KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, boya ile (kırmızı)SydlabMB067-EQ2RMoleküler Biyoloji
Jel elüsyon kitiZymo Research (Genesee Scientific)11-300Moleküler Biyoloji
TRI reaktifiSigma-AldrichMoleküler Biyoloji
Direct-zol RNA saflaştırma kitleriZymo Research (Genesee Scientific)11-330Moleküler Biyoloji
OneTaq Tek Adımlı RT-PCR KitiNEBE5315SMoleküler Biyoloji
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly hattı
UAS-CD8:GFPKornberg laboratuvarıUçuş hattı
btl-Gal4Kornberg laboratuvarıUçuş hattı
MKRS/TB6BKornberg laboratuvarıSinek
hattı Konfokal Mikroskop SP5XLeicaGörüntüleme ifade modeli
CO2 istasyonuGenesee Scientific59-122WCUsinek itme
Stereo mikroskopOlympusSZ-61sinek itme
Mikrotüp homojenleştirici tokmaklarFisher-Scientific03-421-217genomik DNA izolasyonu
NanoDrop spektrofotometresiThermoFisher ScientificND-1000DNA miktar tayini
,, , için DNA şablonu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), 31.2.1-20 (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9kili Transkripsiyon SistemiDokuya zg EkspresyonDrosophila Genom D zenlemeHomolojiye Dayal Onar mRehber RNA Tasar mTransaktivat r Knock inEkzon De i imiSpasyotemporal Reg lasyonGAL4 LexA Sistemi

İlgili makaleler