İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) içinde onların doğal çevre¹oluştuğunda gibi hücre hücre etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme için etkili bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajlarından biri hücresel süreçler diğer geleneksel görüntüleme teknikleri²ile karşılaştırıldığında daha büyük bir örnek Derinlik (1 mm için 500 µm) adlı çalışması sağlanmıştır. Aynı anda iki fotonlu lazer tarafından oluşturulan iki düşük enerjili fotonlar kullanımı genellikle görüntü alma işlemi²ile ilgili doku fotoğraf-zarar en aza indirir. Son on yılda 2P-IVM hücre-hücre etkileşimleri çeşitli disiplinleri^3,4,5farklı türde çalışma uygulandı. Bu çalışmalar kendi yüksek dinamizm ve tanınmış kişiler diğer hücreleri ve çevre tarafından oluşturulan sinyalleri takip oluşumu ile karakterizedir bağışıklık hücreleri araştırmak özellikle ilgili olmuştur. 2P-IVM da patojen ve ana bilgisayar⁶arasındaki etkileşimler çalışma uygulandı. Nitekim, daha önce bazı patojenlerin engelleyici, sonuç olarak, immün yanıt⁷bağışıklık hücreleri arasında temas süresi ve türünü değiştirebilirsiniz gösterilmiştir.

Hava yolu mukoza bağışıklık yanıtı havadan patojenlere karşı olduğu ilk sitesi⁸oluşturulan olduğunu. Bu nedenle, bu doku etkileşimlerde patojen-ana bilgisayar analizini vivo içinde konak savunma mekanizmaları başlatılması sırasında enfeksiyon anlamak için önemlidir. Ancak, 2P-IVM solunum yolları, özellikle resim alma sürecinin ödün vermez hayvan solunum döngüsü tarafından üretilen eserler nedeniyle zordur. Son zamanlarda, farklı cerrahi modelleri görüntüleme fare trakea^9,10,11,12 ve akciğerleri^13,14,15'^{anlatmıştık, 16}. Trakeal 2P-IVM modelleri akciğer-alveoller 2 P-IVM modelleri enfeksiyonların geç faz çalışmaya daha uygun olmakla birlikte üst solunum yolları, bağışıklık reaksiyonu başlangıç aşamasında görselleştirmek için mükemmel bir set-up temsil eder. Lazer optik penetrasyon kısıtlamak ve intrapulmonary airways mukozal tabakasının içinde vivo ^{17 görüntüleme için erişilmez hale hava dolu alveoller varlığı ile ilişkili bir sınırlama Gelişmiş akciğer modelleri mevcut} . Bunun tersi olarak, sürekli bir epitel tarafından kurulan trakea yapısını resim alma kolaylaştırır.

Burada, grip enfeksiyon, cerrahi hayvanlar hazırlanması ve 2 P-IVM trakea, gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını içeren bir protokolü mevcut. Buna ek olarak, belirli bir deneysel kurulum nötrofil ve dendritik hücreler (DC), grip virüsü¹⁸karşı^{,19 arabulucu savunma mekanizması olarak önemli bir rol oynamak iki bağışıklık hücre tipleri görselleştirme için tarif} . Son olarak, nötrofil-DC etkileşimleri analiz etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Bu kişiler DC harekete geçirmek modüle gösterilmiştir ve daha sonra patojenler²⁰karşı bağışıklık yanıtı etkileyecek.

Tüm hayvan yordamlar içeren fareler İsviçre Federal veteriner dairesi yönergeleri ve hayvan iletişim kuralları uyarınca gerçekleştirilen yerel veteriner yetkilileri tarafından kabul edildi.

1. CD11c-YFP fareler grip enfeksiyonu

1. Biyogüvenlik
   Not: Adapte fare zorlanma (PR8) grip A/Puerto Rico/8/34 H1N1 döllenmiş yumurta büyüdü, saf ve yukarıda açıklanan²¹titre. Tüm enfekte hayvan ya da biyolojik örnekleri içeren merdiven were bir Biyogüvenlik Biyogüvenlik düzeyi (BSL) göre kabin altında 2 koşulları yürütülmektedir.
   1. Biyogüvenlik kabini ile % 70 etanol çözüm temiz önce ve sonra enfeksiyon yordam.
   2. Aşağıdaki uygun kim Biyogüvenlik yönergeleri (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf) Bu işlem sırasında üretilen tüm atık maddeler atmak. Autoclavable depo gözlerindeki katı atık ve kirlenmiş sıvı plastik torbalarda % 70 etanol çözüm veya tıbbi dezenfektan ile dolu atın.
2. Grip burunici enfeksiyon
   NOT: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)²² C57BL/6J arka plan bu çalışmada kullanılmıştır. Fareler belirli patojen-Alerjik tesiste Araştırma Enstitüsü'nde Biyomedikal muhafaza.
   1. En fazla 5 yaş ve cinsiyet-eşlemeli (altı sekiz haftalık ') CD11c-YFP fareler kafesi yerleştirin. Fareler calıştıkları konut koşullarını daha önce enfeksiyon yordam için en az iki gün bekleyin.
   2. PR8 hisse senedi defrost ve soğuk 1 x 200 plak oluşturan birimler (PFU) son bir konsantrasyon elde etmek için Dulbecco'nın fosfat tampon serum kalsiyum klorür ve magnezyum klorür (PBS) değişiklik kullanarak karşılık gelen seyreltme 30 µL. tutun virüs seyreltme içinde hazırlamak Tüm prosedürü sırasında buz üzerinde.
      Not: titrasyon her toplu işleminin kullanımı önce grip virüsü kesin enfeksiyon doz emin olmak için tavsiye edilir.
   3. Ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) bir doz intraperitoneally enjekte (IP) 26 G iğne 1 mL şırınga kullanarak.
   4. Fare tamamen imzalat (tam kaybı iyileştiren ve pedal çekilme refleks) tamamlanana kadar bekleyin. Değil tamamen imzalat fareler yutmak veya enfeksiyon doz değişimler önde gelen virüs inoculum okuldan beri derin anestezi en uygun enfeksiyon için gereklidir.
   5. Sırtüstü pozisyonda yer imzalat fare. Virüs inoculum 15 µL toplamak. Fare sol burun deliği yakın pipet ucu yerleştirin ve viral inoculum damla damla dağıtmak. Damla inhale gerekir gibi onları doğrudan burun boşluğu içinde pipette değil.
   6. 2-5 dakika bekleyin ve virüs inoculum doğru burun içinde kalan 15 µL içeren pipet ucu yerleştirin.
      Not: boğulma önlemek için yaklaşık 20 s aralıklarla küçük boyutlu damla dağıtmak.
   7. Fare düzgün nefes kontrol ve yanal dekübitusiçinde bir kafese yerleştirin. Fare nefes ve anestezi kurtarma (yaklaşık 60 dakika sonra indüksiyon) izlemek.
      Not: 1'den fazla fare aynı zamanda enfekte mümkündür. Bu durumda, sırayla tüm fare sol burun içinde viral inoculum yönetmek, 2-5 dakika için bekleyin ve doğru burun deliği virüsü yönetmek. Bireyler arasında değişkenlik önlemek için aynı anda en fazla 3 fareler bulaştırmak.
   8. Hayvan sağlık durumu ve kilo kaybı her gün izlemek.
   9. Fareler tarafından yetki kuralları kararlı insana ilişkin son nokta göre ötenazi. Ötenazi yöntemi hayvan deney yetkilileri tarafından onaylanması gerekiyor ve yerel etik düzenlemelere uymak zorunda. İki fotonlu deneyler sonra ketamin/xylazine servikal çıkığı tarafından takip aşırı doz yönetimi tarafından fareler ötenazi. Diğer tüm deneyler içinde CO₂ inhalasyon ötenazi için bir yöntemi olarak kullanın.
      Not: virüs bulaşmış trakea, % 50 doku kültürü infektif doz (TCID50) tahlil veya gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu viral titreleri ölçmek için (RT-PCR) tahlil yukarıda açıklanan²³gerçekleştirilebilir.
3. Nötrofil istihdam trakea akış sitometresi tarafından değerlendirilmesi
   Not: Bu protokol isteğe bağlı bir parçasıdır. Bu grip enfeksiyonu takip trakeal mukozasında nötrofil işe alım değerlendirmek amaçlamaktadır.
   1. Virüslü ve bulaşmamış kontrol fareler, 3. gün sonrası enfeksiyon (özel dedektif) CO₂ inhalasyon tarafından ötenazi.
      Not: trakeal zarar görmesini önlemek için servikal çıkığı hayvanlara ötenazi için kullanmaktan kaçının. Ayrıca, perfüzyon euthanized farelerin kan nötrofil kirlenme önlemek için tavsiye edilir.
   2. Fare boyun % 70 etanol çözüm ile sprey ve bir cilt kesi çene için göğüs cerrahi makas kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
   3. Tükrük bezleri forseps kullanarak ayırın ve trakea bulaşmasına neden.
   4. Forseps ve makas kullanarak nefes borusu çevresindeki kaslar incelemek.
      Not: trakea işlem sırasında kolayca zarar görebilir bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
   5. Trakea forseps ile tutun ve yemek borusu diseksiyon tarafından dikkatle bağlantısını kesin.
   6. Trakea intratorasik parçası forseps ile tutarak, bir kesi bronş ağacının başında olun. Trakea gırtlak üzerinden bağlantısını kesin ve dikkatli bir şekilde çıkarın herhangi bir kas için yorum yaptı.
   7. Organ içeren RPMI 1640 + HEPES Orta (RPMI) buz üzerinde 1,5 mL tüp yerleştirin.
   8. 0,26 adet/mL collagenase (ı ve II) ve 0.2 mg/mL DNaz içeren trakea sindirim enzim karışımı hazırlayın ı RPMI.
   9. Enzim karışımı 1 mL içeren bir 6-şey plaka disseke borusunda bir yer.
   10. Org forseps ve makas yardımı ile küçük parçalar halinde kesin. Bu adımı sırasında plaka buz üzerinde tutun.
   11. 45 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Bu süre boyunca, plaka her 15dk sallamak.
   12. Enzim sindirim PBS içinde 1 mL FACS çamaşır arabelleği (2 mM EDTA ve % 2 ısı inaktive filtre sterilize fetal Sığır serum (FBS)) ekleyerek durdurmak.
   13. Doku kısmen sindirilmemiş parçalarını ilişkisini kaldırmak yardımcı olmak için 1 mL pipet ile çözüm resuspend.
   14. Çözüm için başka bir şey 40 µm süzgeç aracılığıyla içeriği geçirerek aktarın. Sonra yavaşça 2 mL şırınga lavabo pompası kullanarak süzgeç üstünde tepe-in tuzağa organ kalan parçalarını şut.
       Not: trakea kısmen sindirilmemiş parçaları süzgeç Smashing hücrelerinin en uygun bir numarası akış sitometrik çözümlemesi sırasında almak için kritik bir adımdır.
   15. Kuyu ve süzgeç FACS çamaşır ile tampon ve 5 mL tüp süspansiyon aktarım yıkama buz tuttu.
   16. 166 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 100 µL FACS çamaşır arabelleği hücrelerde resuspend.
   17. Antikor yüzey akış sitometresi için boyama ile devam edin. Kısaca, Fc reseptör bir antikor CD16/32, yüzey boyama tarafından takip karşı kullanarak izole hücre bloğu. Nötrofil doğru tanımlamak için akış sitometresi paneli aşağıdaki antikor içermelidir: αLy6G, αCD11b, αCD45 yanı sıra bir canlılık boya ölü hücreleri dışlamak için.
   18. Örnekleri tüm içeriği üzerinde bir akış sitometresi çalıştırmak ve verileri analiz.
       1. Bağışıklık hücreleri sayısı almak için değil 3000 olaylar/s yüksek bir hızda tek hücre süspansiyon çalıştırın. Bu satın alma sırasında dışlanan olayların sayısını azaltacaktır. Bu iletişim kuralını kullanan, 1 ila 2 milyon hücre trakea başına elde etmek mümkün olacaktır.

2. izolasyon ve enjeksiyon nötrofil

Not: Bu yordamda, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J fareler (CK6-ECFP) kullanılan²⁴olduğunu. Bu hayvanlar tüm hücre türleri'nin altında insan β-aktin organizatörü CFP ifade eder. Alternatif olarak, hücre ayırmak ve onları 2.6. adımda anlatılan protokolüne göre leke C57BL/6J fare kullanmak mümkündür. Arıtma ve nötrofil manipülasyon potansiyel göç ve fonksiyonel özelliklerini değiştirerek onların harekete geçirmek durum artabilir.

1. Hayvan CO₂ inhalasyon tarafından ötenazi.
2. Kalça ve yırtılmalarıteşhis çıkarmak ve nazikçe onları temiz forseps kullanarak.
3. Kemik epifizleri kesme ve kemik iliği buzda muhafaza 50 mL tüp içinde steril soğuk PBS ile dolu bir 1 mL şırınga kullanarak floş.
4. Hücreleri bir 18 G iğne ile resuspend ve hücre süspansiyon ile 40 mikron süzgeç filtre. Bir kez vasıl 110 x g 4 ° C'de 5 min için PBS ile yıkama ve 2 mL soğuk PBS hücrelerde resuspend.
5. % 100 oranında seyreltin Percoll 9:10 x PBS 1 ve percoll % 72, %64 ve % 52 1 x PBS kullanarak degrade çözümleri hazırlayın. Dikkatle her üç degradeler 15 mL tüp içinde 2 mL kat, en başlayan bir konsantre.
   1. Dikkatle 2 mL kemik iliği hücre süspansiyon gradyanlar ve santrifüj en üstünde, 1100 x g hızlanma ve fren olmadan (RT) Oda sıcaklığında 30 dakika için ekleyin.
6. Dikkatle %64 ve % 72 arasında arayüz band kaldırmak ve bir kez 200 x g 4 ° c soğuk PBS ile 5 min için de yıkayın. PBS 100 μL hacmi hücrelerde resuspend ve buz üzerinde tutun. Nötrofil saflığı 90 daha yüksek olması bekleniyor.
7. İsteğe bağlı olarak, etiket nötrofil üreticinin iletişim kuralını kullanarak bir hücre proliferasyonu kiti ile. 1 ml hacminde 10 mikron son bir konsantrasyon için hücre süspansiyon boya eklemek için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya ve (166 x g, 5 min) yıkayın.
8. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu tahmin etmek ve intravenöz 5 x 10⁶ hücrelerinde maksimum hacmi 100 μL görüntüleme önce 12 h bir 26 G iğne 1 mL şırınga kullanarak daha önce enfekte CD11c-YFP⁺ farelerde enjekte.

3. fareyi görüntüleme için hazırlanması

1. Anestezi
   1. 3. gün p.ı. Adım 1.2.3 göre enfekte CD11c-YFP⁺ fareler anestezi.
   2. Fareler derin anestezi sonra kateter yeniden anestezi dozaj için hazırlayın.
      1. 30 G iğne forseps kullanarak bir şırıngadan çıkarın.
      2. İğneyi PE-10 Tıbbi silikon tüp 20 cm parçasına takın.
      3. Tüp diğer tarafında ketamin/xylazine karışımı ile dolu bir 30 G iğne şırınga yerleştirin.
      4. Tüp içindeki hava kaldırmak.
   3. Bir tüp oksijen makine otomatik havalandırma (Şekil 1Aben) korumak için insufflating bağlı bir 20 G kateter hazırla. 130 vuruş / dakika (b.p.m.) nefes oranında 0.2 mL % 100 oksijen gaz kullanarak gelgit hacmi ile açık olarak ayarlayın.
2. Fare ameliyat için hazırlayın
   1. Isıtmalı bir tabak veya 37 ° C'de ameliyat her zaman için ayarla ısıtmalı bir cerrahi tezgah üzerinde fareyi belirli özelleştirilmiş cerrahi tahtası (Şekil 1AII-III) tutmak.
   2. Tıraş ve depilatory bir krem kullanarak fare boyun saç tıraş (Şekil 1Bı).
   3. Fareyi plastik fare üzerinde konumsal getirin (Şekil 1AII-a), pozisyonel dışında hayvan kafa tutmak (trakea entübasyon kolaylaştırır bir açı oluşturmak içinŞekil 1BII).
   4. Ön ayakları, pençeleri ve kuyruk cerrahi bant ile düzeltmek, fare gözleri bir A vitamini zenginleştirilmiş jel ile nemlendirin ve fare boyun (Şekil 1BII) dezenfekte.
3. Cerrahi
   1. Yani, makas, mikrocerrahi makas ve forseps düzgün autoclaved öğelerini hazırlayın.
   2. Boyun, yaklaşık 1 cm uzunluğunda, üst göğüs ve alt çene (Şekil 1BIII) daha düşük noktası üzerinden geçen çizgi arasındaki orta alanda uzun orta eksen üzerinde küçük bir insizyon attım gerçekleştirin.
   3. Yanal hareket deri yamalar ve tükürük bezleri ve kasları tarafından örtülü trakea görselleştirin. O zaman, dikkatlice forseps (Şekil 1BIII) kullanarak trakeal kas incelemek.
   4. Fare bir kateter ile entübasyon ve suni havalandırma (Şekil 1BIV) başlatın.
      Not: Kateter trakeal mukoza ve bir iç demir iğne koruyan bir dış plastik parçası, oluşur. İğne varlığını genişletmek ve trakea stabilize etmek üzere ve onun fuar düzenlemek için ideal bir çözüm temsil eder. Kateter aracılığıyla suni havalandırma fare doğru nefes garanti edecek.
   5. Nefes monitör fare için suni havalandırma başlamak hemen.
   6. Kateter yüksekliği ve belirli çubuk üzerinde cerrahi kurulu (Şekil 1AII-b) bağlı bir cerrahi kanca (Şekil 1Bv) kullanarak yönlendirmesi düzeltmek. Trakea çene aynı yükseklikte maruz.
   7. Trakea vazelin ile sarmak ve organ (Şekil 1BVI) için uygun hidrasyon güvence altına almak için önceden ısıtılmış PBS birkaç damla ile kaplayın.
   8. Coverslip hazırlık üzerine monte. Bu adımda, bir coverslip XYZ çevirmen (Şekil 1AII-c) vidalı bir metal kutusunda (Şekil 1BVII), tutkal. Coverslip cerrahi hazırlık üzerine yerleştirmek için XYZ çevirmen ayarlayın.
   9. İntraperitoneally anestezi yönetimi için kateter yerleştirin (Şekil 1BVIII).
   10. Ketamin/xylazine karışımı her 30 dakikada ilk doz % 50'si enjekte.
       Not: % 50 den başlayarak ilk ketamin/xylazine karışım % 25'e yeniden dozaj güvenli ve geçerli alternatif²⁵' tir. Ancak, bu iletişim kuralı terminal ve sıkı bir immobilizasyon hayvanın tüm prosedürü sırasında gerekli beri daha yüksek dozlarda derin cerrahi uçağa anestezi korumak için kullanın.

4. Vivo içinde zaman hata görüntüleme

Not: Resim alma iki Ti:Sa lazerler, ısı kontrollü kuluçka odası ve bir 25 X ile donatılmış bir dik iki fotonlu mikroskop ile gerçekleştirildi / NA 1.1 su daldırma amaç. Resim alma için kullanılan photomultipliers (PMT) hibrid dedektörleri veya yüksek hassasiyet GaAsP vardı.

1. Cerrahi kurulu imzalat fare ile (37-38 ° C önceden ısıtılmış) mikroskop kuluçka odası içine yerleştirin ve coverslip üzerinde bir damla su ekleyin.
2. Merkezi ve bul trakeal doku odaklanmak.
3. Tarama sıklığı 520 x 520 piksel, görüş alanı 440 x 440 μm kalınlığında² 800 Hz olarak ayarlayın ve içini kaplamak ortalama 1.
   1. Melodi Ti:Sa lazer 830 için kollajen, 150 bir kaynaktan gösterge bir güçle gelen ikinci harmonik üretimi (SHG) heyecanlandırmak için nm mW. İkinci Ti:Sa lazer 920, nağme ile 94 nm mW kaynağında CFP ve YFP heyecanlandırmak için.
   2. Kurulum 3D ve timelapse edinme moduyla aynı anda uyarma
      Not: lazer güçler photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek mümkün olduğunca düşük tutmak.
4. Sigara descanned modunda, ana Dikroik ayna 560, iki kanal kullanarak kayıt floresans nm. Bu protokol için kullanılan kurulum içinde ikinci bir Dikroik ayna 495, sinyal split nm ayırmak için Kanal 1 Kanal 2 (emisyon filtre 525/50) (emisyon filtre 475/50) (Şekil 2A). Bu yapılandırma SHG kollajen ilk kanal üzerinden ışık CFP emisyon her iki kanal 1 ve 2 toplanır ve YFP Kanal 2 sadece toplanan toplar.
5. Bir aralığı 50 mikron 3 mikron (voxel boyutu 0,86 mikron x 3 mikron) adım büyüklüğü ile Z ekseni boyunca tanımlayın. Kaydı görüntüler her 30 s 30 dk toplam süresi için.
6. İsterseniz, birden çok bölge elde etmek. Daha fazla satın almalar çalıştırmadan, yaşam belirtileri kontrol ve anestezi (bkz. Adım 3.3.10) gerekirse kateter aracılığıyla kanlarını.
7. Görüntüleme işleminin sonunda, fareyi ketamin/xylazine aşırı doz servikal çıkığı tarafından takip aracılığıyla ötenazi.

5. görüntü işleme ve nicel analiz nötrofil-DC hareketliliği ve etkileşim

Not: Bu protokol için özel bir görüntüleme yazılımı mikroskobu verileri analiz etmek için kullanıldı.

1. 4 D resim alma tamamlandıktan sonra bir iş istasyonunda yeterli Hesaplamalı kaynaklarla (veri ve meta veriler) dosya aktarımı (önerilen minimum sistem gereksinimleri: 32 GB RAM, hızlı solid-eyalet-Sürücüler, son CPU, GPU dayalı adanmış bir kitlesel paralel mimarisi).
2. Dosyaları görüntüleme yazılımı açın.
3. Belgili tanımlık video oyun ve hücreleri ilgi açıkça görülebilir ve görüntüleme eserler yok emin olun.
   Not: bu amaçla, her iki hareketin örnek ve parlaklık değişkenlik yeterince ki sınırlı doğrulayın. Gerçekten de, bunlar otomatik olarak analiz²⁶için sorunlar temsil etmektedir. Örnek bitişik Çerçeveler arasındaki hareketini aşırı örneğin SHG kanal sabit bir referans olarak kullanarak bir drift düzeltme yöntemini uygulayın. Bu hareket hücrelerin yerine örnek hareketi daha iyi ölçmek için sağlar. Ayrıca, parlak arka plan veya enkaz varlığında, hacim seçimi parametre olarak kullanarak yeniden oluşturulan yüzeyler Kuru Erik.
4. CFP ve kollajen (SHG) arasındaki sinyal ayırmak için CFP⁺ hücrelerin belirli bir ortak yerelleştirme kanal oluşturmak. Bu amaçla, sadece yeşil kanal ve mavi kanal olumlu bir yoğunluk sahip voxels seçen bir perdeleme Çokgen (Şekil 2Bben) gösterir.
   Not: Bu yordam hücreleri boyama ve mikroskop filtre kümesi göre değişebilir. Yeşil ve mavi kanal yeterli yoğunluğu ile sadece voxels seçerek elde edilebilir. Kullanılabilir araçlar arasında "coloc" işlevi colocalization kanallı yoğunluk eşik üzerinde otomatik olarak hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, makine öğrenme temelli yöntemleri için bu adım bir uzman²⁷gözetimi ile kullanılabilir.
5. Algılamak ve CFP⁺ hücreleri, otomatik yüzey yeniden kullanma ve izleme (Yüzey Aracı) uygun eş yerelleştirme kanal üzerinden izlemek.
   Not: El ile küratörlüğü nihai izleme hataları ve dışlama tanımlanmış eşiğin (Yani, 150 s)-ebilmek var olmak gerekli daha kısa bir süre ile parça.
6. CFP ve YFP sinyalleri ayırmak için CD11c-YFP⁺ hücrelerin belirli bir ortak yerelleştirme kanal oluşturmak. Bu amaçla, sadece yeşil kanal olumlu bir şiddeti oldu ama düşük yoğunluklu mavi kanal voxels seçen gating Çokgen (Şekil 2BII) gösterir.
   Not: temsilcisi Filmler Kanal 1, Kanal 2, CFP Co yerelleştirme kanal, YFP için ortak yerelleştirme kanal ve tüm kanalları bileşimini gelen sinyalleri gösterilen Şekil 2BIIIde bulunabilir.
7. Zaman içinde (Yüzey Aracı) konumlarını izlemek ve CD11c-YFP⁺ hücre yüzeyine yeniden.
   Not: El ile düzeltme nihai izleme hataları için bu adım gerekli değildir. Nitekim, DC karmaşık spatio-temporal dinamikleri nedeniyle, 2 P-IVM verilerden kesin yüzeyini yeniden inşa kullanılabilir bölümleme yazılımı ile elde edilemez zor bir görev olduğunu. Bu görevi zorlayıcı olun nedenleri arasında ince çıkıntılar ve parlaklık çeşitlemeleri filtreleri veya statik eşik yumuşatma gibi bazı görüntü işleme teknikleri kullanımı için izin vermez. Ayrıca, DC bir ağda, tek hücreler yalnızca 2 P-IVM veri kendi görünümünü temel alan ayırmak zordur. Bu nedenle, yerine için yazılım parametrelerinin ayarlanması tarafından doğru bir bölümleme denemeden, DC doğru olmayan yüzeyleri yeniden oluşturmak öneriyorum. Sonra olası hataları 5,8 içinde açıklandığı gibi sağlam ölçümleri yoluyla işlemek.
8. Ölçü birimi hücre göç.
   1. Klasik geçiş önlemler CFP⁺ ve CD11c-YFP⁺ hücreler için verin. "Doğruluk izlemek" hücreleri yön gösterirken bunlar arasında hücrelerin ortalama göçmen hız "parça hız demek" gösterir. Bu önlemlerin görüntüleme yazılımı bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarılabilir.
   2. Dışa aktarılan elektronik tablo dosyalarını "(düzeltilmiş doğumdan oranı olarak da adlandırılır) düzeltilmiş parça doğruluk" hesaplamak CFP⁺ ve CD11c-YFP⁺ hücreler için tanımlandığı "tarafından kare kökünü çarpılır parça doğruluk" olarak "süresi izlemek" bölünmüş video süresi tarafından kare kökünü. "Doğruluk kısa varlığında izlemek" izler Örneğin izleme hatalarından kaynaklanan²⁸, daha sağlam bir ölçüsüdür.
      Not: sadece aynı uzunlukta videoları bu ölçü ile karşılaştırılabilir.
9. Hücre etkileşim ölçmek.
   1. Onların mesafe (en yakın voxels) eşit veya daha az bir eşik daha (Yani, 2 mikron) ise CFP⁺ hücre ve CD11c-YFP⁺ hücre arasında bir kişiyi tanımlayın.
      Not: Bu eşik hücreleri yakın olduğunda bir kişiyi tespit etmek için yeterince sıkı olmalıdır. Ancak, bu eşik 0, ideal N kez Voksel RADIUS daha büyük daha büyük tutmak için tavsiye (N > 2), çünkü kenar yumuşatma hücreleri yeniden inşası gerçek hücre boyutu daha küçük yapabilirsiniz.
   2. Sayısı sayısı ve kişiler CFP⁺ ve CD11c-YFP⁺ hücreler arasındaki süre. Görüntüleme yazılımı bu örneğin bir "öp ve kaç" eklenti yürütmek yoluyla yapılabilir. Bu önlemlerin istatistikler sekmesindeki bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarılabilir.
10. İstatistiksel yazılım daha önce hesaplanan önlemler almak, araziler oluşturmak ve istatistiksel testler gerçekleştirmek.

Bu çalışmada, biz vivo içinde çalışmaya detaylı bir protokol nötrofil ve DC arasındaki etkileşimler ve hareket fare trakea (Şekil 3A) grip enfeksiyonu sırasında açıklanan. Bu amaçla, biz izole CFP+ nötrofil (% 92 saflık; Şekil 3B) CK6-ECFP fare ve biz adoptively onları grip ile enfekte bir CD11c-YFP fare içine transfer. Bundan sonra biz 2 P-IVM 3 gün özel dedektif, trakea, gerçekleştirilen Bu zaman noktada akış sitometrik çözümlemesi (Şekil 3 c) tarafından gösterildiği gibi açık işe alım Nötrofil enfekte alanı içinde gözlenen. 2P-IVM Protokolü kemirgenler (Şekil 1A) için belirli bir cerrahi Yönetim Kurulu ve bir oksijen Tedarikçi kullanımını gerektirir. Oksijen borusunda eklenen bir kanül aracılığıyla temin nefes, nefes borusu Fuar kolaylaştırdı ve (Şekil 1B) nefes ile ilişkili organ hareketi kontrol hayvan yardımcı oldu. Bu deneysel kurulumu, biz 30 dk (3D şekilFilm 1) döneminde virüslü trakea istikrarlı 4 D görüntüleri vivo içinde satın aldı.

Özel görüntüleme yazılımı hücrelerin göç ölçmek için ve nötrofil ve DC spatio-zamansal dinamiği ölçmek için izin alınan 4D resimlerle analizi. Hücre hareketliliği ile ilgili ikinci (Şekil 4A) daha önemli ölçüde daha hızlı bir hız gösterdi işe nötrofil ve DC hareketi arasında önemli farklılıklar görülmektedir. Bu sonuç dinamik yapısı son derece hareketli hücreler doğru bir chemoattractant kaynak29geçirme yeteneğine sahip olarak daha önce açıklanan nötrofil, onaylar. Yön ile ilgili, biz sırayla parça azalma süresi ve artan varyans ölçülen yönlü davranış (Şekil 4B) ile üretilen DC sık hataları izleme, hücredeki vermiştir o karmaşık morfolojisi sonucuna vardı. Bu nedenle, biz parça süresi göz önüne alınarak yön ölçmek mümkün sağlam bir ölçü hesaplanan. Bu ölçüm kullanarak, biz yön nötrofil vs DC (Şekil 4 c) önemli bir fark görülmektedir.

Ayrıca, nötrofil ve DC arasındaki mesafe hesaplama algılamak ve kişilerine zamanla çözümlemek için izin. Bu deneysel modelinde, biz herhangi bir kişiyi görüntülü döneminde (Şekil 4 d) formu değil birden çok-kısa rehber DC ve diğerleri ile oluşan bazı nötrofil gözlenen. Ayrıca, nötrofil ve DC arasındaki mesafe zaman içinde ortalama eğilim çalışma izin bize okudu hücreleri (Şekil 4E), genel konumlandırma eğitim belirli hücreleri ayırdetmek için izin eğilim incelenmesi sırasında her tek hücreli (Şekil 4FFilm 2) davranışını.

Şekil 1: ekipman ve adımları için 2P-IVM fare trakea,. (AI) Taşınabilir hayvan anestezi sistem otomatik havalandırma sorumlu fare oksijen sağlayan bir pompa bağlanır. Ön görünüm (bütün) ve yan görünüm (Aiii) trakeal modeli için kullanılan özel cerrahi kurulu. Yönetim Kurulu oluşan plastik fare pozisyonel ile metal bir sahne (bütün-a), çubuk hareketli kelepçe (bütün-b) tutmak için bir ve güzel bir akort XYZ çevirmen (bütün-c). (B) sıralı adımları trakeal cerrahi modeli: (bı) epilasyon cerrahi çevrenin (bıı) cerrahi masa, nefes borusu, (Biv (Bill) cerrahi Fuar imzalat fare konumlandırma ) bir sonda ile suni havalandırma, kateter fiksasyonu (Bv), PBS (BVI) ek olarak maruz kalan nefes borusu ile entübasyon coverslip ve bir kateter yerleşimini (Bviii) (Bvii) montajı anestezi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: floresan sinyal algılama sırasında 2P-IVM. Mikroskop algılama şematik gösterimi(a)filtre kurulum ve karşılık gelen kanalları. Dikroik ayna 560 nm ayıran mavi/yeşil kırmızı/uzak kırmızı emisyon üzerinden at. 495 ek Dikroik ayna nm daha fazla emisyon spektrumun farklı milletlere tanımak için kullanılır. Kanal 1 Kanal 2 kullanır yüksek hassasiyet GaAsP Devresel_ödeme (emisyon filtre 525/50) ise bir melez dedektörü (emisyon filtre 475/50), istihdam etmektedir. CFP (bı) ve YFP (bıı) fluorophores gelen sinyal tanımlaması için colocalization kanalları oluşturmada gating strateji gösterilen 2 P sinyal (B) temsilcisi dağılım nokta çizer. (Bill) Kanal 1 (Ch 1, koyu mavi), Kanal 2 (Ch 2, yeşil), ortak yerelleştirme kanal CFP (açık mavi) için Co yerelleştirme kanal YFP (sarı) için ve tüm kanalları bileşimini belirli sinyalleri gösterilen temsilcisi Filmler (Ch 1 + Ch 2 + CFP + YFP). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: nötrofiller ve DC Intravital 4D görüntülemede bir grip bulaşmış trakea. (A)iletişim kuralının şematik anahat. (B) temsilcisi akış sitometrik scatterplot nötrofil yüzdesi toplam CD45 + hücrelerde fare kemik iliği Percoll degrade yöntemle izole bir hücre süspansiyon ile ilgili olarak gösteriliyor. (C) temsilcisi akış sitometrik scatterplots bir artış nötrofil tracheas içinde sıklıkla hastalık bulaşmamış tek fare gün 3 özel dedektif (D) (sol panelde) anatomik görüntüsünü bir fare, grip virüsü ile enfekte fareler karşılaştırıldığında üzerinden gösterilen resim alma için seçili alanı gösterilen nefes borusu. (Doğru kapı aynası) P.ı. SHG sinyal karanlıkta mavi gösterilir nötrofil (açık mavi) ve DC (sarı) yüzey yeniden izlerini günde 3 ile birlikte gösterilen 2 P-IVM test temsilcisi 3D projeksiyon. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: nötrofil ve enfekte grip trakea DC göç ve etkileşim dinamiklerini karakterizasyonu. Parça hız gösterilen temsilcisi araziler(a)demek, doğruluk (B) izlemek ve parça doğruluk (C), (2009)28, nötrofil ve nefes borusu ile 3 gün özel dedektif, DC Beltman ve meslektaşları tarafından tanımlanan düzeltildi grip virüsü. Düzeltilmiş parça doğruluk ölçüm hataları izleme için sağlamlık sergiler. (D) 2D çubuk grafik nötrofil DC ve temas süresi olan kişileri kendi sayısına göre sıklığı gösterilen. Filmin süresi sırasında en yakın etki alanı denetleyicisinin nötrofil (E) ortalama mesafe. Bir temsilcisi en yakın etki alanı denetleyicisinin zamanında nötrofil mesafe Analizi (F) (solda). Noktalı kırmızı çizgi bir nötrofil bir DC bir kişiyle kurulan düşünmeye mesafe eşik belirtir. (Doğru i-III) Bir nötrofil (açık mavi) geçiş doğru bir DC (sarı) temsil eden farklı zaman noktalarda alınan filmler. Hücre parça rengi maviden kırmızıya saati göstermek değişir çok renkli bir çizgi olarak gösterilir. Fibrillary kollajen SHG sinyal koyu mavi renkte gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bütün rakamlar en az üç bağımsız deneyler temsilcisi sunulan verilerdir. Sonuçları, demek gibi ± SD istatistikleri Welch test tarafından verilir. NS p > 0,05; p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Film 1: nötrofil ve DC trakea grip enfeksiyonu sırasında dinamiklerini. etkileşim dynamics nötrofil (açık mavi) ve DC (sarı) yanı sıra kendi izlerini trakea kollajen ağ (koyu mavi) ile ilgili olarak arasında gösterilen 30 dk hızlandırılmış 3D görüntü. Temsilcisi nötrofil-DC etkileşimleri Beyaz oklarla belirtilmiştir. Hücre parça rengi maviden kırmızıya saati göstermek değişir çok renkli bir çizgi olarak gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2: temsilcisi kısa vadeli nötrofil-DC etkileşiminde trakea grip enfeksiyonu sırasında. bir nötrofil (açık mavi) ve bir DC arasında temsili bir etkileşim (sarı) gösterilen 30 dk hızlandırılmış 3D görüntü ve ilgili izlerini. Hücre parça rengi maviden kırmızıya saati göstermek değişir çok renkli bir çizgi olarak gösterilir. Kollajen SHG sinyal koyu mavi renkte gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm. lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar ifşa gerek yok.