Method Article

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea limbal epitel kök hücreler (LESCs) sürekli yenileyerek kornea epitel ve böylece kornea homeostazı ve görsel netlik sağlamak için sorumludur. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş LESCs kornea hücre replasman tedavisi için umut verici bir hücre kaynağı sağlamak. Tanımsız, xenogeneic kültür ve farklılaşma koşulları araştırma sonuçlarında değişim neden ve hPSC elde edilen tedavi klinik tercümesi engel. Bu iletişim kuralı için hPSC-LESC farklılaşma xeno - ve besleyici boş hücre koşullar altında tekrarlanabilir ve verimli bir yöntem sağlar. İlk olarak, rekombinant laminin-521 (LN-521) ve tanımlanmış hPSC orta farklılaşmamış hPSC kültürünün monolayer saptamaları için yüksek kaliteli başlangıç malzemesi sağlam üretimi için bir temel olarak hizmet vermektedir. İkinci olarak, hızlı ve basit hPSC LESC ayırt etme yöntemi sadece 24 gün içinde LESC örneğin alınma olasılığını verir. Bu yöntem bir dört gün yüzey ektodermal indüksiyon LN-521/kollajen IV kombinasyonu matris tanımlanmış kornea epitel farklılaşma orta yapisan kültür aşaması gelir küçük molekülleri ile süspansiyon dahil eder. Cryostoring ve genişletilmiş farklılaşma daha fazla hücre nüfus arındırır ve bankacılık hücre hücre terapi ürünleri için büyük miktarlarda sağlar. Elde edilen yüksek kalite hPSC-LESCs limbal kök hücre eksikliği (LSCD) tedavisinde kornea yüzey yeniden inşası için potansiyel bir roman tedavi stratejisi sağlayabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oküler yüzeyde saydam kornea retina girmek ışık ve gözün refraktif güç çoğunluğu sağlar. En dış katmanı, tabakalı kornea epitel sürekli limbal epitel kök hücreleri (LESCs) tarafından yeniden oluşturulur. LESCs corneoscleral kavşak1,2limbal nişler bazal tabaka yer alır. Kendi kimlik bir dizi sözde işaretleri daha kapsamlı bir analiz gerektirir böylece LESCs özel ve benzersiz işaretleri, eksikliği. Epitel transkripsiyon faktörü p63 ve özellikle N-ölümcül kesilmiş transkript p63 Alfa izoformu (ΔNp63α), bir ilgili olumlu LESC işaret3,4önerdi. Asimetrik Ana....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tampere Üniversitesi Ulusal insan embriyosu üzerinde araştırma yapmak için yetki Medicolegal işleri Finlandiya (Dnro 1426/32/300/05) onayı vardır. Enstitü aynı zamanda Etik Komitesi: Pirkanmaa hastane bölgesinin, kültür, türetme yapıp yapmayacağınızı ve hESC satırları (Skottman/R05116) ayırt etmek ve hiPSC satırları oftalmik araştırma (Skottman/R14023) kullanmak için destekleyici ifadeleri var. Yeni hücre satır bu çalışma için elde edilmiştir.

Not: açıklanan protokolü belirli, piyasada bulunan hPSC ve kornea epitel farklılaşma medya dayanmaktadır. Tablo malzemeleri üretici/tedarikçi bilgi ve Katalog numaraları için başvurun....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPSC-LESCs için hPSCs

FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs için farklılaşma inducing üzerinden tüm süreç yaklaşık 3,5 hafta sürer. Şekil 1A' onun anahtar adımlar vurgulayarak farklılaşma yönteminin şematik genel bakış sunulur. Şekil 1B hücre nüfusun tipik türleri morfoloji protokol farklı aşamalarında gösterir. Sunulan veri Regea08/017 hESC çizgi ile UTA.04607.WT hiPSC çizgi, h.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beklenen bu iletişim kuralı başarılı ve sağlam nesil LESCs FF hPSC bir tek hücre süspansiyon üzerinden yaklaşık 3,5 hafta içinde sonucudur. Kornea epitel yüzey ektoderm29geliştirir Protokolü'nün ilk adım hPSCs bu soy doğru direksiyon amaçlamaktadır. Dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β) antagonisti SB-505124 ve bFGF ile bir kısa 24 h indüksiyon ektodermal farklılaşma, 48 h Mezodermal BMP-4 isteka yüzey ektoderm karşı hücreleri itmek için ardından ikna etmek için kullanılır. Col IV/LN-521 kombinas.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma Finlandiya (grant numarası 297886) Akademisi, insan yedek parça programı Tèkèsī, Fince finansman ajansı tarafından teknoloji ve yenilik, desteklenmiştir Fin göz ve doku Bankası Vakfı ve Fin Kültür Vakfı. Yazarlar Biyomedikal Laboratuar teknisyenleri bozuştuk Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt ve sonunda Heikkilä mükemmel teknik yardım ve hücre kültürü katkısı için teşekkür ederiz. Profesör Katriina Aalto-Setälä kullanılan hiPSC hattı ve BioMediTech Imaging Core tesisi ekipman floresans görüntüleme için sağlamak için sağlamak için kabul edilmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

strong>CommentsEquipment

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Malzeme/Reaktif
Ca2+ ve Mg2+Gibcoiçeren 091x DPBS#14040-091
Ca2+ ve Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm hücre kültürü kabıCorning CellBIND#3296Yapışık hPSC-LESC için kültür kabı formatı farklılaşma
12 oyuklu plakaCorning CellBIND#3336IF numuneleri için kültür kabı formatı
24 oyuklu plakaCorning CellBIND#3337IF numuneleri için kültür kabı formatı
2-merkaptoetanolGibco#31350-010
6 oyuklu plaka, Ultra Düşük bağlantıCorning Costar#3471Süspansiyonda indüksiyon için kültür kabı formatı kültür
Alexa Fluor 488 anti-fare IgThermoFisher Scientific#A-21202ikincil antikor
Alexa Fluor 568 anti-keçi IgThermoFisher Scientific#A-11057için ikincil antikor
#A-10037IF
Basic fibroblast büyüme faktörü (bFGF, insan)Inc.#AF-100-18BHayvansız Rekombinant İnsan FGF-basic (154 AA)
BD Cytofix/Cytoperm Fiksasyon/Geçirgenleştirme SolüsyonuBD Biosciences#554722Akış sitometrisi için fiksasyon ve geçirgenleştirme solüsyonu
BD Perm/Yıkama TamponuBD Biosciences#554723Akış sitometrisi için yıkama tamponu
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Kemik morfogenetik proteini 4 (BMP-4)PeproTech Inc.# 120-05A
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Sitokeratin 12 antikoruSanta Cruz Biotechnology#SC-17099için birincil antikor
R& D Systems#MAB3164Cytokeratin
15 antikoruThermoFisher Scientific#MS-1068-Piçin birincil antikor
CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Yapışık hPSC-LESC farklılaşması için kültür ortamı
Kollajen tip IV (insan)Sigma-Aldrich#C5533İnsan plasental kollajen tip IV
CoolCell LX Dondurma KabıSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure tüplerSarsted# 72.380hPSC-LESC kriyoprezervasyon için 1.6 mL kriyotüp
Tanımlanmış Tripsin İnhibitörüGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biyolamina#Ln521İnsan rekombinant laminin 521
ve Delta; Np63 ve alfa; antikorBioCare Medical# 4892
OCT3 / 4 antikoru için birincil antikorR& D Sistemleri#AF1759için birincil antikor
; antikorHücre Sinyal Teknolojisi#ACI3066Aiçin birincil antikor
; (D2K8X) XP Tavşan mAb (PE Konjugat)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi# 56687p63-α Akış sitometrisi için PE konjuge antikor
PAX6 antikoruSigma-Aldrich#HPA030775IF
Penisilin / StreptomisinLonza# 17-602E
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich# 158127DAPI
Thermo Fisher Scientificile IF ProLong Gold Antifade Mountant#P36931Sert için DAPI mountant IF
PSC KriyoprezervasyonKiti Thermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzimGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' için montaj s değiştirilmiş Kartal' s ortaGibco# 10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco# 10828028
MEM esansiyel olmayan amino asitlerGibco# 11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787için geçirgenleştirme ajanı
#H IF
Cytocentrifuge, örn.<> CellSpin IITharmac
için sıvı montaj için DAPI mountantAkış sitometresi, örneğin BD Accuri C6BD Biosciences
Floresan mikroskobu, örn.Olympus IX 51Olympus
olmadan 1x DPBS IF Alexa Fluor 488 anti-tavşan Ig ThermoFisher Scientific#A-21206 için IF için ikincil antikor IF Alexa Fluor 568 anti-fare Ig ThermoFisher Scientific için ikincil antikorPeproTech IF Cytokeratin 14 antikoru IF için birincil antikor IF CnT-30 IF IF p63 ve alfa IF p63-&alfa için birincil antikor için hücre sabitleyici IF VectaShield Vektör Laboratuvarları Namestrong>

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles