Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre-hücre ya da hücre-patojen etkileşim içinde vivo analizini enfeksiyon bağışıklık yanıtının dinamiklerini anlamak önemli bir araçtır. İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) hücre etkileşimlerin gözlenmesi yaşayan hayvanlarda derin doku resim alma sırasında oluşturulan photobleaching en aza indirirken sağlar. Bugüne kadar farklı modeller için 2P-IVM lenfoid ve sigara lenfoid organlar tarif edilmistir. Ancak, bir meydan okuma hayvan solunum döngüsü ile ilişkili hareket nedeniyle solunum organlarının görüntüleme kalır.
Burada, in vivo bağışıklık hücre etkileşimlerde trakea 2 P-IVM kullanarak grip virüsü ile enfekte fareler görselleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu amaç için cerrahi pozlama ve nötrofil ve dendritik hücreler (DC) Mukozal epitel dinamik görüntülerini edinimi ardından trakea, entübasyon dahil özel bir görüntüleme platformu geliştirdi. Ayrıca, grip burunici enfeksiyon ve akış sitometrik bağışıklık hücrelerinin borusunda çözümlemesi için gereken adımları ayrıntılı. Son olarak, analiz ettik nötrofil ve DC hareketliliği gibi onların etkileşim bir film boyunca. Bu iletişim kuralı istikrarlı ve parlak 4 D görüntüleri oluşturmak için hücre-hücre etkileşimleri trakea değerlendirilmesi için gerekli sağlar.
Giriş
İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) içinde onların doğal çevre1oluştuğunda gibi hücre hücre etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme için etkili bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajlarından biri hücresel süreçler diğer geleneksel görüntüleme teknikleri2ile karşılaştırıldığında daha büyük bir örnek Derinlik (1 mm için 500 µm) adlı çalışması sağlanmıştır. Aynı anda iki fotonlu lazer tarafından oluşturulan iki düşük enerjili fotonlar kullanımı genellikle görüntü alma işlemi2ile ilgili doku fotoğraf-zarar en aza indirir. Son on yılda 2P-IVM hücre-hücre etkileşimleri çeşitli disiplinleri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan yordamlar içeren fareler İsviçre Federal veteriner dairesi yönergeleri ve hayvan iletişim kuralları uyarınca gerçekleştirilen yerel veteriner yetkilileri tarafından kabul edildi.
1. CD11c-YFP fareler grip enfeksiyonu
- Biyogüvenlik
Not: Adapte fare zorlanma (PR8) grip A/Puerto Rico/8/34 H1N1 döllenmiş yumurta büyüdü, saf ve yukarıda açıklanan21titre. Tüm enfekte hayvan ya da biyolojik örnekleri içeren merdiven were bir Biyogüvenlik Biyogüvenlik düzeyi (BSL) göre kabin altında 2 koşulları yürütülmektedir.- Biyogüvenlik kabini ile % 70 etanol çözüm temiz önce ve sonra enfek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, biz vivo içinde çalışmaya detaylı bir protokol nötrofil ve DC arasındaki etkileşimler ve hareket fare trakea (Şekil 3A) grip enfeksiyonu sırasında açıklanan. Bu amaçla, biz izole CFP+ nötrofil (% 92 saflık; Şekil 3B) CK6-ECFP fare ve biz adoptively onları grip ile enfekte bir CD11c-YFP fare içine transfer. Bundan sonra biz 2 P-IVM 3 gün özel dedektif, trakea, gerçekleştirilen Bu zaman noktada akı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma adoptively transfer edilen nötrofil ve ilişkileri ile DC geçişi grip enfeksiyon sırasında fare borusunda gösterilen 4 D görüntüleri nesil için detaylı bir Protokolü sunar. Açıklanan 2P-IVM modeli bir solunum yolları enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre dinamiği çalışmaya ilgili olacak.
Son zamanlarda, çeşitli modeller hücre dinamiği içinde solunum yolları görselleştirme göre gelişmiş9,10,11
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) hibe (176124, 145038 ve 148183), Avrupa Komisyonu Marie Curie Reintegration Grant (612742) ve SystemsX.ch D.U.P. için bir hibe için tarafından desteklenmiştir (2013/124).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü lke & Mayr GmbH | %4'lük çözelti | |
| CD11c-YFP fareleri | Jackson Laboratories | 008829 | fareleri şirket içinde yetiştirildi |
| CK6-ECFP fareleri | Jackson Laboratories | 004218 | fareleri şirket içinde yetiştirildi |
| 1x Dulbecco'nun Kalsiyum Korid ve Magnezyum Klorür | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco'nun Kalsiyum Korür ve Magnezyum Klorür olmadan modifiye edilmiş Fosfat Tamponlu Salin | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | 4 derecede saklayın; C |
| Ketamin Labatec Labatec | Pharma | 7680632310024 | RT'de saklayın, 4 & deg'de saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken |
| Rompun% 2 (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | RT'de saklayın, 4 derecede saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Mikro-İnce İnsülin Şırıngaları | BD | 324826 | |
| Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci | Corning | 352340 | |
| 2 mL Şırınga | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G iğneler | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (kateter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi | Costar | 3516 | |
| RPMI orta 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | 4 derece; C |
| Liberase TL Araştırma Sınıfı | Roche | 5401020001 | Mağazası -20 &°C; C / kollajenaz (I ve II) karışımı |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | -20 °C'de saklayın; C |
| CellTrace Menekşe lekesi | ThermoFisher Scientific | C34557 | -20 ° C'de saklayın; C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 10270-106 | -20 ° C'de saklayın; C |
| PE-10 Mikro Tıbbi Boru | 2Biyolojik Aletler SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Cerrahi Plastik Bant | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & RT | ||
| Hamuru | Ohropax | ||
| Yüksek Toleranslı Cam Lamel 15 mm Yuvarlak | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portatif Hayvan Anestezi Sistemi | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gazlı anestezi ve ısıtma tezgahı) | Tem Sega | ||
| CERRAHİ KURULU | Bern | ||
| TrimScope II İki fotonlu mikroskop | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lazerler | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 suya daldırma objektifi | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube & Kutu inkübasyon odası ve sıcaklık kontrolörü | Yaşam görüntüleme Hizmetleri | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Görüntüleme yazılımı | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | İstatistiksel yazılım |
Kaynaklar
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
