Yöntem makalesi

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

DOI:

10.3791/58310

⸱

9 Kasım 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVs) birçok biyolojik işlevleri fizyolojik ve patolojik durumları sırasında sinyal önemli rol oynamaktadır yeni keşfedilen hücre altı bileşenleridir. EVs yalıtım her tekniği için iç kısıtlamaları nedeniyle bu alanda büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yoğunluk gradient Santrifüjü yöntemi ile fark ultrasantrifüj yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır ve EV yalıtım için altın standart prosedür olarak kabul edilir. Ancak, bu yordam zaman alan, emek yoğun ve genellikle küçük hacimli örnekleri bronchoalveolar lavaj sıvı gibi için uygun olmayabilir düşük ölçeklenebilirlik sonuçlanır. Biz bir Ultrafiltrasyon Santrifüjü yalıtım yöntemi basit ve zaman ve emek verimli henüz bir yüksek kurtarma verim ve saflık sağlar göstermek. Önerdiğimiz bu yalıtım yöntemini EV yalıtımı, küçük hacimli biyolojik örnekler için özellikle uygun olan alternatif bir yaklaşım olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes EVs, 50-200 nm çapında, en küçük alt kümesini ve işlemleri1,2,3,4,5sinyal çeşitli bir dizi birden çok biyolojik işlevleri yoktur. Öncelikle kargo moleküller gibi yağlar, proteinler ve nükleik asitler6,7,8,9 aracılığıyla hücreler arası iletişim kolaylaştırarak cep ve doku homeostazı yöneten . Bir kritik adım EV araştırma yalıtım işlemidir. Fark ultrasantrifüj (UC), ile ya da ezelî yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC), altın standart yaklaşım olarak kabul edilmektedir, ancak bu yöntem verimsiz EV kurtarma oranları ve düşük ölçeklenebilirlik10 da dahil olmak üzere büyük sınırlamalar taşır , 11 , 12, bu hücre kültür süpernatant veya yüksek eksozom üretim örnekleri gibi daha büyük ses örnekleri kendi en iyi kullanımı kısıtlamak. Avantajları ve dezavantajları boyutu dışlama Ultrafiltrasyon veya kromatografi, immunoaffinity yalıtım boncuk veya sütun ve havacilik, tarafından gibi diğer yöntemlerini de açıklanmıştır ve modern ek prosedür için geliştirilmiştir üstesinden gelmek ve her yaklaşım11,12,13,14,15dakika sonra teknik sınırlamalar en aza indirmek. Diğerleri nanoporous membran filtre birimi ile Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) UC yöntemi16,17,18karşılaştırılabilir saflık sağlar alternatif bir teknik olduğunu göstermiştir. Bu teknik bir alternatif izolasyon yöntemleri olarak düşünülebilir.

Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) çok sayıda Biyolojik işlevleri çeşitli solunum koşulları19,20,21,22sahip EVs içerir. BALF türetilmiş EVs gerektirdiği bazı zorluklar nedeniyle insanlar bronkoskopi yordamda yanı sıra lavaj sıvı kurtarma sınırlı bir miktarda invasiveness okuyor. Hayvanlarda küçük laboratuvar fareler gibi sadece bir kaç mililitre normal akciğer koşullarında elde edilebilir, iltihaplı veya fibrotik akciğerler23yılında daha az bile. Sonuç olarak, karşıdan akış uygulamaları için bir fark ultrasantrifüj tarafından BALF yeterli miktarda EV yalıtım için toplama mümkün olmayabilir. Ancak, doğru EV nüfus yalıtma EV biyolojik fonksiyonlar çalışmak için çok önemli bir faktördür. Verimliliği ve etkinliği arasındaki hassas dengeyi köklü EV yalıtım yöntemleri bir sorun olmaya devam etmektedir.

Bu çalışmada bir 100 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) nanomembrane filtre ünitesi, kullanan bir santrifüj Ultrafiltrasyon yaklaşım BALF gibi küçük hacimli biyolojik örnek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu teknik basit, etkili ve yüksek saflıkta ve BALF elde edilen EVs çalışma desteklemek için ölçeklenebilirlik sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlar kullanımı ve tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Cedars-Sinai Tıp Merkezi (CSMC) tarafından kabul edildi.

1. fare Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) toplama ve hazırlık

  1. BALF koleksiyonu
    1. Ketamin (300 mg/kg) ve xylazine (30 mg/kg) servikal çıkığı tarafından takip mayi rota üzerinden bir kokteyl ile fareler ötenazi.
    2. 22 G angiocatheter nefes borusu yerleştirin. 1 mL (mL) buz gibi steril Dulbecco'nın fosfat tampon salin (DPBS) içeren bir insülin şırıngayı takın ve DBPS 1 mL angiocatheter aracılığıyla her iki ciğerlerine aşılamak.
    3. Yavaş yavaş BALF alıp BALF 50 mL konik tüp içine dağıtmak için şırınga pistonu geri alıyorum. BALF buz üzerinde tutun.
    4. 1.1.2 1.1.3 aygıtlarından 3 x (her fare toplamda 4 x).
      Not: Yaklaşık 0.8 mL genellikle korumak mililitre alınır. Ayrıca, aşağıdaki adımları tek tek fareler için (yani, BALF 3 mL) gerçekleştirilir, ancak birden fazla BALF örnekleri havuzu EVs daha büyük bir toplu işlem tutarlılık için yalıtım aşağı akım deneylerde izin verir.
  2. BALF hazırlık
    1. BALF 25 fareler havuz ve iki eşit kümeye (aliquot başına ~ 35 mL) bölün.
    2. BALF, 400 x g, 5 min için 4 ° C'de hücreler ve diğer hücresel enkaz kaldırmak ve süpernatant toplamak için santrifüj kapasitesi.
    3. Hücre artıkları kaldırmak için süpernatant 1.500 x g, 10 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi. Süpernatant toplamak ve EV yalıtım adımlarla devam edin.

2. izolasyon üzerinden fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller

Not: Bu çalışmada, iki EV yalıtım teknikleri, yani UFC ve ultrasantrifüj batmaz ile EVs BALF dan izole etmek için kullanılır. Her yöntemin detaylı Protokolü aşağıda açıklanmıştır.

  1. Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) zenginleştirme yöntemi
    Not: Bu yöntem yukarıda açıklanan protokol10' dan güncellenmiştir.
    1. Süpernatant adım 1.2.3 0,2 mikron steril enjektör filtre ile filtre ve filtre uygulanmış BALF buz üzerinde tutun.
      Not: Bu sayede bir boyutu dışlama adım olduğunu sadece 200 daha küçük veziküller nm toplanır.
    2. DPBS atmak için 100 kDa MWCO santrifüj filtre ünitesi steril DPBS 10 dakika santrifüj 1.500 x g santrifüj birimi 4 ° C'de 10 dakika süreyle ile equilibrate.
      Dikkat: bir kez içinde belgili tanımlık süzgeç aygıt membran DPBS ile equilibrated, membran cihaz kullanılır kadar tüm zaman ıslak tutulması gerekir.
    3. Filtre ünitesi BALF örnek adım 2.1.1 15 mL ile doldurup 4 ° C'de 30 dk 3000 x g, santrifüj Akış yoluyla BALF atılır veya ayrı bir kanonik tüpüne toplanan ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.
    4. 2.1.3 kalan 0.2 µm filtre BALF için yineleyin.
      Not: Bu centrifugations yeterince konsantre BALF EVs 35 mL orijinal başlangıç hacmi üzerinden üç tekrar aldı. Bu 1-1.5 mL retentate sonuçlandı.
    5. 14 mL steril DPBS ile retentate bir hafifçe hkr pipetting tarafından yıkayın. Filtre ünitesi 4 ° c 30 dk, 3000 x g, santrifüj kapasitesi DPBS kaldırmak için ve EV retentate konsantre.
    6. Konsantre BALF kaynaklı EVs filtre aygıttan bir pipettor cihazın alt tarafına filtre ekleme ve toplam malın güvenliğini garantiye almak için bir yan yana süpürme hareket kullanan örnek çekilmesi toplamak.
    7. Aliquot BALF elde edilen EVs ve-80 ° c daha fazla parçacık miktar ve karakterizasyonu (bkz. Adım 3) için saklayabilirsiniz.
  2. Ultrasantrifüj (UC) batmaz yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC) ile
    Not: Aşağıdaki Protokolü yukarıda açıklanan protokol24güncellenmiştir.
    1. Süpernatant 2.1.1 adımından 37-mL ultracentrifuge tüp içine aktarmak ve 10.000 x g ultracentrifuge kullanarak 4 ° C'de 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve santrifüj 60 dk 4 ° C'de 100.000 x g de toplamak. EV granül centrifuged iken, batmaz yoğunluk gradient arabellekleri (Tablo 1) farklı konsantrasyonlarda 2.2.3 adım için hazır olun.
    2. Süpernatant atın ve EV granül DPBS 200 μL içinde resuspend.
    3. EV süspansiyon % 50 iodixanol çalışma çözüm (Tablo 1) 300 μL ile karıştırın ve 15 mL ultracentrifuge tüp için transfer. % 50 iodixanol-EV karışımı süspansiyon üzerine sırayla aşağıdaki arabellek çözüm alt sırada üst katman: % 30 iodixanol (4.5 mL), iodixanol (3 mL), % 15 iodixanol (2.5 mL) ve % 5 iodixanol (6 mL) % 25. Santrifüj 230 min için 4 ° C'de 100.000 x g de.
      Not: Batmaz yoğunluk gradient iodixanol alt üst en düşük konsantrasyon (% 5) için en yüksek konsantrasyon (% 50) ile ölçekleme yüzdesini temel alır. İodixanol farklı konsantrasyonlarda üretmek için homojenizasyon Orta (Tablo 1) çeşitli miktarlarda çalışma çözüm (% 50 iodixanol) ile karıştırıldı.
    4. % 15 ve % 25 kesir toplamak ve onları steril DPBS 15 mL birime konuyu sulandırmak. Onları yeni küçük ultracentrifuge tüp ve santrifüj 60 dk 4 ° C'de 100.000 x g de aktarın.
    5. Süpernatant atın ve daha fazla karakterizasyonu için steril DPBS 50 μL EV granül resuspend.

3. hücre dışı vezikül miktar

Not: BALF kaynaklı EVs kurtarma verim ile iki ölçüm quantitated.

  1. Nanopartikül analiz (NTA) ölçüm izleme
    1. EV örnek 1: 200, seyreltik-1:500 DPBS ve yük örnek bir insülin şırınga içine 1 ml. Bir şırınga pompa için bir örnek şırınga ekleyin ve ( Tablo malzemelerigörmek) partikül sayıları ve boyutunu ölçmek başlar.
    2. Kamera düzey 1 tüm örnek ölçümler için 14 ve algılama eşik olarak ayarlamak. Beş tekrarlayan ölçümler 30 1.500 çerçevelerle s 20 bir gecikmeyle her örnek için doğru kaydedildi s okuma arasında. Birleştirmek ve veri son konsantrasyon ve boyutu raporları için Ortalama.
      Not: doğru tüm parçacıkların yakalamak için kamera düzeyini tüm parçacıklar görselleştirmek ve her denemede tüm örnek ölçümler için benzer ayarları kullanmak uygun olarak ayarlayın.
  2. Protein miktar
    Not: Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil BALF kaynaklı EVs protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanıldı.
    1. 1 x lizis arabellek EV örnekleri solubilize.
    2. BALF türetilmiş EVs Renkölçer algılama 560 absorbans ölçerek BCA standart iletişim kuralı'nı başına protein miktarını ölçmek nm bir plaka okuyucu.

4. hücre dışı veziküller BALF kaynaklı tespiti

Not: SDS-sayfa ve immunoblotting ve Akış Sitometresi Analizi ile EV iyileşme doğrulamak için yaygın olarak bilinen eksozom yüzey marker proteinleri (TSG101, CD63, CD81 ve CD9) kullanılmıştır.

  1. SDS-sayfa ve immunoblotting
    1. EV proteinler her örneğinin eşit miktarda bir arabellek (Lityum Lauryl Sülfat) ve 50 mM dithiothreitol (DTT) bir 1.6 mL tüp takılması kurutma ile geçiyoruz. Örnekleri 10 dk 70 ° C'de ısı.
    2. 4 – %12 artı Bis-Tris akrilamid jel içine adım 4.1.1 örnekleri yüklemek ve Elektroforez çalıştırın (150 volt, 35 mA) 35 dk için.
    3. Proteinler bir kuru aktarım yöntemini kullanarak bir nitroselüloz membran aktarın.
    4. Membran 60 dk, oda sıcaklığında (RT) sallanan için %5 yağsız süt ile engelleyin.
    5. Membran bir EV yüzey proteini işaretleyici, tümör duyarlılık Gene 101 (TSG101), bir antikor ile %5 BSA içinde Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ara-20 (TBST) bir gecede sallanan 4 ° C'de 1:500 seyreltme, kuluçkaya.
    6. Ertesi gün, membran 3 yıkama x, 10 her, TBST arabellekte yıkama ve anti-tavşan IgG, 1:5,000 seyreltme için 60 dk RT. az, HRP bağlantılı bir antikor ile kuluçkaya min
    7. Membran 3 yıkama x, 10 min her yıkama, TBST bir arabellek. Membran chemiluminescent HRP antikor algılama reaktif ve görüntü ( Malzemeler tablo görmek için görüntüleme sistemi) ile geliştirmek.
  2. Akış Sitometresi
    1. BALF türetilmiş EVs 49 μL arabellek (PBS + 5 mM EDTA + 0,1 mikron şırınga filtre membran filtre % 0.5 BSA) boyama PEB içinde sulandırmak.
    2. Her birine tek tek her örnek içine aşağıdaki antikorlar ekleyin: 1) fare Anti-fare PE CD63 antikor (100 ng tepki başına); 2) fare Anti-fare PE CD81 (500 ng); 3) fare Anti-fare FITC CD9 (200 ng). Karanlıkta 60 dk için sallanan 4 ° C'de kuluçkaya.
    3. Membran filtre PEB arabellek boyama 450 μL örnekleriyle sulandırmak ve örnekleri Akış Sitometresi Analizi için konu (bakınız Tablo reçetesi)25.
    4. Akış Sitometresi ayarları aşağıdaki gibi yapın: 1) hiper günlüğü (hlog); tüm kanalları ayarlayın 2) kümesi SSC tetiğe 4; 3) ikincil tetikten uzak açınız. Düşük hızlı ayarlarında örnekleri çalıştığını ve her örnek içinde en az 10,000 olayları elde etmek.
    5. Her örnek analiz yazılımı kullanarak düşük sitometresi veri çözümlemesi gerçekleştir ( Tablo malzemelerigörmek).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare BALF EV yalıtım gerçekleştirilen aynı gün UFC ve UC-DGC izolasyon yöntemleri kullanarak. UC-DGC tekniği, uzun işlem süresi 8 h gerekli ise UFC yöntemi yaklaşık 2,5-3 h, gerekli. Bu arabellekleri ve reaktif hazırlama süresi içermiyordu. Bu bazı diğer görevler uzun aralıklarla dönemlerde yerine olabilir unutulmamalıdır. Yine de, Bütün prosedür UC-DGC yalıtım tekniği için neredeyse bir gün sürdü.

BALF türetilmiş EVs normal far...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl içinde bilim adamları EVs anlamlar içinde hücresel homeostazı sökülmüş. Daha da önemlisi, EVs önemli rolleri birçok hastalığı süreçlerinde onların biyoaktif kargo molekülleri1,21,22,26,27 ile komşu ve uzak hücreleri oransal olarak oynamak , 28 , 29 ,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İş NHLBI/NIH hibe HL103868 (PC) ve HL137076 (PC için) Amerikan Kalp Derneği Grant-in-Aid (PC için) ve Samuel Oschin kapsamlı Kanser Enstitüsü (SOCCI) akciğer kanser araştırma Ödülü (için PC) tarafından desteklenmektedir. Smidt Kalp Enstitüsü Nanosight makine EV nanopartikül izleme çözümlemesi için bize sağlar Cedars-Sinai Tıp Merkezi için bizim büyük takdir ifade etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme< / güçlü >
Amicon Ultra-15 santrifüj filtreler Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SükrozSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESAraştırma Ürünleri Uluslararası, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
Sodyum KlorürSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Yoğunluk Gradyan Orta
KetaminVetOne, Boise, ID13985-702-10
KsilazinAkorn Hayvan Sağlığı, Göl Ormanı, IL59399-110-20
Şırınga 1 mLBD Şırınga, Franklin Lakes, NJ309656
Anjiyokateter 20 GBD Şırınga, Franklin Lakes, NJ381703
Santrifüj tüpleri 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Santrifüj tüpleri 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Bikinkonik asit (BCA) protein tahliliPierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Tavşan anti-fare TSG101 AntikorAbCam, Cambridge, MAAB125011
Sıçan anti-fare PE-CD63 AntikorBiolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı antikorHücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x İndirgeyici ajan (Cıvata)
10x Lizis tamponu (Cıvata)Hücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA
Bolt %4-12 Bis-Tris Plus akrilamid jelInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Nitroselüloz mini yığınlarInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Kemilüminesan HRP antikor tespit reaktifi HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Ultrasantrifüj tüpleri 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Ultrasantrifüj tüpleri 38.5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA Şırınga Filtreleri 0.2 ve mikro; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
SantrifüjEppendorf, Hamburg,Almanya-Ultrasantrifüj
Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire,İngiltere-Partikülboyutu dağılımını ölçmek ve partikül konsantrasyonu
MACSQuant Analizörü 10 akış sitometresiMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Almanya-iBlot
Transfer AparatıThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Görüntüleme SistemiBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Analiz yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ultrasantrif jasyon Yo unluk GradyanEV zolasyonuPar ac k zleme AnaliziAk SitometrisiWestern BlotCD63 CD9 CD81Murin BAL S v s

İlgili makaleler