Yöntem makalesi

C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi

DOI:

10.3791/58339

⸱

22 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir görüntüleme tabanlı yöntemi anlatılan S fazlı tanımlamak ve timidin kullanarak C. elegans hermafrodit germline hücre döngüsü dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir analog EdU. Bu yöntem yok transgenes gerektirir ve immünfloresan boyama ile uyumludur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotlarda hücre döngüsü analizi sık kromozom morfolojisi, ifade ve/veya hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında veya nükleozit analogları ve eklenmesi için gereken gene ürünlerin yerelleştirme kullanır. S-aşamasında DNA polimerazlar timidin analogları EdU veya BrdU gibi kromozom DNA analizi için hücreleri işaretleme, dahil. C. elegans, nükleozit analog EdU için solucanlar sırasında düzenli kültür besleniyor ve immünfloresan teknikleri ile uyumludur. C. elegans germline, şeffaf, genetik olarak facile, çünkü bu ve segregasyonun profaz ve hücresel farklılaşma/gametogenesis ortaya çıkan yollar, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü sinyal bir güçlü modeli etütler sistemdir bir Doğrusal derleme gibi moda. Bu özellikler EdU mitotically Bisiklete binme hücreleri ve germline geliştirme dinamik özellikleri çalışma için harika bir araç olun. Bu iletişim kuralı başarıyla EdU bakteri hazırlamak, onları vahşi-türü için yem açıklar C. elegans Hünsa, hermafrodit erbezi incelemek, EdU birleşme için içine DNA, leke leke çeşitli hücre döngüsü algılamak için antikorlar ile ve gelişimsel işaretleri, erbezi görüntü ve sonuçları çözümleyebilirsiniz. Protokol yöntemi ve S-faz Dizin, M-faz Dizin, G2 süresi, hücre döngüsü süresi, segregasyonun giriş oranı ve segregasyonun profaz progresyon oranı ölçümü için analysis değişimler açıklar. Bu yöntem hücre döngüsü veya hücre tarihinin diğer dokulara, aşamaları, genetik arka planlar ve fizyolojik şartlarda çalışmaya adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan gelişmede, yüzlerce, binlerce, milyonlarca, milyarlarca veya hatta trilyonlarca hücre bölünmeler yetişkin organizma oluşturmak için gereklidir. Hücre döngüsü, G1 hücresel olaylar kümesi oluşur (gap), S (sentez), G2 (gap) ve M (mitoz) tanımlayan bir dizi olaylar yürütülen her hücre bölünmesi. Hücre döngüsü dinamik ve teknik olarak zor olabilir gerçek zamanlı olarak en iyi takdir. Bu protokol için sunulan teknikleri aşamaları ölçümleri ve hareketsiz görüntüler üzerinden hücre döngüsünün zamanlama yapmak izin.

5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) veya 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) gibi nükleozit analogları ile etiketleme S-faz hücre döngüsü dynamics Caenorhabditis elegans (C. elegans) Yetişkin çalışmalarda tanımlamak için altın standart olduğunu hermafrodit germline1,2,3,4,5. Onlar herhangi bir genetik yapı üzerinde güvenmeyin gibi EdU ve BrdU neredeyse herhangi bir genetik arka planda kullanılabilir. BrdU görüntülenmesi için sık sık işbirliği ile ek antikor boyama tarafından görüntülenmiştir diğer hücresel işaretleri değerlendirilmesi ile uyumsuz olan anti-BrdU antikor boyama, antijen ortaya çıkarmak için sert kimyasal tedavi gerektirir. Buna karşılık, EdU görselleştirme hafif koşullar altında tıklayın Kimya tarafından oluşur ve böylece ortak6,7boyama antikor ile uyumludur.

Çekirdek sadece timidin (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analogları DNA'ya S-aşamasında dahil beri etiket özgüllük açıktır. Görselleştirme sabit dokusunda yer alır. EdU etiket başına bir azid içeren boya kadar görünmez veya fluorophore kovalent bakır katalize tıklayın Kimya8tarafından EdU, alkin ile tepki verir. EdU etiketleme çekirdeği maddelerinin etiketlenmesi kısa bir darbe kullanarak S-aşamasında olduğunuz hemen bilgi sağlayabilir. EdU da nabız-chase veya sürekli etiketleme kullanarak dinamik bilgi sağlayabilir; Örneğin, bir darbe-chase deneyinde etiket her hücre bölünmesi seyreltilmiş veya olarak nondividing hücreleri ilerleme geliştirilmesi yoluyla yayılır.

C. elegans hermafrodit germline sinyal yolları, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü, bir güçlü modeli için çalışmalar sistemidir. Yetişkin germline ardından giriş ve ilerleme daha proksimale gametogenesis aşamaları ile koordine segregasyonun profaz, (Şekil 1) aracılığıyla distal uçta bulunan kök hücreleriyle polarize bir montaj hattı var. Proksimal sonunda yumurta Olgun, ovulated ve döllenmiş ve embriyo rahim9,10,11' deki yönergeleri başlayabilirsiniz. ~ 20 cep-çapı uzun bölge mitotically Bisiklete binme germline kök, progenitor hücreler ve segregasyonun S fazlı hücreleri ama hücreleri segregasyonun profaz içerir, distal ucu hücre yakınındaki progenitör bölge2,4 denir , 9 , 12. hücre zarlarında distal germline çekirdekler arasında eksik ayrılık sağlar, ancak yaratıcı bölgesi hücreleri Mitotik hücre büyük ölçüde bağımsız olarak Bisiklete binme tabi. Medyan Mitotik hücre döngüsü süresinin Genç Yetişkin Hünsa germline progenitör bölge hücrelerinin ~6.5 h olduğunu; G1 aşamasıdır kısa ya da yok, ve sendika değil1,2,13görülmektedir. Germline kök hücre farklılaşması ile aslında doğrudan farklılaşma oluşur ve böylece transit yükseltecek bölümler4yoksun. Sırasında farklılaşma pachytene aşamasında, yaklaşık 4 5 çekirdeği yumurta oluşturacak değil ama bunun yerine geçmesi apoptosis, sitoplazmik içeriklerini gelişmekte olan oosit12,14 bağışlayarak hemşire hücreler olarak hareket , 15.

Nükleozit analogları ile S-aşamasında etiketleme hücreleri ek olarak bir hücre mitoz ve mayoz antikor boyama kullanarak tanımlayabilirsiniz. Mitoz çekirdeği anti-Fosfo-histon H3 immunoreactive (Ser10) (pH3 denir) antikor7,16. Mayoz çekirdeği anti-onu-3 antikor (segregasyonun kromozom eksen protein)17' ye immunoreactive. Çekirdeklerin progenitör bölgedeki hım-3, nucleoplasmic REC-818varlığı veya WAPL-119varlığı yokluğunda tarafından tespit edilebilir. WAPL-1 yoğunluğu en yüksek somatik erbezi progenitör bölge'de, yüksek ve düşük sırasında erken segregasyonun prophases19yaşında. Protokol, bazı farklılıklar nedeniyle birkaç hücre döngüsü ölçümleri mümkündür: Ben) çekirdeği S-aşamasında tanımlamak ve ölçmek S fazlı Dizin; II) tanımlamak çekirdeği M-aşamasında ve M-faz Dizin ölçmek; III) çekirdeği mitotik veya segregasyonun S-aşamada edildi olup olmadığını belirlemek; IV) G2 süresi ölçün; V) ölçümü duartion G2 + M + G1 aşamaları; VI) ölçümü segregasyonun giriş oranı; VII) segregasyonun ilerleme hızını tahmin ediyoruz.

Bir ıslak-laboratuvar deneyleri sadece birkaç tür birden çok hücre döngüsü ölçümleri yapabilirsiniz. Bakteri ve ortak etiketleme M fazlı hücreleri ile anti-WAPL-1 antikor boyama tarafından bölge hücreleri boyama anti-pH3 antikor ve yaratıcı tarafından etiketli EdU ile C. elegans yetişkin Hünsa besleyerek etiketleme bir 30 dk darbe aşağıdaki protokolünü açıklar. Tek yem EdU (adım 2.5), tipi antikorların süresi değişimler (adım 5) istihdam ve analizleri (adım 8.3) ek ölçümler için gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EdU etiketli bakteri hazırlanması

  1. MG1693 starter kültürü büyümek. Escherichia coli (E. coli) MG1693 thyA içinde bir mutasyon taşır.
    1. 120 mm lysogeny suyu (LB) agar Petri kabına üzerine donmuş gliserol stoktan çizgi E. coli MG1693 dışarı. Kültür gecede 37 ° C'de.
    2. İki bireysel E. coli aşılamak MG1693 kolonileri iki yinelenen 4 mL tüpler 37 ° c ~ 16 h için sıvı LB. kültürünün.
      Not: MG1693 LB içinde iyi timin veya timidin ile ilave olmadan büyür.
  2. E. coli MG1693 EdU ile takıma en az medyada büyümek.
    1. Otoklav 500 mL konik cep şişesi.
    2. Steril tekniği 5 mL % 20 glikoz, tiamin 10 mg/mL, 5 mM timidin 120 μL, 1 M MgSO4, 10 mM EdU, M9 arabelleği 100 mL ve 4 mL taze yetiştirilen gecede MG1693 kültürünün 200 μL 100 μL 50 μL eklemek için kullanın.
      Not: Son EdU bu kültür1,720 mikron bölgedir. Bu konsantrasyon kültür20memeli hücreleri doğrudan uygulanan Eğer DNA hasarı ve hücre döngüsü tutuklanması için açar. Ancak, yalnızca bir kısmını bu EdU E. coli ve böylece C. elegansiçin kullanılabilir kurulmuştur. Genç Yetişkin Hünsa EdU tedaviden sonra hücre döngüsü tutuklama izine rastlanmadı ve yaratıcı bölge veya M-faz dizin boyutunu bir değişiklik yok olduğunu.
    3. Gecede, ama artık 200 devir / dakikada sallayarak ile 24 h 37 ° C'de daha kültür.
  3. EdU etiketli E. coli konsantre ve M9 agar Petri yemekler için geçerlidir.
    1. Masa üstü bir santrifüj ile 4 ° c önceden serin
    2. Steril tekniği kültür 2 – 4 steril 50 mL konik tüpler içine aktarmak için kullanın.
    3. 3000 x g EdU etiketli E. colicips 30 dk için 4 ° C'de, kültürler santrifüj kapasitesi.
      Not: EdU içeren süpernatant yerel ve kurumsal esaslarına göre atın.
    4. Granül 4 mL taze M9 ile resuspend. Steril 1 mL damlalıklı bahşiş veya steril 5 mL serolojik damlalıklı kullanın. Granül resuspending birkaç dakika sürebilir.
    5. Aynı damlalıklı uygulayıp ~ 8 damla resuspended EdU etiketli E. coli yaymak için kullanın MG1693 oda sıcaklığında 60 mm M9 agar Petri yemekler ortasına. Tek bir toplu ~ 16 yemekleri verir.
    6. Birkaç saat için kuru veya oda sıcaklığında bir gecede sonra her yemeğin laboratuvar film şeridi ile mühür yemekleri izin. Yemekleri 15 ° c ~ 2 hafta ve 4 ° c ~ 2 ay saklanabilir. EdU yemekleri aynı toplu iş her deneyler için kullanın.

2. C. elegans için EdU besleme

  1. Zamanlanmış yumurta yatıyordu, alkalin hipoklorit tedavisi kolesterol ile S-orta içine tarama veya uygun sahne21seçerek takip tarafından nüfus eşitleyin. İstenen (burada, 24 saat mesaj-L4) sahne alanı'nda Yuvarlak solucanlar büyüme E. coli OP50 20 ° C'de ile seribaşı orta hayvanlar büyümeye
    Not: deney, başına 50-100 hayvanlar gibi bazı iyi incelemek değil, diğerleri yıkama ve aktarılması sürecinde kayıp olacaktır hazırlamak.
  2. 20 ° C (veya deney için gerekli sıcaklık) ısıtmak EdU yemekleri izin.
  3. M9 veya fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 1,5 mL tüp içine kullanarak NGM yemekleri hayvanlardan yıkayın. Hayvanlar kısaca yerçekimi veya bir microcentrifuge kısa bir tur yerleşmek izin verir.
  4. Süpernatant kaldırmak ve hayvanlar M9 veya PBS ~ 1 mL 1 – 2 kez yıkayın. Süpernatant kaldırın.
  5. Bir cam Pasteur pipet M9 veya PBS küçük bir damla EdU çim ortasına üzerine hayvanlarda aktarmak için kullanın. Sıvı absorbe sonra 20 ° (S-faz tarihinin ölçmek için) C (için doğrudan S-faz ölçümü) 30 dakika veya daha uzun kuluçkaya birkaç dakika bekleyin, gerektiği gibi.
    Not: EdU sinyal1besleme EdU 15 dk kadar az sonra germline çekirdeği algılanabilir.
  6. EdU tabak çanak anatomi bir bardak içine ~ 2 mL M9 veya PBS ile kapalı solucanlar yıkayın.

3. diseksiyon ve C. elegans Germline fiksasyonu

Not: Diseksiyon, fiksasyon ve antikor C. elegans hermafrodit germline boyama için bu protokolü için hemen hemen aynı 1 mL Cam tüpler hızlandırmak için centrifuged dışında Gervaise ve Arur tarafından (2016)22, yayınladılar adımlar ve Pasteur pipet sıvı 1 mL Cam tüpler daha etkili bir şekilde kaldırmak için kullanılan bir süzgün cam yıkama.

  1. Yıkama ve C. elegans germlines incelemek.
    1. Hayvanlar diseksiyon çanak, Merkez, hayvanlarda toplamak için girdap altına yerleşmek izin ve uzun bir Pasteur pipet PBS kaldırmak için kullanın. 1-2 kez ~ 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. PBS 2 mL ve 100 mM levamisole hayvanlar hareketsiz 4 μL ekleyin. Tekrar yemeğin ortasına hayvanlarda toplamak için çanak girdap.
      Not: İmmobilizasyon birkaç saniye ile birkaç dakika arasında sürebilir. Tam immobilizasyon başarılı diseksiyon için gerekli değildir. Eksik olarak dissekan hayvanlar immobilize zaman bazı insanların daha iyi başarı vardır.
    3. Hayvanlar (yaklaşık arasında iki faringeal ampuller) başında keserek 25G 5/8" iğne çifti ile incelemek veya kuyruk. Germline döngü kesmemeye dikkat çekmek. Bağırsak ve germline "iç basınç nedeniyle vücut boşluğu, dışarı pop" ama bağlı kalır. Bu iletişim kuralı daha önce yayımlanmış Gervaise ve Arur benzer (2016)22.
      Not: almak belgili tanımlık diseksiyon zaman ~ 5 min için kesinlikle en fazla 15 dk. daha uzun diseksiyon süreleri antikor boyama sinyal (Sudhir Nayak, kişisel iletişim) kaybına neden olabilir ve PBS açlık-ebilmek tesir etmek belgili tanımlık hayvan fizyolojisi. Öğrenme hızlı ve doğru incelemek için biraz pratik alabilir.
    4. Gerekirse, merkezi disseke hayvanlarda toplamak için girdap ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırmak için uzun bir Pasteur pipet kullanın.
  2. Düzeltmek ve doku kurutmak
    1. 2 mL % 3 paraformaldehyde (PFA) PBS çözümde ekleyin. Laboratuvar film ve mağaza bir banka veya 10 min için bir çekmecede ile gevşek çanak kapağı.
      Not: Çözülme PFA çözüm 37 ° c su banyo ve oda sıcaklığında germlines anatomi önce serin.
      Dikkat: PFA çözüm orta derecede zehirlidir ve olası kanserojen ve teratogen. Paraformaldehyde çözümlerinden yayan buharlar yanıcı. Nitril eldiven giymek. İngiltere'de yılın %16 kimyasal duman başlıklı % 3 oranında seyreltin. Duman hood dışında çalışırken, tüm kapsayıcılara kapalı tutun.
    2. Gonads dikkatle temiz 5 mL Cam santrifüj tüpü aktarın.
    3. PBSTw ~ 3 mL ekleyin (PBS % 0.1 ile ara-20) gonads kalan gonads almak ve İngiltere'de yılın çözüm sulandırmak için bulunan çanak.
    4. Spin aşağı ~ 1 dk. Younger 870 x g , santrifüj klinik ya da küçük hayvan uzun spin zamanlar daha büyük veya daha büyük hayvanlar gerektirir.
    5. Uzun cam pipet kullanarak, süpernatant istenmeyen malzeme şişe kimyasal başlıklı nihai atma için istenmeyen malzeme kabı aktarın.
    6. Yüksek dereceli metanol-20 ° c için önceden soğutulmuş 2 mL ekleyin Santrifüj tüpü sıkıca laboratuvar film ile kapak.
      Not: Altın etiket taze"yüksek kalite" metanol kullanımı belirli antikorlar ile uygun morfoloji gereklidir.
      Dikkat: Metanol son derece yanıcı sıvı ve zehirli buharı, Yutulması halinde inhale veya cilt başvurun için izin. Eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Bir dondurucu flammables küçük birimler için uygun kullanın.
    7. -20 ° C-dondurucu 1 h, hatta gece için deposunda veya hatta birkaç ay.
      Not: Protokol burada duraklatılmış.

4. Germlines suyla temasa

  1. Cam santrifüj tüpü dön metanol sulandırmak ve gonads suyla temasa PBSTw ile doldurun. Spin aşağı ~ 1 dk klinik bir santrifüj 870 x g de içinde.
  2. Uzun cam Pasteur pipet kullanarak, süpernatant istenmeyen malzeme şişe kimyasal başlıklı nihai atma için istenmeyen malzeme kabı aktarın.
  3. PBSTw, iplik aşağı 870 x g de klinik bir santrifüj ~ 1 dk içinde her zaman ~ 5 mL 3 kez kullanarak gonads yıkayın. Süpernatant kaldırın.
  4. Bir küçük 1 mL borosilikat cam tüp ve uzun cam Pasteur pipet PBSTw ile yıkayın.
  5. PBSTw ~ 700 μL ekleyip uzun cam Pasteur pipet gonads küçük tüp aktarmak için kullanabilirsiniz. PBSTw birkaç ek damla tüm gonads aktarılmasını sağlamak için kullanın.
  6. Spin aşağı ~ 1 dk. süzgün uzun cam Pasteur pipet kullanılarak klinik bir santrifüj 870 x g de içinde gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
    Not: antikor algılama gerekmiyorsa, adım 6'atlayın.

5. antijenleri antikorlar ile tespit

  1. PBS % 30 serumda birincil antikorlar sulandırmak. Mevcut örnekte, anti-WAPL-1 antikor seyreltilmiş 1:2,000 ve anti-pH3 antikor seyreltilmiş 1:500. Bir microfuge 20.000 x g 4 ° C'de parçacıklar kaldırmak için de 10 min için taze çözdürülen serum santrifüj kapasitesi. 4 ° C'de birkaç gün için saklama süpernatant, kullanın. İkincil antikorlar (keçi serum burada kullanılır) konak organizmanın eşleştirmek için uygun serum kullanın. İsteğe bağlı bir engelleme adım birincil antikorlar ek Önce eklenebilir.
  2. Seyreltilmiş birincil antikor 100 μL her küçük cam tüp için geçerlidir. 4 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Kuluçka kez antikor tarafından değişir. Bazı antikorlar için oda sıcaklığında 2 h yeterli olur. Uzun incubations (Örn., gecede) mümkündür, ama arka plan artabilir.
  3. PBSTw ile top ve 870 x g de klinik bir santrifüj ~ 1 dk içinde spin aşağı tüplere doldurun.
  4. 3 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 5 dakika başına yıkama yıkama yaygın fazla birincil antikor izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
  5. PBS içinde % 30 keçi serumda ikincil antikorlar sulandırmak. Mevcut örnek, keçi-anti-tavşan-594 ve keçi-anti-fare-647 her-seyreltilmiş 1: 400.
    Not: ikincil antikorlar dikkatle boya boya EdU seti farklıdır emin olmak için seçin. Mevcut örnek, EdU kiti 488 nm uyarma boya içeriyordu.
  6. Seyreltilmiş ikincil antikor 100 μL her küçük cam tüp için geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 h karanlıkta kuluçkaya.
    Not: Kuluçka kez antikor tarafından değişir. Bazı ikincil antikorlar için oda sıcaklığında 1 h yeterli olur. Uzun incubations (Örn., gecede) mümkündür, ama arka plan artabilir.
  7. 3 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 5 dakika başına yıkama yıkama yaygın fazla ikincil antikor izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
    Not: bu sinyali azaltabilir, ancak Gonads PBS 100 μL içinde bu adımdan sonra gerekli ise, depolanabilir. PBS devam etmeden önce kaldırın.

6. gerçekleştirmek EdU algılamaya EdU tıklayın tepki

Not: EdU gerçekleştirme adımları (adım 6 adım 5 önce gerçekleştirmek) boyama antikor önce tıklayın tepki bağlı olarak kullanılan antikor7mümkündür. Ancak, tıklama reaktifler belirli antijenleri ile girişime neden olabilir (Örn., REC-8 antikor fiksasyon ve permeabilization duyarlı). Burada sunulan sipariş parlak antikor REC-8 ile boyama verimleri WAPL-1, hım-3, pH3, bayrak ve CYE-1 antikorlar, diğerleri arasında kullanılır.

  1. Belgili tanımlık tıkırtı EdU kokteyl8 taze temiz 1.5 mL tüp aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın. Eklemeler sırası önemlidir. Işıktan korumak ve buz üzerinde tüm reaktifler korumak. Bu tarif verimleri yeterli bir örnek (100 μL); tarifi gerektiği gibi çarpın.
    1. 2 mL Ultrasaf Su arabelleğe katkı ekleyin. Bu 10 x 1 x seyreltilmiş arabellek katkı kullanmak için hemen önceki yapar.
    2. 10 x arabelleği 8,5 μL Ultrasaf Su 76,5 μL için ekleyin. İyice karıştırın.
    3. 100 mm CuSO4 (bileşen E etiketli) 4 μL ekleyin. İyice karıştırın.
    4. 488 nm boya azid 0,25 μL ekleyin. Onun solvent, dimetil sülfoksit, 4 ° C'de sağlam olduğundan oda sıcaklığında çözdürülen gerekir Mix iyi ve ışıktan korumak.
    5. 1 μL tampon tüp kap içinde katkı maddesi ile mix 9 μL Ultrasaf Su. Damlalıklı kapağı için kalan kokteyl ekleyip karıştırın de yukarı ve aşağı pipetting için gelen.
  2. EdU tıklayın tepki yapar.
    1. ~ 100 μL tıklayın EdU kokteyl küçük tüp gonads ekleyin. Laboratuvar film ile kapak ve 30-60 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Bir kez tepki durulama arabellek 100 μL ile yıkayın.
    3. 4 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 15 dakika başına yıkama yıkama yaygın aşırı EdU kokteyl bileşenleri izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.

7. DNA leke ve slaytlar hazırlayın

  1. 1 damla (~ 25 μL) ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, DNA görselleştirmek için kullanılan) antifade montaj orta gonads için ekleyin. Yerleşmek böylece gonads ile karıştırmak birkaç dakika bekleyin.
    Not: Alternatif olarak, bir 1:1,000 seyreltme PBS içinde (0.1 mg/mL stoktan) DAPI, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) % 90 gliserol veya başka bir antifade montaj orta 20 μL ardından 5 min için uygulanabilir.
  2. Standart cam mikroskop slayt üzerindeki büyük bir % 2.5 özel yastık hazırlayın.
  3. Kullanım bir yeni temiz tozsuz uzun cam özel yastık gonads aktarmak Pasteur pipet. Tüm sıvı ve gonads gonads kaybını en aza indirmek için pipet dar alt tutun.
    Not: Gonads küçük cam tüpe sıkışmış veya uzun bardakta Pasteur pipet "PBSTw ile durulama, parçalanmış bir tabak içinde sıvı toplama ve bireysel hayvanlar bir kirpik ile slayt üzerine toplama tarafından kurtarıldı".
  4. Bir kirpik kullanımı (veya ince saç döngüsü) gonads özel yastık üzerinde dağıtmak ve toz parçacıkları kaldırmak için kürdan yapıştırılmış.
  5. Bir dikdörtgen cam coverslip uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için yavaş yavaş bir taraftan daha düşük. Böylece coverslip serbestçe hareket etmesini engelleyen aşırı çözüm kaldırmak için bir doku kullanın.
    Not: kullanılacak mikroskop maç coverslips seçin. #1 ve #1.5 coverslips iyi çalışır.
  6. Slaytların yerleşmek ve biraz gecede oda sıcaklığında veya 4 ° c kuru izin Bu biraz gonads düzleştirmek için yardımcı olur. Slaytlar 4 ° C'de muhafaza edilmelidir
  7. İsteğe bağlı: tırnak cilası veya başka bir slayt mühürleyen slaytla kenarlarını kapatın. Köşeleri ilk, o zaman taraf mühürleme, coverslip değişen gelen engeller.

8. confocal görüntüleme ve çözümleme

  1. Görüntü dönen disk confocal floresan mikroskop ile distal erbezi yüksek enerji ışık kaynağı, planı apochromatic amaçları ve yüksek verim mikroskop kamera ile donatılmıştır. Esir alma imge 1 mikron veya z-yığınlar arasındaki sıkı aralığı ile. Tüm kanallar için lazer gücü, ışık hassasiyeti ve pozlama zaman dikkat edin.
    1. Aşağıdakileri kullanın: 405 nm lazer çizgi uyarma 485 nm (W60) emisyon filtre ile DAPI için 488 nm lazer çizgi uyarma 527 nm (W55) emisyon filtre ile EdU, 561 nm lazer çizgi uyarma WAPL-1 için 615 nm (W70) emisyon filtre ve 640 nm lazer çizgi excita için Tion pH3 için 705 nm (W90) emisyon filtre ile.
      Not: Sinyal şiddeti ve arka plan şiddeti değişir. Aynı şekilde, gerekli pozlama süreleri büyük olasılıkla ilâ 10 kat değişir.
  2. Hücre sayaç eklentisi23 Fiji24,25 ' el ile her çekirdek için kullanın. Her bireysel çekirdeği varlığı ve yokluğu pH3, EdU ve WAPL-1 göre etiket. Bunlar tüm ana hatlar aşağı hesaplamaları kolaylaştıracak olarak açıklanan Tablo 1 ve Şekil 2, çekirdek sınıflarını kullanın.
    Not: Yetenekli experimentalists doğru çift sayma veya herhangi bir çekirdek eksik olmadan 3D yansıma dosyasındaki tüm çekirdeklerin sayabilirsiniz. Alternatif olarak, bir z-uçağın her çekirdeğinde sayabiliriz ve işaretleri hücreleri R komut dosyası3 çarpma-sayılan çekirdek kaldırmak için kullanılabilir.
  3. Hücre sayıları ve frekanslar üzerinden gerekli hücre döngüsü ölçüm türüne bağlı olarak yukarıdaki sayıları hesaplamak. Çekirdeklerin türleri Tablo 1 ve Şekil 2içinde tanımlanır. Hesaplamaları tablo 2'de özetlenmiştir.
    1. (Varyasyon ben) S-aşamasında çekirdeklerin tanımlamak için 30 dk için EdU hayvan besleme. EdU etiket görüntüleme herhangi bir çekirdek S fazlı çekirdeği vardır. Hesaplamak için sum A ve C çekirdekleri al, Tablo 1 ve Şekil 2bakın.
      Not: bir 30 dk içinde vahşi-türü yetişkin Hünsa EdU darbe, tüm EdU çekirdeği etiketli ortak progenitör bölge işaretleri1ile etiketlenmiş.
    2. Yaratıcı bölgesi ölçmek için REC-8 veya WAPL-1 antikor gibi bir yaratıcı bölge marker ile leke. Yaratıcı bölgesi tanımlanır burada bütün nucleoplasmic REC-818 veya WAPL-1 immunoreactive germline çekirdeği olarak. Hesaplamak için tüm WAPL-1 immunoreactive çekirdeği toplamı (A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
      Not: WAPL-1 de DTC ve yok sayılması somatik erbezi çekirdeği Etiketler. Somatik hücre çekirdeği son derece yoğun WAPL-1 sinyal, pozisyon biraz dışında germline ve çekirdekleri bir "kızarmış yumurtalı" morfoloji tarafından tespit etmek kolaydır.
    3. S-faz Dizin ölçmek için 30 dk EdU deney gerçekleştirmek ve REC-8 veya WAPL-1 antikor ile ortak etiket. S-faz Dizin S-aşamasında progenitör bölge oranı olarak tanımlanır. Hesaplamak için tüm S fazlı çekirdeği saymak ve sonra dede bölge çekirdeği toplam sayıya bölme (A + C / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
    4. (Varyasyon II) M-aşamasında çekirdeklerin tanımlamak için pH3 antikor ile leke. Herhangi bir pH3 immunoreactive çekirdeği M fazlı çekirdeği vardır. Bu yem EdU süresi bağımsız olarak çalışır. A toplamı hesaplamak için almak ve B hücre çekirdeği, Tablo 1 ve Şekil 2bakın.
      Not: WAPL-1 de DTC ve yok sayılması somatik erbezi çekirdeği Etiketler. Somatik hücre çekirdeği son derece yoğun WAPL-1 sinyal, pozisyon biraz dışında germline ve çekirdekleri bir "kızarmış yumurtalı" morfoloji tarafından tespit etmek kolaydır.
    5. M-faz Dizin ölçmek için pH3 ve REC-8 veya WAPL-1 antikorlar ile ortak etiket. M-faz Dizin M-aşamasında progenitör bölge oranı olarak tanımlanır. Hesaplamak için tüm M-faz çekirdeği saymak ve sonra dede bölge çekirdeği toplam sayıya bölme (A + B / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
    6. (Varyasyon III) Çekirdek aşamasında mitotik ve segregasyonun S-her ikisi de EdU ile etiketleyin. İki popülasyonun ayrı söylemek gerekirse, S-evre mitoz veya mayoz izledi belirlemek. Çekirdeklerin mitotik veya segregasyonun S-aşamasında olup olmadığını belirlemek için EdU 4 h ve pH3 için ortak etiket için yem (bir M-faz işaretleyici) ve hım-antikor boyama tarafından 3 (segregasyonun kromozom eksen protein). EdU ve pH3 görüntülemek çekirdeklerin kayıt (A tipi, Tablo 1 ve Şekil 2bakınız) mitotik S-faz EdU ve hım-3 görüntüleyen hücre çekirdeği süre olarak (türü E, Tablo 1 ve Şekil 2bakın) segregasyonun S-faz olarak.
    7. (Varyasyon IV) G2 aşamanın süresini hesaplamak.
      Not: G2-faz M-faz S fazlı ayırır. Her ne kadar hiçbir işaret C. elegans germline G2 etiketinde bildirilmiştir, bir etiket M-faz (diseksiyon zamanında) ve S-faz (birkaç s önce başlayan birkaç deney verileri birleştirerek G2 faz süresince hesaplayabilirsiniz diseksiyon). M-faz ve S-faz işaretçileri görüntüler bir hücre G2 fazlı deneme süresince tamamlandı. Sadece M-faz marker ve S-faz imini içermeden görüntüleyen bir hücre S-aşamasında deneme sırasında değildi.
      1. G2-aşamanın süresini hesaplamak için 2 h ve pH3 antikor ile ortak etiket için EdU besleme. (M-faz diseksiyon esnasında bunlar) pH3 (bunlar S-aşamada 2 h EdU etiket önce diseksiyon sırasında edildi) EdU varlığı ile etiket tek çekirdek inceleyin. G2-aşama tamamlandı M fazlı çekirdek kısmını hesaplamak (A / A + B, bkz: Tablo 1 ve Şekil 2).
      2. 3 h EdU etiketi içeren ve tekrar bir 4 h EdU etiket (ve isteğe bağlı olarak bir 5 h EdU etiket) ile bu denemeyi tekrarlamak. EdU y ekseni üzerinde pozitif olan pH3 pozitif hücre çekirdeği yüzde ve EdU etiket x ekseni, süresi içinde Şekil 3Agösterildiği gibi arsa.
      3. Grafikteki nokta bağlanma ve % 50, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi belirleme G2 fazlı ortanca süresi hesaplayın.
      4. Grafikteki nokta bağlanma ve % 99, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi belirleme G2 fazlı en uzun kalma süresini hesaplayın.
    8. (Varyasyon V) G2 + M + G1 duraion hesaplayın.
      Not: C. elegans germline G1 evresi alışılmadık derecede kısadır. Her ne kadar hiçbir işaret G1 C. elegans germline etiketlemek için rapor edildi, bir G2, M ve G1 evresinin toplam süresini tahmin ve sonra bu sefer yukarıda açıklanan G2 fazlı zamanla karşılaştırın. G2 + M + G1 maksimum süresi (S-faz geçmesi değil) EdU negatif EdU birkaç saat için etiketleme sonra kalır tüm yaratıcı bölge çekirdek (WAPL-1 immunoreactive) yüzdesini tahmin edilmektedir.
      1. G2 + M + G1 süresini hesaplamak için 2 h ve REC-8 veya WAPL-1 antikor ile ortak etiket EdU beslemesi. Bu süre içinde S-faz uygulandı progenitör bölge kısmını belirlemek (A + C / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
      2. 3 h EdU etiketi içeren ve tekrar bir 4 h EdU etiket (ve isteğe bağlı olarak bir 5 h EdU etiket) ile bu denemeyi tekrarlamak. REC-8 veya EdU y ekseni üzerinde pozitif olan WAPL-1 pozitif hücre çekirdeği yüzde ve x ekseni, EdU etiket süresi Şekil 3B' gösterildiği gibi arsa.
      3. Grafikteki nokta bağlanma ve % 99, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3B' gösterildiği gibi bulma G2 + M + G1 en uzun kalma süresini hesaplayın.
        Not: G2 + M + G1 ve G2 süresi 2, 3, 4, tek bir küme olarak belirlemek için deneyler ve 5 h EdU deneyler tavşan-anti-WAPL-1 hem de fare-anti-pH3 antikorlar ile birlikte etiketleme tarafından gerçekleştirmek mümkündür.
    9. (Varyasyon VI) Dede bölgesinde çoğaltılan çekirdeklerin tanımlamak ama beri girilen mayoz var için REC-8 veya WAPL-1 antikorlar ile 10 h ve Co etiketi için EdU hayvan besleme. EdU etiket görüntüleme herhangi bir çekirdek sırasında bu 10 h S-aşamada edildi. REC-8 veya WAPL-1 nucleoplasmic boyama görüntüleme herhangi bir hücre çekirdeği içinde mayoz vardı. Sadece yaratıcı bölge marker ile etiketleme görüntülenmez EdU etiketleme ile çekirdekleri saymak (E, bkz. Tablo 1).
      Not: Tersine, gonads hım-3 segregasyonun profaz işaretçisiyle anti-hım-3 antikorlar için lekeli sayısı etiketleme EdU ile çekirdek sayısı olup ayrıca hım-3 için olumlu.
    10. Segregasyonun giriş oranını hesaplamak için yukarıdaki deney EdU 5 h, 10 h ve 15 h etiketi gerçekleştirmek. Y ve x ekseni, EdU etiketinde süresi mayoz girilen çekirdeklerin sayısı Şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi ayarlayın. Sonra bir basit doğrusal regresyon kullanın yamaç (h başına çekirdek girilen Mayoz) hesaplamak için y = mx + b.
      Not: Bir doğrusal regresyon segregasyonun giriş oranını hesaplarken kullanmak önemlidir. Y-kesişim noktası sıfır olduğundan sadece mayoz EdU etiket süresi tarafından girilen çekirdeklerin sayısı bölün yanlış olacaktır.
    11. (Varyasyon VII) Segregasyonun ilerleme hızını ölçmek.
      Not: EdU kovalent DNA'ya kurulmuştur, bu farklılaşma ile hücreleri nüfusu izlemek için kullanılabilir. Mayoz, mayoz, ilerlemeyi içine girin ve oogenesis tabi S-dede bölge aşamasında uygulanan hücre EdU etiket saklamanız. EdU ile bir darbe-chase deneyinde segregasyonun ilerleme hızını ölçmek için kullanılabilir.
      1. EdU etiketli bakteri 4 h ("darbe") hayvanlara yem. Hayvanlar 48 h ("chase") için etiketlenmemiş OP50 bakteri transfer sonra incelemek ve isterseniz etiket eş REC-8 veya WAPL-1 gibi bir yaratıcı bölgesi işaretçisi (veya bir segregasyonun profaz marker hım-3 gibi).
      2. Imaging en proksimal EdU etiketli çekirdeği pozisyon için bakın. Segregasyonun progresyon oranı (hücre çapı progenitör bölge sonu) uzaktan çekirdeği 48 h kovalamaca sırasında etiketli en proksimal EdU tarafından gitti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA sentezi EdU dahil etmek için gerekli olduğundan, bir EdU etiketli çekirdeği S fazlı EdU-etiketleme zaman penceresi sırasında yapıldı sonucuna varabiliriz. Bir bakteri çekirdeği S-faz olarak etiketlenmiş diseksiyon anda EdU ile bir 30 dk beslenme içinde bu etiketle çekirdeklerin yorumlayabilir. Deney besleme bir artık sürekli EdU içinde etiket çekirdeği erken zaman penceresinde ve sol S fazlı beri etiketli veya EdU zaman penceresi geç parçası olarak etiketlenmiş. EdU sinyal DAPI sinyal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı ve sorun giderme için ilk nokta EdU etiketli bakteri (adım 1) hazırlanması önemlidir. Vahşi tipli Genç Yetişkin Hünsa etiketinde çok güvenilir 4 h EdU-darbe, bu EdU etiketli bakteri yeni her toplu iş için kullanışlı bir denetimi yapma. Ayrıca, bağırsak (büyük hayvanlar veya belirli yutak/taşlama arızalı mutantlar) girin sağlam EdU etiketli bakteri tıklayın kimya ile etiket ve parlak dikdörtgen puncta gut olarak görünür. Hünsa etiketleme için alternatif bir teknik bir "emmek" EdU3

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MG1693 için E. coli stok merkezi için minnettarız; Wormbase; Ulusal kurumları, sağlık Office of araştırma altyapı programlar tarafından (P40OD010440) suşlar için finanse Caenorhabditis genetik Merkezi; Zach Pincus istatistiksel tavsiye için; Aiping Feng reaktifler için; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar ve John Brenner eğitim, danışmanlık, destek ve yardımcı tartışma; ve bu el yazması geri bildirimler Kornfeld ve Schedl labs. Bu eser kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen [R01 AG02656106A1 KK, R01 GM100756 TS için] ve bir Ulusal Bilim Vakfı HGUGM dostluk [DGE-1143954 ve DGE-1745038 ZK için]. Ne Ulusal Sağlık Enstitüleri ne de Ulusal Bilim Vakfı çalışma, toplanması, Analizi ve yorumu veri tasarım, ne de el yazması yazılı herhangi bir rolü vardı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
E. coli MG1693Coli Genetik Stok Merkezi6411standart takviyesiz LB
E. coli'de iyi büyür OP50Caenorhabditis Genetik MerkeziOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme KitiThermo Fisher ScientificC10337
5-Etinil-2 & prime;-deoksiuridinSigma900584-50MGveya kitte sağlanan EdU'yu kullanın
GlikozSigmaD9434-500GD-(+)-Dekstroz
Tiamin (B1 Vitamini)SigmaT4625-5GReaktif Sınıfı
TimidinSigmaT1895-1GBioReaktif
Magnezyum sülfat heptahidratSigmaM1880-1KGMgSO4, Reaktif Sınıfı
Sodyum Fosfat, dibazik, susuzFisherBP332-500GNa2HPO4
Potasyum Fosfat, monobazikSigmaP5379-500GKH2PO4
Amonyum KlorürSigmaA4514-500GNH4Cl, Reaktif
Artı Bakteriyolojik AgarABD BiyolojikC13071058
Kalsiyum Klorür dihidratSigmaC3881-500GCaCl
LB Et Suyu (Miller)SigmaL3522-1KG25g/L
LevamisolSigma'daL9756-5G0.241g/10ml
Fosfat tamponlu salinCalbiochem Omnipur6506ev yapımı PBS de aynı şekilde çalışır
Tween-20SigmaP1379-500ML
%16 Paraformaldehit, EM dereceli ampullerElektron Mikroskobu Bilimleri1571010ml ampuller
%100 metanolThermo Fisher ScientificA454-1LAltın etiketli metanol, belirli antikorlarla uygun morfoloji için kritik öneme sahiptir
Keçi SerumuGibco16210-072Lot 1671330
tavşan-anti-WAPL-1Novus biyolojikleri49300002Lot G3048-179A02, 1:2000'de kullanılır
fare-anti-pH3 klonu 3H10Millipore05-806Lot # 2680533, 1:500'de kullanılır
keçi anti-tavşan IgG konjuge Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, 1:400'de kullanılır
keçi anti-fare IgG-konjuge Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, 1:400'de kullanılır
4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol Dihidroklorür (DAPI) içeren Vectashield antifade montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-1200ayrı bir DAPI inkübasyon ojesini takiben bunun yerine DAPI'siz montaj ortamı kullanılabilir
Wet n WildDTC450Bherhangi bir şeffaf oje çalışmalıdır
S-ortaçeşitliM9 tamponu protokolü için wormbook.org bakın
M9agar
M9tamponu ile aynı tarif, ancak %1.7 agar ekleyin
Nematod Büyüme Ortamıprotokolwormbook.org bakınız
saat camıCarolina Biological42300
Parafilm laboratuvar filmiPechiney Plastik AmbalajPM-9964 inç genişliğinde laboratuvar filmi
petri kapları60 mm çap
Uzun cam Pasteur pipetleri
1ml santrifüj tüpleriMidSci Avant2926
Uçlar
Serolojik pipetler
500 mL Erlenmyer şişesi
Alüminyum folyo
25G 5/8" iğnelerBD PrecisionGlide 
5ml cam santrifüj tüpüPyrex 
Borosilikat cam tüpler 1ml
cam slaytlar
no 1 lameller 22 x 40 mmno 1.5 çalışabilir, ayrıca
37 &�; C Çalkalayıcı inkübatör
Masaüstü Santrifüj
Klinik SantrifüjIEC4286 sallanan kova rotorlu
Mini Santrifüj
20 ve derece; C kuluçka makinesi
4 & derece; C buzdolabı-20
& derece; C dondurucu
Observer Z1 mikroskopZeiss
Plan Apo 63X 1.4 yağa daldırma objektif lensiZeiss
Ultraview Vox eğirme diski konfokal sistemPerkinElmer Nikon eğirme diski konfokal sistemi, burada açıklandığı gibi de çok iyi çalışır: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
, kullanılır )protokolü için çeşitli wormbook.org bakın diseksiyonu için çeşitli 305122,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107(2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EdU nkorporasyonuS faz ndeksiM faz ndeksiG2 S resimm nofloresan BoyamaGonad DiseksiyonuClick KimyasFiji H cre Sayac

İlgili makaleler