JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58351
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, ,
1Department of Microbial Infection and Immunity,The Ohio State University, 2Department of Microbiology,The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute,The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health,The Ohio State University

Summary

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Abstract

Fizyolojik çalışma ortamlarında memeli hücreleri kez plazma zarı zarar görmesine neden mekanik ve biyokimyasal gerilmeler tabi. Bu zarardan karşılık olarak, karmaşık moleküler makineleri hızla bariyer fonksiyonu geri yüklemek ve hücre yaşam sürdürmek için plazma zarı yeniden mühürleyin. Bu alanda araştırma, 60 yaşında olmasına rağmen hala makine yeniden mühürlemeden hücre kapsamlı bir anlayış eksikliği. Hücresel bileşenleri belirlenmesi amacı ile bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme veya yeniden mühürleme, artırabilir uyuşturucu biz verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer floresans tabanlı yüksek üretilen iş tahlil geliştirdik Mikroplaka içinde kültürlü. Plazma zarı zarar için bir model sistem olarak bakteriyel gözenek oluşturan toksin listeriolysin O (LLO), büyük 30-50 nm çapında proteinaceous gözenekleri kolesterol içeren formlar hücreleri maruz membranlar. Isı kontrollü çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanımı hızlı ve hassas spectrofluorometric ölçümleri, aydınlık alan ve floresan mikroskopi görüntüleme yaşayan hücrelerin birlikte sağlar. Bir membran impermeant nükleik asit bağlama fluorochrome tarafından yayılan floresan yoğunluğu kinetik Analizi yaralama ve verimliliği yeniden mühürlemeden hücre hesaplama için izin hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden membran kapsamını yansıtır . Yapısal nükleer protein histon 2B, mikroplaka hesap numarasına olası değişimler için her şey bir floresan chimera hızlı ve için nihai sağlayan hücreleri numaralandırma için floresans mikroskobu görüntüleme sağlar farklı hücre popülasyonlarının tanımlaması. Bu yüksek üretilen iş tahlil ana bilgisayar genler için tarama yoluyla membran tamir mekanizmaları anlayışımızı genişletmek için beklenen veya exogenously eklendi güçlü bir araç bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme bileşikleri olduğunu.

Introduction

Memeli hücre mekanik, ozmotik ve biyokimyasal stres plazma membran bütünlüğü kaybı sonuçlanan, tabidir. Hızlı ve verimli yeniden mühürlemeden olmadan, hasarlı hücreleri hızlı bir şekilde programlanmış veya nekrotik ölüme yenik. 1960’lardan beri çabaları işlem yeniden mühürlemeden plazma zarı anlamak için onun işlev bozuklukları ile ilişkili yıkıcı sonuçları tarafından motive edilmiş. Nitekim, bacak-korse kas distrofisi, diyabet ve Chediak-Higashi sendromu gibi hastalıkların mutasyonlar gen kodlama dysferlin, gelişmiş glikasyondan son ürünleri imalatı ve kusurları nedeniyle eksik plazma zarı onarım için bağlantılı olmuştur lizozomal ticareti düzenleyici CHS1, sırasıyla1,2,3,4,5,6. Ancak, bugüne kadar membran anlayışımızı yeniden mühürlemeden hala sınırlı7var. İlk çalışmalar membran yeniden mühürlemeden ekstraselüler Ca2 + ile hasarlı plazma zarı8,9,10akını tarafından başlatılır gösterdi. O zamandan beri birkaç ayrı ayrı Ca2 +-hücreleri yeniden mühürlemek için önerilen bağımlı mekanizmaları. Yama hipotez yara yakınlık içinde birbirleriyle ve bir yama11,12,13,14davranmaya hasarlı plazma zarı ile hücre içi veziküller sigorta öneriyor. İkinci bir model o kalsiyum-bağımlı ekzositozu öneriyor organellerin yara adlı bir site sphingomyelin plazma zarı dış kitapcıktaki ceramide dönüştürür lizozomal enzim asit sphingomyelinase bültenleri. Bu ani değişiklik lipid bileşiminde hasarlı bölge15,16,17endositoz ceramide tahrik sonuçlanır. Son olarak, üçüncü önerilen mekanizma endosomal kapalı18plazma zarı bud dışa dönük vezikül oluşumu tanıtmak taşıma (ESCRT) için gerekli karmaşık sıralama için bir rol içerir. Proteinler, sadece sınırlı sayıda bu modelleri tespit edildi ve onların makine daha fazla aydınlatılmamıştır gerekir.

Burada biz verimliliği yapisan memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı zarar tabi önlemler rekombinant listeriolysin O (LLO)19aracılı bir yüksek-den geçerek tahlil tanımlamak. LLO fakültatif intraselüler patojen Listeria Monositogenez20,21,22 tarafından salgılanan gözenek oluşturan bir toksin (SFT) ve MACPF/CDC aittir (membran atak kompleksi, perforin, ve kolesterol bağımlı cytolysin) süper. MACPF çoğu memeli gözenek oluşturan proteinleri ise KGK özellikle bakteriyel toksinler bağışıklık savunma dahil kendi patojenik yaşam23tanıtmak için ana bilgisayar hücrelerine de zarar gram-pozitif patojenler tarafından üretilen. KGK suda çözünen monomer sentez veya kolesterol için bağlama dimer plazma zarı sunmak ve en fazla 50 alt birimleri prepore bir kompleks oligomerize. Karmaşık prepore sonra 30-50 nm çapı24,25,26,27‘ deki yayılan bir β-varil gözenek oluşturan lipid bilayer genelinde β-iplikçikleri eklemek için yeniden düzenler.  Bu iri gözenekli hücre içinde ve dışında Cerayanlar iyonları ve küçük hücresel bileşenleri izin; Yine de, bazı çalışmalar daha küçük boyutları gözeneklerin de kurulan28,29,30olduğunu önerdi. KGK arasında LLO yüksek üretilen iş analizleri31,32için elverişli geri dönüşü olmayan pH ve sıcaklık bağımlı toplama dahil benzersiz özelliklerini görüntüler. LLO 4 ˚C, onun bağlayıcı hücreleri, ancak karmaşık gözenek oluşumu için izin veren bir sıcaklık hücre kültür orta eklenebilir. Gözenek oluşumu inisiyasyon sonra toksin moleküllerin membran için formu reaksiyonlar, düzlemde verimli difüzyon ve konformasyon remodeling gözenek üretimi dahil izin 37 ˚C sıcaklığa yükselterek eşitlenebilir. Bu nedenle, sıcaklık, hücre hasarı kinetik anahtarı izleyen plazma zarı bağlı toksin miktarına bağlıdır. Önemlisi, çözünür LLO (plazma zarı bağlı değildir) sıcaklık ilişkisiz toksin molekülleri silsin gereğini azaltır ve zaman içinde membran hasar ölçüde sınırlar 37 ˚C ulaştığında hızla ve geri dönüşümsüz toplar. LLO kolesterol için bağlar ve gözenekleri kolesterol açısından zengin membranlar oluşturur, son olarak, bu tahlil memeli hücreleri geniş bir mükellef olduğundan. LLO esas olarak gözenek oluşumu ile sinyal konak hücre etkiler akılda tutmak önemlidir birkaç istisna dışında hangi gözenek bağımsız hücre sinyallemesi33,34,35,36 oluşabilir ,37,38,39. Bu nedenle, olamaz faaliyetleri membran onarım sürecini etkileyebilir sinyal o LLO hariç.

Bu tahlil doğrudan hücre pasif yaralı hücreleri girer ve nükleik asitler ile ilişkilendiren bir kez son derece floresan olur bir hücre impermeant fluorochrome (Örneğin, propidium iyodür) birleşme ölçerek yaralama ölçüde değerlendiriyor . Bu nedenle, fluorochrome hücre yaralama, gerçek zamanlı analiz izin deney boyunca hücre kültür ortamında muhafaza edilebilir. Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu toksin konsantrasyon ile artacak ve toksin verilen konsantrasyona kadar tüm gözenekleri kurulur ve hücreleri tamamen tamir veya doygunluk ulaşılıncaya kadar zamanla artacaktır. Hücre dışı Ca2 + membran gözenekler yoluyla akını yeniden mühürleme için olmazsa olmaz bir olaydır. Bu nedenle, resealing verimliliği dolaylı olarak hücre kültür Ca2 + (onarım izin veren koşul) içeren bir Ca2 +‘ yaralama için orta yaralama karşılaştırarak kanıtı-ücretsiz Orta (onarım kısıtlayıcı durumu). Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu hücre konsantrasyonu her iyi doğru orantılı olduğundan, aynı toplama bütün Wells, tohum hücrelere önemlidir. Her şey hücrelerde önce ve sonra hücre dekolmanı, yüzen olarak, toplanan hücre veri yorumu karmaşık hale floresans okuma belirsiz oluşmaz emin olmak için tahlil numaralandırmak önemlidir. Hücreleri numaralandırmak için lokalize nükleer histon 2B-GFP (H2B-GFP) ifade hücreleri bu tahlil kullanılmıştır. Isı kontrollü, çok modlu, 37 ° C’de yaşam hücrelerinin mikroskopisi görüntüleme (96 veya 384-şey plaka biçimini kullanarak) hızlı, yüksek üretilen iş ölçümler floresans yoğunluklarını Mikroplaka Okuyucular birleştirmek İkinci hücre sayı saymak ve farklı hücre popülasyonlarının nihai oluşumu gözlemlemek için kullanılabilir.

Sonuçta, bu tahlil kullanıcılar tarafından tarama için ana bilgisayar molekülleri onların bilgi membran tamir mekanizmaları karmaşıklığı genişletme yeteneğini sağlar veya membran denetleyebilen exogenously eklenen bileşikler onarın. Aşağıdaki protokol için LLO maruz hücreleri resealing verimliliğini ölçmek için deneysel adımları açıklar ve verilen ilaç ya da yeniden mühürlemeden verimliliği hücresel tedavi etkilerini değerlendirmek.

Protocol

1. hazırlık Hücre kaplamaNot: İnsan servikal epitel hücreleri, HeLa ve histon 2B-GFP (H2B-GFP), ifade HeLa Bu protokol için kullanılan, ancak bu tahlil için diğer memeli hücreleri19adapte edilebilir. Yapisan bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 0.25 tripsin-EDTA 2 mL hücrelerle yıkayarak bağlantısını kesin. Kullanılan tripsin taze tripsin-EDTA %0.25 2 mL ile değiştirin. Hücreleri yuvarlak ve balonun müstakil kadar 5 min için 37 ˚C hücreleri kuluçkaya. 8 mL büyüme orta (DMEM % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin içeren) hücrelerde resuspend. Bir hemasitometre ve hücre süspansiyon 10 µL kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. 2. 5 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon büyüme ortamına hücrelerde sulandırmak. Hücre süspansiyon steril pipet Havzası dökün ve bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süspansiyon iyice karıştırın. 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, HeLa hücreleri (2. 5 x 104 hücreleri/100 µL/iyi) nüsha (veya quadruplicate) bir 96-şey düz, açık alt, siyah polistren doku kültürü tedavi tabağına dağıtın.Not: Bir kaplama düzenleme Şekil 1′ deki bir örnek olarak sunulur. Hücreleri oksijen hücre kültür kuluçka 37 ˚C ve % 5 CO224 h için kültür. Hisse senedi eriyik hazırlığı Hanks dengeli tuz solüsyonu, 0.476 g MgCl2 (5 mM), 95 gr ekleyerek 10 x stok arabelleği (M1 ve M2 hazırlamak için kullanılır) M 1 L hazırlamak ve HEPES (100 mM) 23.83 g 900 mL su için. 1 L. filtre sterilize birime yükseltmek ve pH 7.4 için ayarlayın. 50 mL 50 (1.25 M) stok glikoz x 11,26 g D-(+) ekleyerek hazırlamak-glikoz toplam 50 mL su için. Filtre çözümü sterilize. Bir 100 (120 mM) stok kalsiyum x 50 mL 50 mL su için toplam CaCl2 0.666 g ekleyerek hazırlayın. Filtre çözümü sterilize. 10 (50 mM) stok etilen glikol-bis(2-aminoethylether)-N, N, n x 50 mL hazırlamak ‘, N’, EGTA, 0.951 g 40 mL su ekleyerek tetraacetic asit (EGTA). PH 8 EGTA çözülmeye NaOH kullanarak artırmak, sonra 50 mL birime yükseltmek. Filtre çözümü sterilize. Tek bir 96-şey plaka için orta 1 50 mL hazırlamak (M1, içeren Ca2 +), Orta 2 50 mL (M2, Ca2 +-özgür) ve orta EGTA ile buna göre takıma 2 15 mL: M1 için 10 x arabellek M, 100 x CaCl20.5 mL ve 50 x glikoz 1 mL 5 mL 43,5 mL su ekleyin. M2 için 10 arabellek M x 5 mL ve 1 mL 50 x glikoz 44 mL su ekleyin. M2/EGTA için 10 x arabellek M ve 10 1,5 mL 1,5 mL ekleyin x EGTA 12 mL su için.Not: tüm çözümler propidium iyodür (PI) içeren hücrelere doğrudan eklemeden önce hazırlanmalıdır. Plaka okuyucu/görüntüleme sitometresi ayarlarıNot: iki algılama birimleri ile donatılmış bir Multi-Mode plaka okuyucu kullanın: bir spectrofluorometer ve bir görüntüleme sitometresi. Photobleaching fluorophores önlemek için floresans maruz kalma sınırı. 37 ° c plaka okuyucu tahlil yapmadan önce önceden ısıtmak. Buna göre kinetik tahlil için parametreleri ayarlamak içinde ayarları modu: Monokromatör, FL (floresan)ve kinetik için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okuyun. Dalga boyu ayarları’ nın altında bir 9 ve 15 nm uyarma ve emisyon bant, seçmenizi sağlar. Propidium iyodür (PI) kullanarak deneyleri için uyarma ve emisyon dalga boylarında sırasıyla 535 ve 617 nm için ayarlayın. Plaka türü’ nün altında 96 Wells için plaka formatı ve siyah-duvar açık alt plaka için karşılık gelen önceden ayarlanmış plaka konfigürasyonu seçin. Okuma alanıaltında kinetik incelenecek wells vurgulayın. Devresel_ödeme ve optikaltında belgili tanımlık birden parlamak 6 okuma başına önceden ve alttan okumaiçin kutuyu işaretleyin. Zamanlamaaltında 00:30:00 30 dk kinetik tahlil için Toplam çalışma süresi kutusuna ekleyin ve 00:05:00 aralığıiçin ekleyin.Not: her zaman için gelin ve bir dalga boyu, okuma, bir tam 96-şey plaka zamanı 30 s. Sağdaki Ayar bilgileri belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam’ ý seçin. Kinetik başlatmak için basın okuma çalıştırın. Buna göre görüntüleme parametreleri ayarlama içinde ayarları modu: Minimax, görüntülemeve son nokta için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okumak. Dalga boylarındaaltında ışık iletilenve ya da her ikisi 456/541 uyarma ve emisyon boyları için karşılık gelen floresans kutularını seçin nm (GFP) ve 625/713 nm (PI). Aynı seçenekleri 1.3.2.3 ve 1.3.2.4 adımlarda tanımlanan Plaka tipi ve Okuma alanı için kullanın. De alan ayarıaltında yansıması için bir kuyu içinde sitelerin sayısı seçin.Not: 12 siteleri tam iyi resim karşılık gelir. Görüntü alma ayarlarıaltında ışık, 541 (GFP) ve 713 (PI) aktarılan pozlama süreleri seçin. GFP için iyi bir pozlama süresi 20 ms/görüntü ile tüm görüntü. İçin iletilen ışık (TL) ve PI floresan, sırasıyla her şey Merkezi’yle pozlama süreleri 8 ile 20 ms, tek bir görüntü elde etmek. Sağdaki ayarları bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam’ ý seçin. Satın alma için her şey (12 resimler/de) bir 96-şey plaka tüm yüzey düşsel ve bir dalga boyu için ~ 15 dk. görüntüleme başlatmak için basın okuma zamanı.Not: Bir tek görüntü/iyi bir 96-şey plaka satın alma saati için bir dalga boyu ~2.5 min/plaka gerektirir. Yukarıda açıklanan parametreleri belirli ekipmanları bizim laboratuvar ile karşılık gelir. Spectrofluorometric ölçümler: 1.0 nm artış uyarma dalga boylarında (250-850 nm) ayarlanabilir bir 9-15 nm bant ile görüntüleme bir xenon flaş lamba bir photomultiplier tüp bulmak > 6 ile oturum dinamik alan ve ayarlanabilir 15 veya 25 nm salma bant. Sitometresi görüntüleme: bir aydınlatma ışık kaynağı beyaz ışık, 460 yetenekli nm ve 625 nm uyarma boyları 20 nm bant, 541 merkezli emisyon filtreleri ile nm (108 nm bant) ve 713 nm (123 nm bant), sırasıyla, bir 4 X amaç birleştiğinde bir 1,25 megapixel 12-bit şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi. 2. tahlil Not: tahlil zaman hücrelerin % 70-90 birleşmesi olması gerekir. Yıkama adımları sırasında Orta kaldırıldı ve oldukça (doğrudan üzerinde hücreler) yan duvarına uygulanan gerekir. LLO sıcaklıkta onun toplama kadar adım 3.1.5 önlemek için < 4 ˚C korumak. 30 µM PI M1 stokunun hazırlamak ve 30 µM PI m2 hisse senedi 37 ˚C önceden ısıttı. Plaka 1 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları, aşağıdaki gibi kullanarak hücreleri nazikçe yıkayın: Onarım keyfi koşulları için hücreleri 200 µL/iyi M1 ile iki kez önceden 37 ˚C ısındı büyüme orta ve yıkama kaldırın. Orta 100 µL/30 µM PI içeren kuyu ile sıcak M1 değiştirin. İçin kısıtlayıcı koşullar onarmak, büyüme orta kaldırmak ve 5 mM 200 µL/iyi M2 ile bir yıkama ardından Ca2 +, şelasyon yapın EGTA içeren hücreleri 200 µL/iyi sıcak M2 ile yıkayın. 30 µM PI içeren orta 100 µL/iyi sıcak M2 ile değiştirin. Büyüme orta yıkanmış ve propidium iyodür içeren orta yerine sonra doğrudan 2.1.3 adım taşıyın. Görüntü plaka 1 iletilen ışık, GFP ve PI altında 1.3.3 (önceden kinetik) altında ayrıntılı olarak. Bu adım 15-20 dakika sürer. 2.1.3. adımda 15dk döneminde plaka 2 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları aşağıdaki gibi kullanarak hazırlayın: 96-şey yuvarlak alt Polipropilen Mikroplaka buza koyun. 1 (Şekil 1) plaka için karşılık gelen bir deneysel tasarım kullanarak plaka yapılandırın. Onarım keyfi koşulları için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren kuyusu buz gibi M1 eklemek µL/4 x LLO veya denetim için içeren kuyusu buz gibi M1. Onarım kısıtlayıcı koşullar için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren iyi buz gibi m2 eklemek µL/iyi buz gibi m2 4 x LLO veya denetim için içeren. Hemen plaka 1 (2.1.3. adım) görüntüleme sonra buz, buz ile doğrudan temas plaka ayırmak için alüminyum folyo kullanarak yerleştirin. Plaka 1 5 dakika soğumasını sağlar. 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, 100 µL plaka 2 (adım 2.1.4) karşılık gelen kuyu 1 plaka içine her kuyudan transfer. Düzgün toksin plaka 1 medya dağıtmak için menisküs aşağıdaki ipuçlarını yerleştirin ve nazikçe kabarcıklar tanıtımı olmadan ses çıkarma.Not: Bu yanlışlıkla hücreleri ayırmak gibi yukarı ve aşağı, pipet değil. Toksin hücrelere bağlamak ve hemen spectrofluorometer modu (adım 1.3.2) kullanılarak kinetik tahlil için plaka okuyucu için plaka 1 aktarmak izin vermek ek bir 1 dk plaka bırakın. Kinetik tahlil sonunda görüntü plaka 1 (sonrası kinetik) kullanarak hemen adım 1.3.3. 3. analiz: Hücre numaralandırma Mikroplaka hücre numaralandırma yazılımını kullanarak nükleer floresans üzerinde temel hücre sayısını belirler. Ayarları, içinde Re-analizseçin ve Görüntü analiz ayarları içinde Kategori bölümünde Gizli nesne çözümleme 541 nesneleri bulmak için dalga boyu kullanarak seçin. Yöntem, bulgu görüntülerde çizmek kullanarak nesneleri bul seçeneği içinde çekirdek ayarları sekmesinde seçin ve Uygulatuşuna basın. Tamam ve okuma algoritması sayma hücre başlatmak için tuşuna basın. Alternatif olarak, böyle bir aracı kullanılabilir durumdaysa, hücreleri numaralandırmak için ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanın. ImageJ içinde bir yığın görüntü dosyasını açın. Yığın görüntü menü çubuğu, türü, üzerine getirin’ı tıklatarak 8 bit gri tonlamalı görüntülere dönüştürmek ve 8-bitseçin. Arka plan çıkarmak: tıklayın görüntü menü çubuğunda hover üzerinde ayarlamave Parlaklık/kontrastseçin. Arka plan gürültü çıkarmak ve Uygulaseçmek için en düşük değer ayarlayın. İkili görüntüler oluşturmak için eşik: menü çubuğunda tıklayın görüntü üzerinde ayarlamaüzerinde ve eşikseçin. Koyu arka planseçin, minimum ve maksimum eşik değerlerini ayarlayın ve Uygula’ yı tıklatın. Çekirdeklerin üst üste söz konusu olduğunda, bir dönüm noktası aracı segment çekirdekler için kullanılabilir. Menüde, ikili üzerine getirin işlemi ‘ ı tıklatın ve dönüm noktasıseçin.Not: Bu otomatik olarak bağlı çekirdeği ayıracak. Kullanıcı tarafından belirtilen ölçütü (boyut ve döngü) çekirdeği tanımlaması rafine ve hücre artıkları dışlamak için uygulama tarafından maskeli görüntüleri analiz. Analiz üzerinde menü ve ardından Çözümle parçacıklar’ yi tıklatın. İstediğiniz boyuta ayarla (piksel ^ 2) ve (1 değeri olan tam bir daire) Döngüsellik aralıkları tek tek hücreler/çekirdek dahil etmek yeterlidir. Göster açılır liste kutusunda, istediğiniz seçenekleri seçin, özetlemekontrol ve hücre sayısı elde etmek için Tamam ‘ ı tıklatın. 4. analiz: Kinetik eğrileri Kinetik plaka okuyucu yazılımı bir analitik veri yazılım baðlamanýz gerekebilir. Deneysel her koşul için çoğaltır karşılık gelen standart sapma ve deneysel her koşul için Ortalama, standart hata ile birlikte her timepoint, floresans yoğunluklarda ortalama. Deneysel her koşul için karşılık gelen kinetik eğrisi izleme: PI yoğunluğu (y ekseni) zaman (x ekseni) karşı. Verilen tedavi durumu resealing verimliliğini hesaplamak için (AUC) eğri altındaki alan hesaplamak + LLO M1 (AUC(M1)) ve + LLO m2 (AUC(M2)). Yeniden mühürlemeden verimliliğini (E) değerlendirmek için aşağıda önerilen yaklaşım kullanın: Verimlilik oranı (REff) aşağıda belirtilen malzemelerini kontrol ve test tedavi arasında bir karşılaştırma gerçekleştirir:REFF = 1, test tedavi onarım üzerinde hiçbir etkiye sahipREFF < 1, test tedavi engeller onarımREFF > 1, test tedavi artırır onarım Aşağıdaki denklemi kullanarak eğri altındaki alan hesaplar:, nerede k takipler toplam sayısı.

Representative Results

Doğruluk sayma hücre: HeLa hücreleri sık sık bir modeli memeli hücre satır olarak membran tamir mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. Membran onarım hücre nüfus düzeyinde değerlendirirken, aynı toplama için uygun verileri yorumlama bütün Wells, plaka hücrelere önemlidir. Tahlil zamanda cep numaraları kuyular arasında eşdeğer olduğunu doğrulamak önemlidir. Yapısal GFP (H2B-GFP) erimiş histon 2B hızlı HeLa hücreleri floresan onların çekirdekleri tespi…

Discussion

Bu tahlil membran hücre nüfus düzeyinde yüksek üretilen iş kapasitesi ile yeniden mühürlemeden etkinliğini ölçer. O-ebilmek var kullanılmış için hücresel bileşenleri veya membran onarım etkileyebilecek uyuşturucu kitaplıkları ekran. 96-şey plaka açıklanan tahlil kullanılan ama 384-şey plakalar için daha yüksek üretilen iş için uyarlanabilir. Floresans ölçümleri yapisan canlı hücreler aşırı hücre hücre dekolmanı, fiksasyon veya sonrası fiksasyon etiketleme floresans gibi işleme …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lütfen bazı ön deneyler için onun çok modlu algılama platformu kullanmak izin verdiğiniz için Dr Jesse Kwiek (Ohio Devlet Üniversitesi) anıyoruz. Bu makalesinde bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Stephanie Seveau için ödül numarası RO1AI107250 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O’Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Plasma Membrane ResealingHigh-throughputHeLa Cells96-well PlateFluorescencePropidium IodideKinetic AssayPlate ReaderOptical ConfigurationRead ModeRead Type

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lam, J. G., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image