Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

17 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

Özet

Hücre-hücre ya da hücre-patojen etkileşim içinde vivo analizini enfeksiyon bağışıklık yanıtının dinamiklerini anlamak önemli bir araçtır. İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) hücre etkileşimlerin gözlenmesi yaşayan hayvanlarda derin doku resim alma sırasında oluşturulan photobleaching en aza indirirken sağlar. Bugüne kadar farklı modeller için 2P-IVM lenfoid ve sigara lenfoid organlar tarif edilmistir. Ancak, bir meydan okuma hayvan solunum döngüsü ile ilişkili hareket nedeniyle solunum organlarının görüntüleme kalır.

Burada, in vivo bağışıklık hücre etkileşimlerde trakea 2 P-IVM kullanarak grip virüsü ile enfekte fareler görselleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu amaç için cerrahi pozlama ve nötrofil ve dendritik hücreler (DC) Mukozal epitel dinamik görüntülerini edinimi ardından trakea, entübasyon dahil özel bir görüntüleme platformu geliştirdi. Ayrıca, grip burunici enfeksiyon ve akış sitometrik bağışıklık hücrelerinin borusunda çözümlemesi için gereken adımları ayrıntılı. Son olarak, analiz ettik nötrofil ve DC hareketliliği gibi onların etkileşim bir film boyunca. Bu iletişim kuralı istikrarlı ve parlak 4 D görüntüleri oluşturmak için hücre-hücre etkileşimleri trakea değerlendirilmesi için gerekli sağlar.

Giriş

İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) içinde onların doğal çevre1oluştuğunda gibi hücre hücre etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme için etkili bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajlarından biri hücresel süreçler diğer geleneksel görüntüleme teknikleri2ile karşılaştırıldığında daha büyük bir örnek Derinlik (1 mm için 500 µm) adlı çalışması sağlanmıştır. Aynı anda iki fotonlu lazer tarafından oluşturulan iki düşük enerjili fotonlar kullanımı genellikle görüntü alma işlemi2ile ilgili doku fotoğraf-zarar en aza indirir. Son on yılda 2P-IVM hücre-hücre etkileşimleri çeşitli disiplinleri3,4,5farklı türde çalışma uygulandı. Bu çalışmalar kendi yüksek dinamizm ve tanınmış kişiler diğer hücreleri ve çevre tarafından oluşturulan sinyalleri takip oluşumu ile karakterizedir bağışıklık hücreleri araştırmak özellikle ilgili olmuştur. 2P-IVM da patojen ve ana bilgisayar6arasındaki etkileşimler çalışma uygulandı. Nitekim, daha önce bazı patojenlerin engelleyici, sonuç olarak, immün yanıt7bağışıklık hücreleri arasında temas süresi ve türünü değiştirebilirsiniz gösterilmiştir.

Hava yolu mukoza bağışıklık yanıtı havadan patojenlere karşı olduğu ilk sitesi8oluşturulan olduğunu. Bu nedenle, bu doku etkileşimlerde patojen-ana bilgisayar analizini vivo içinde konak savunma mekanizmaları başlatılması sırasında enfeksiyon anlamak için önemlidir. Ancak, 2P-IVM solunum yolları, özellikle resim alma sürecinin ödün vermez hayvan solunum döngüsü tarafından üretilen eserler nedeniyle zordur. Son zamanlarda, farklı cerrahi modelleri görüntüleme fare trakea9,10,11,12 ve akciğerleri13,14,15'anlatmıştık, 16. Trakeal 2P-IVM modelleri akciğer-alveoller 2 P-IVM modelleri enfeksiyonların geç faz çalışmaya daha uygun olmakla birlikte üst solunum yolları, bağışıklık reaksiyonu başlangıç aşamasında görselleştirmek için mükemmel bir set-up temsil eder. Lazer optik penetrasyon kısıtlamak ve intrapulmonary airways mukozal tabakasının içinde vivo 17 görüntüleme için erişilmez hale hava dolu alveoller varlığı ile ilişkili bir sınırlama Gelişmiş akciğer modelleri mevcut . Bunun tersi olarak, sürekli bir epitel tarafından kurulan trakea yapısını resim alma kolaylaştırır.

Burada, grip enfeksiyon, cerrahi hayvanlar hazırlanması ve 2 P-IVM trakea, gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını içeren bir protokolü mevcut. Buna ek olarak, belirli bir deneysel kurulum nötrofil ve dendritik hücreler (DC), grip virüsü18karşı,19 arabulucu savunma mekanizması olarak önemli bir rol oynamak iki bağışıklık hücre tipleri görselleştirme için tarif . Son olarak, nötrofil-DC etkileşimleri analiz etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Bu kişiler DC harekete geçirmek modüle gösterilmiştir ve daha sonra patojenler20karşı bağışıklık yanıtı etkileyecek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan yordamlar içeren fareler İsviçre Federal veteriner dairesi yönergeleri ve hayvan iletişim kuralları uyarınca gerçekleştirilen yerel veteriner yetkilileri tarafından kabul edildi.

1. CD11c-YFP fareler grip enfeksiyonu

  1. Biyogüvenlik
    Not: Adapte fare zorlanma (PR8) grip A/Puerto Rico/8/34 H1N1 döllenmiş yumurta büyüdü, saf ve yukarıda açıklanan21titre. Tüm enfekte hayvan ya da biyolojik örnekleri içeren merdiven were bir Biyogüvenlik Biyogüvenlik düzeyi (BSL) göre kabin altında 2 koşulları yürütülmektedir.
    1. Biyogüvenlik kabini ile % 70 etanol çözüm temiz önce ve sonra enfeksiyon yordam.
    2. Aşağıdaki uygun kim Biyogüvenlik yönergeleri (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf) Bu işlem sırasında üretilen tüm atık maddeler atmak. Autoclavable depo gözlerindeki katı atık ve kirlenmiş sıvı plastik torbalarda % 70 etanol çözüm veya tıbbi dezenfektan ile dolu atın.
  2. Grip burunici enfeksiyon
    NOT: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 C57BL/6J arka plan bu çalışmada kullanılmıştır. Fareler belirli patojen-Alerjik tesiste Araştırma Enstitüsü'nde Biyomedikal muhafaza.
    1. En fazla 5 yaş ve cinsiyet-eşlemeli (altı sekiz haftalık ') CD11c-YFP fareler kafesi yerleştirin. Fareler calıştıkları konut koşullarını daha önce enfeksiyon yordam için en az iki gün bekleyin.
    2. PR8 hisse senedi defrost ve soğuk 1 x 200 plak oluşturan birimler (PFU) son bir konsantrasyon elde etmek için Dulbecco'nın fosfat tampon serum kalsiyum klorür ve magnezyum klorür (PBS) değişiklik kullanarak karşılık gelen seyreltme 30 µL. tutun virüs seyreltme içinde hazırlamak Tüm prosedürü sırasında buz üzerinde.
      Not: titrasyon her toplu işleminin kullanımı önce grip virüsü kesin enfeksiyon doz emin olmak için tavsiye edilir.
    3. Ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) bir doz intraperitoneally enjekte (IP) 26 G iğne 1 mL şırınga kullanarak.
    4. Fare tamamen imzalat (tam kaybı iyileştiren ve pedal çekilme refleks) tamamlanana kadar bekleyin. Değil tamamen imzalat fareler yutmak veya enfeksiyon doz değişimler önde gelen virüs inoculum okuldan beri derin anestezi en uygun enfeksiyon için gereklidir.
    5. Sırtüstü pozisyonda yer imzalat fare. Virüs inoculum 15 µL toplamak. Fare sol burun deliği yakın pipet ucu yerleştirin ve viral inoculum damla damla dağıtmak. Damla inhale gerekir gibi onları doğrudan burun boşluğu içinde pipette değil.
    6. 2-5 dakika bekleyin ve virüs inoculum doğru burun içinde kalan 15 µL içeren pipet ucu yerleştirin.
      Not: boğulma önlemek için yaklaşık 20 s aralıklarla küçük boyutlu damla dağıtmak.
    7. Fare düzgün nefes kontrol ve yanal dekübitusiçinde bir kafese yerleştirin. Fare nefes ve anestezi kurtarma (yaklaşık 60 dakika sonra indüksiyon) izlemek.
      Not: 1'den fazla fare aynı zamanda enfekte mümkündür. Bu durumda, sırayla tüm fare sol burun içinde viral inoculum yönetmek, 2-5 dakika için bekleyin ve doğru burun deliği virüsü yönetmek. Bireyler arasında değişkenlik önlemek için aynı anda en fazla 3 fareler bulaştırmak.
    8. Hayvan sağlık durumu ve kilo kaybı her gün izlemek.
    9. Fareler tarafından yetki kuralları kararlı insana ilişkin son nokta göre ötenazi. Ötenazi yöntemi hayvan deney yetkilileri tarafından onaylanması gerekiyor ve yerel etik düzenlemelere uymak zorunda. İki fotonlu deneyler sonra ketamin/xylazine servikal çıkığı tarafından takip aşırı doz yönetimi tarafından fareler ötenazi. Diğer tüm deneyler içinde CO2 inhalasyon ötenazi için bir yöntemi olarak kullanın.
      Not: virüs bulaşmış trakea, % 50 doku kültürü infektif doz (TCID50) tahlil veya gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu viral titreleri ölçmek için (RT-PCR) tahlil yukarıda açıklanan23gerçekleştirilebilir.
  3. Nötrofil istihdam trakea akış sitometresi tarafından değerlendirilmesi
    Not: Bu protokol isteğe bağlı bir parçasıdır. Bu grip enfeksiyonu takip trakeal mukozasında nötrofil işe alım değerlendirmek amaçlamaktadır.
    1. Virüslü ve bulaşmamış kontrol fareler, 3. gün sonrası enfeksiyon (özel dedektif) CO2 inhalasyon tarafından ötenazi.
      Not: trakeal zarar görmesini önlemek için servikal çıkığı hayvanlara ötenazi için kullanmaktan kaçının. Ayrıca, perfüzyon euthanized farelerin kan nötrofil kirlenme önlemek için tavsiye edilir.
    2. Fare boyun % 70 etanol çözüm ile sprey ve bir cilt kesi çene için göğüs cerrahi makas kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
    3. Tükrük bezleri forseps kullanarak ayırın ve trakea bulaşmasına neden.
    4. Forseps ve makas kullanarak nefes borusu çevresindeki kaslar incelemek.
      Not: trakea işlem sırasında kolayca zarar görebilir bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
    5. Trakea forseps ile tutun ve yemek borusu diseksiyon tarafından dikkatle bağlantısını kesin.
    6. Trakea intratorasik parçası forseps ile tutarak, bir kesi bronş ağacının başında olun. Trakea gırtlak üzerinden bağlantısını kesin ve dikkatli bir şekilde çıkarın herhangi bir kas için yorum yaptı.
    7. Organ içeren RPMI 1640 + HEPES Orta (RPMI) buz üzerinde 1,5 mL tüp yerleştirin.
    8. 0,26 adet/mL collagenase (ı ve II) ve 0.2 mg/mL DNaz içeren trakea sindirim enzim karışımı hazırlayın ı RPMI.
    9. Enzim karışımı 1 mL içeren bir 6-şey plaka disseke borusunda bir yer.
    10. Org forseps ve makas yardımı ile küçük parçalar halinde kesin. Bu adımı sırasında plaka buz üzerinde tutun.
    11. 45 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Bu süre boyunca, plaka her 15dk sallamak.
    12. Enzim sindirim PBS içinde 1 mL FACS çamaşır arabelleği (2 mM EDTA ve % 2 ısı inaktive filtre sterilize fetal Sığır serum (FBS)) ekleyerek durdurmak.
    13. Doku kısmen sindirilmemiş parçalarını ilişkisini kaldırmak yardımcı olmak için 1 mL pipet ile çözüm resuspend.
    14. Çözüm için başka bir şey 40 µm süzgeç aracılığıyla içeriği geçirerek aktarın. Sonra yavaşça 2 mL şırınga lavabo pompası kullanarak süzgeç üstünde tepe-in tuzağa organ kalan parçalarını şut.
      Not: trakea kısmen sindirilmemiş parçaları süzgeç Smashing hücrelerinin en uygun bir numarası akış sitometrik çözümlemesi sırasında almak için kritik bir adımdır.
    15. Kuyu ve süzgeç FACS çamaşır ile tampon ve 5 mL tüp süspansiyon aktarım yıkama buz tuttu.
    16. 166 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 100 µL FACS çamaşır arabelleği hücrelerde resuspend.
    17. Antikor yüzey akış sitometresi için boyama ile devam edin. Kısaca, Fc reseptör bir antikor CD16/32, yüzey boyama tarafından takip karşı kullanarak izole hücre bloğu. Nötrofil doğru tanımlamak için akış sitometresi paneli aşağıdaki antikor içermelidir: αLy6G, αCD11b, αCD45 yanı sıra bir canlılık boya ölü hücreleri dışlamak için.
    18. Örnekleri tüm içeriği üzerinde bir akış sitometresi çalıştırmak ve verileri analiz.
      1. Bağışıklık hücreleri sayısı almak için değil 3000 olaylar/s yüksek bir hızda tek hücre süspansiyon çalıştırın. Bu satın alma sırasında dışlanan olayların sayısını azaltacaktır. Bu iletişim kuralını kullanan, 1 ila 2 milyon hücre trakea başına elde etmek mümkün olacaktır.

2. izolasyon ve enjeksiyon nötrofil

Not: Bu yordamda, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J fareler (CK6-ECFP) kullanılan24olduğunu. Bu hayvanlar tüm hücre türleri'nin altında insan β-aktin organizatörü CFP ifade eder. Alternatif olarak, hücre ayırmak ve onları 2.6. adımda anlatılan protokolüne göre leke C57BL/6J fare kullanmak mümkündür. Arıtma ve nötrofil manipülasyon potansiyel göç ve fonksiyonel özelliklerini değiştirerek onların harekete geçirmek durum artabilir.

  1. Hayvan CO2 inhalasyon tarafından ötenazi.
  2. Kalça ve yırtılmalarıteşhis çıkarmak ve nazikçe onları temiz forseps kullanarak.
  3. Kemik epifizleri kesme ve kemik iliği buzda muhafaza 50 mL tüp içinde steril soğuk PBS ile dolu bir 1 mL şırınga kullanarak floş.
  4. Hücreleri bir 18 G iğne ile resuspend ve hücre süspansiyon ile 40 mikron süzgeç filtre. Bir kez vasıl 110 x g 4 ° C'de 5 min için PBS ile yıkama ve 2 mL soğuk PBS hücrelerde resuspend.
  5. % 100 oranında seyreltin Percoll 9:10 x PBS 1 ve percoll % 72, %64 ve % 52 1 x PBS kullanarak degrade çözümleri hazırlayın. Dikkatle her üç degradeler 15 mL tüp içinde 2 mL kat, en başlayan bir konsantre.
    1. Dikkatle 2 mL kemik iliği hücre süspansiyon gradyanlar ve santrifüj en üstünde, 1100 x g hızlanma ve fren olmadan (RT) Oda sıcaklığında 30 dakika için ekleyin.
  6. Dikkatle %64 ve % 72 arasında arayüz band kaldırmak ve bir kez 200 x g 4 ° c soğuk PBS ile 5 min için de yıkayın. PBS 100 μL hacmi hücrelerde resuspend ve buz üzerinde tutun. Nötrofil saflığı 90 daha yüksek olması bekleniyor.
  7. İsteğe bağlı olarak, etiket nötrofil üreticinin iletişim kuralını kullanarak bir hücre proliferasyonu kiti ile. 1 ml hacminde 10 mikron son bir konsantrasyon için hücre süspansiyon boya eklemek için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya ve (166 x g, 5 min) yıkayın.
  8. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu tahmin etmek ve intravenöz 5 x 106 hücrelerinde maksimum hacmi 100 μL görüntüleme önce 12 h bir 26 G iğne 1 mL şırınga kullanarak daha önce enfekte CD11c-YFP+ farelerde enjekte.

3. fareyi görüntüleme için hazırlanması

  1. Anestezi
    1. 3. gün p.ı. Adım 1.2.3 göre enfekte CD11c-YFP+ fareler anestezi.
    2. Fareler derin anestezi sonra kateter yeniden anestezi dozaj için hazırlayın.
      1. 30 G iğne forseps kullanarak bir şırıngadan çıkarın.
      2. İğneyi PE-10 Tıbbi silikon tüp 20 cm parçasına takın.
      3. Tüp diğer tarafında ketamin/xylazine karışımı ile dolu bir 30 G iğne şırınga yerleştirin.
      4. Tüp içindeki hava kaldırmak.
    3. Bir tüp oksijen makine otomatik havalandırma (Şekil 1Aben) korumak için insufflating bağlı bir 20 G kateter hazırla. 130 vuruş / dakika (b.p.m.) nefes oranında 0.2 mL % 100 oksijen gaz kullanarak gelgit hacmi ile açık olarak ayarlayın.
  2. Fare ameliyat için hazırlayın
    1. Isıtmalı bir tabak veya 37 ° C'de ameliyat her zaman için ayarla ısıtmalı bir cerrahi tezgah üzerinde fareyi belirli özelleştirilmiş cerrahi tahtası (Şekil 1AII-III) tutmak.
    2. Tıraş ve depilatory bir krem kullanarak fare boyun saç tıraş (Şekil 1Bı).
    3. Fareyi plastik fare üzerinde konumsal getirin (Şekil 1AII-a), pozisyonel dışında hayvan kafa tutmak (trakea entübasyon kolaylaştırır bir açı oluşturmak içinŞekil 1BII).
    4. Ön ayakları, pençeleri ve kuyruk cerrahi bant ile düzeltmek, fare gözleri bir A vitamini zenginleştirilmiş jel ile nemlendirin ve fare boyun (Şekil 1BII) dezenfekte.
  3. Cerrahi
    1. Yani, makas, mikrocerrahi makas ve forseps düzgün autoclaved öğelerini hazırlayın.
    2. Boyun, yaklaşık 1 cm uzunluğunda, üst göğüs ve alt çene (Şekil 1BIII) daha düşük noktası üzerinden geçen çizgi arasındaki orta alanda uzun orta eksen üzerinde küçük bir insizyon attım gerçekleştirin.
    3. Yanal hareket deri yamalar ve tükürük bezleri ve kasları tarafından örtülü trakea görselleştirin. O zaman, dikkatlice forseps (Şekil 1BIII) kullanarak trakeal kas incelemek.
    4. Fare bir kateter ile entübasyon ve suni havalandırma (Şekil 1BIV) başlatın.
      Not: Kateter trakeal mukoza ve bir iç demir iğne koruyan bir dış plastik parçası, oluşur. İğne varlığını genişletmek ve trakea stabilize etmek üzere ve onun fuar düzenlemek için ideal bir çözüm temsil eder. Kateter aracılığıyla suni havalandırma fare doğru nefes garanti edecek.
    5. Nefes monitör fare için suni havalandırma başlamak hemen.
    6. Kateter yüksekliği ve belirli çubuk üzerinde cerrahi kurulu (Şekil 1AII-b) bağlı bir cerrahi kanca (Şekil 1Bv) kullanarak yönlendirmesi düzeltmek. Trakea çene aynı yükseklikte maruz.
    7. Trakea vazelin ile sarmak ve organ (Şekil 1BVI) için uygun hidrasyon güvence altına almak için önceden ısıtılmış PBS birkaç damla ile kaplayın.
    8. Coverslip hazırlık üzerine monte. Bu adımda, bir coverslip XYZ çevirmen (Şekil 1AII-c) vidalı bir metal kutusunda (Şekil 1BVII), tutkal. Coverslip cerrahi hazırlık üzerine yerleştirmek için XYZ çevirmen ayarlayın.
    9. İntraperitoneally anestezi yönetimi için kateter yerleştirin (Şekil 1BVIII).
    10. Ketamin/xylazine karışımı her 30 dakikada ilk doz % 50'si enjekte.
      Not: % 50 den başlayarak ilk ketamin/xylazine karışım % 25'e yeniden dozaj güvenli ve geçerli alternatif25' tir. Ancak, bu iletişim kuralı terminal ve sıkı bir immobilizasyon hayvanın tüm prosedürü sırasında gerekli beri daha yüksek dozlarda derin cerrahi uçağa anestezi korumak için kullanın.

4. Vivo içinde zaman hata görüntüleme

Not: Resim alma iki Ti:Sa lazerler, ısı kontrollü kuluçka odası ve bir 25 X ile donatılmış bir dik iki fotonlu mikroskop ile gerçekleştirildi / NA 1.1 su daldırma amaç. Resim alma için kullanılan photomultipliers (PMT) hibrid dedektörleri veya yüksek hassasiyet GaAsP vardı.

  1. Cerrahi kurulu imzalat fare ile (37-38 ° C önceden ısıtılmış) mikroskop kuluçka odası içine yerleştirin ve coverslip üzerinde bir damla su ekleyin.
  2. Merkezi ve bul trakeal doku odaklanmak.
  3. Tarama sıklığı 520 x 520 piksel, görüş alanı 440 x 440 μm kalınlığında2 800 Hz olarak ayarlayın ve içini kaplamak ortalama 1.
    1. Melodi Ti:Sa lazer 830 için kollajen, 150 bir kaynaktan gösterge bir güçle gelen ikinci harmonik üretimi (SHG) heyecanlandırmak için nm mW. İkinci Ti:Sa lazer 920, nağme ile 94 nm mW kaynağında CFP ve YFP heyecanlandırmak için.
    2. Kurulum 3D ve timelapse edinme moduyla aynı anda uyarma
      Not: lazer güçler photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek mümkün olduğunca düşük tutmak.
  4. Sigara descanned modunda, ana Dikroik ayna 560, iki kanal kullanarak kayıt floresans nm. Bu protokol için kullanılan kurulum içinde ikinci bir Dikroik ayna 495, sinyal split nm ayırmak için Kanal 1 Kanal 2 (emisyon filtre 525/50) (emisyon filtre 475/50) (Şekil 2A). Bu yapılandırma SHG kollajen ilk kanal üzerinden ışık CFP emisyon her iki kanal 1 ve 2 toplanır ve YFP Kanal 2 sadece toplanan toplar.
  5. Bir aralığı 50 mikron 3 mikron (voxel boyutu 0,86 mikron x 3 mikron) adım büyüklüğü ile Z ekseni boyunca tanımlayın. Kaydı görüntüler her 30 s 30 dk toplam süresi için.
  6. İsterseniz, birden çok bölge elde etmek. Daha fazla satın almalar çalıştırmadan, yaşam belirtileri kontrol ve anestezi (bkz. Adım 3.3.10) gerekirse kateter aracılığıyla kanlarını.
  7. Görüntüleme işleminin sonunda, fareyi ketamin/xylazine aşırı doz servikal çıkığı tarafından takip aracılığıyla ötenazi.

5. görüntü işleme ve nicel analiz nötrofil-DC hareketliliği ve etkileşim

Not: Bu protokol için özel bir görüntüleme yazılımı mikroskobu verileri analiz etmek için kullanıldı.

  1. 4 D resim alma tamamlandıktan sonra bir iş istasyonunda yeterli Hesaplamalı kaynaklarla (veri ve meta veriler) dosya aktarımı (önerilen minimum sistem gereksinimleri: 32 GB RAM, hızlı solid-eyalet-Sürücüler, son CPU, GPU dayalı adanmış bir kitlesel paralel mimarisi).
  2. Dosyaları görüntüleme yazılımı açın.
  3. Belgili tanımlık video oyun ve hücreleri ilgi açıkça görülebilir ve görüntüleme eserler yok emin olun.
    Not: bu amaçla, her iki hareketin örnek ve parlaklık değişkenlik yeterince ki sınırlı doğrulayın. Gerçekten de, bunlar otomatik olarak analiz26için sorunlar temsil etmektedir. Örnek bitişik Çerçeveler arasındaki hareketini aşırı örneğin SHG kanal sabit bir referans olarak kullanarak bir drift düzeltme yöntemini uygulayın. Bu hareket hücrelerin yerine örnek hareketi daha iyi ölçmek için sağlar. Ayrıca, parlak arka plan veya enkaz varlığında, hacim seçimi parametre olarak kullanarak yeniden oluşturulan yüzeyler Kuru Erik.
  4. CFP ve kollajen (SHG) arasındaki sinyal ayırmak için CFP+ hücrelerin belirli bir ortak yerelleştirme kanal oluşturmak. Bu amaçla, sadece yeşil kanal ve mavi kanal olumlu bir yoğunluk sahip voxels seçen bir perdeleme Çokgen (Şekil 2Bben) gösterir.
    Not: Bu yordam hücreleri boyama ve mikroskop filtre kümesi göre değişebilir. Yeşil ve mavi kanal yeterli yoğunluğu ile sadece voxels seçerek elde edilebilir. Kullanılabilir araçlar arasında "coloc" işlevi colocalization kanallı yoğunluk eşik üzerinde otomatik olarak hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, makine öğrenme temelli yöntemleri için bu adım bir uzman27gözetimi ile kullanılabilir.
  5. Algılamak ve CFP+ hücreleri, otomatik yüzey yeniden kullanma ve izleme (Yüzey Aracı) uygun eş yerelleştirme kanal üzerinden izlemek.
    Not: El ile küratörlüğü nihai izleme hataları ve dışlama tanımlanmış eşiğin (Yani, 150 s)-ebilmek var olmak gerekli daha kısa bir süre ile parça.
  6. CFP ve YFP sinyalleri ayırmak için CD11c-YFP+ hücrelerin belirli bir ortak yerelleştirme kanal oluşturmak. Bu amaçla, sadece yeşil kanal olumlu bir şiddeti oldu ama düşük yoğunluklu mavi kanal voxels seçen gating Çokgen (Şekil 2BII) gösterir.
    Not: temsilcisi Filmler Kanal 1, Kanal 2, CFP Co yerelleştirme kanal, YFP için ortak yerelleştirme kanal ve tüm kanalları bileşimini gelen sinyalleri gösterilen Şekil 2BIIIde bulunabilir.
  7. Zaman içinde (Yüzey Aracı) konumlarını izlemek ve CD11c-YFP+ hücre yüzeyine yeniden.
    Not: El ile düzeltme nihai izleme hataları için bu adım gerekli değildir. Nitekim, DC karmaşık spatio-temporal dinamikleri nedeniyle, 2 P-IVM verilerden kesin yüzeyini yeniden inşa kullanılabilir bölümleme yazılımı ile elde edilemez zor bir görev olduğunu. Bu görevi zorlayıcı olun nedenleri arasında ince çıkıntılar ve parlaklık çeşitlemeleri filtreleri veya statik eşik yumuşatma gibi bazı görüntü işleme teknikleri kullanımı için izin vermez. Ayrıca, DC bir ağda, tek hücreler yalnızca 2 P-IVM veri kendi görünümünü temel alan ayırmak zordur. Bu nedenle, yerine için yazılım parametrelerinin ayarlanması tarafından doğru bir bölümleme denemeden, DC doğru olmayan yüzeyleri yeniden oluşturmak öneriyorum. Sonra olası hataları 5,8 içinde açıklandığı gibi sağlam ölçümleri yoluyla işlemek.
  8. Ölçü birimi hücre göç.
    1. Klasik geçiş önlemler CFP+ ve CD11c-YFP+ hücreler için verin. "Doğruluk izlemek" hücreleri yön gösterirken bunlar arasında hücrelerin ortalama göçmen hız "parça hız demek" gösterir. Bu önlemlerin görüntüleme yazılımı bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarılabilir.
    2. Dışa aktarılan elektronik tablo dosyalarını "(düzeltilmiş doğumdan oranı olarak da adlandırılır) düzeltilmiş parça doğruluk" hesaplamak CFP+ ve CD11c-YFP+ hücreler için tanımlandığı "tarafından kare kökünü çarpılır parça doğruluk" olarak "süresi izlemek" bölünmüş video süresi tarafından kare kökünü. "Doğruluk kısa varlığında izlemek" izler Örneğin izleme hatalarından kaynaklanan28, daha sağlam bir ölçüsüdür.
      Not: sadece aynı uzunlukta videoları bu ölçü ile karşılaştırılabilir.
  9. Hücre etkileşim ölçmek.
    1. Onların mesafe (en yakın voxels) eşit veya daha az bir eşik daha (Yani, 2 mikron) ise CFP+ hücre ve CD11c-YFP+ hücre arasında bir kişiyi tanımlayın.
      Not: Bu eşik hücreleri yakın olduğunda bir kişiyi tespit etmek için yeterince sıkı olmalıdır. Ancak, bu eşik 0, ideal N kez Voksel RADIUS daha büyük daha büyük tutmak için tavsiye (N > 2), çünkü kenar yumuşatma hücreleri yeniden inşası gerçek hücre boyutu daha küçük yapabilirsiniz.
    2. Sayısı sayısı ve kişiler CFP+ ve CD11c-YFP+ hücreler arasındaki süre. Görüntüleme yazılımı bu örneğin bir "öp ve kaç" eklenti yürütmek yoluyla yapılabilir. Bu önlemlerin istatistikler sekmesindeki bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarılabilir.
  10. İstatistiksel yazılım daha önce hesaplanan önlemler almak, araziler oluşturmak ve istatistiksel testler gerçekleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, biz vivo içinde çalışmaya detaylı bir protokol nötrofil ve DC arasındaki etkileşimler ve hareket fare trakea (Şekil 3A) grip enfeksiyonu sırasında açıklanan. Bu amaçla, biz izole CFP+ nötrofil (% 92 saflık; Şekil 3B) CK6-ECFP fare ve biz adoptively onları grip ile enfekte bir CD11c-YFP fare içine transfer. Bundan sonra biz 2 P-IVM 3 gün özel dedektif, trakea, gerçekleştirilen Bu zaman noktada akı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma adoptively transfer edilen nötrofil ve ilişkileri ile DC geçişi grip enfeksiyon sırasında fare borusunda gösterilen 4 D görüntüleri nesil için detaylı bir Protokolü sunar. Açıklanan 2P-IVM modeli bir solunum yolları enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre dinamiği çalışmaya ilgili olacak.

Son zamanlarda, çeşitli modeller hücre dinamiği içinde solunum yolları görselleştirme göre gelişmiş9,10,11

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) hibe (176124, 145038 ve 148183), Avrupa Komisyonu Marie Curie Reintegration Grant (612742) ve SystemsX.ch D.U.P. için bir hibe için tarafından desteklenmiştir (2013/124).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gigasept instru AFSchü lke & Mayr GmbH%4'lük çözelti
CD11c-YFP fareleriJackson Laboratories008829fareleri şirket içinde yetiştirildi
CK6-ECFP fareleriJackson Laboratories004218fareleri şirket içinde yetiştirildi
1x Dulbecco'nun Kalsiyum Korid ve Magnezyum KlorürSigmaD8537-500ML
10x Dulbecco'nun Kalsiyum Korür ve Magnezyum Klorür olmadan modifiye edilmiş Fosfat Tamponlu SalinSigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1L4 derecede saklayın; C
Ketamin Labatec LabatecPharma7680632310024RT'de saklayın, 4 & deg'de saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken
Rompun% 2 (Xylazin)Bayer6293841.00.00RT'de saklayın, 4 derecede saklayın; C ket / ksil karışımı çözeltisi içindeyken
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G, 0.3 mL BD Mikro-İnce İnsülin ŞırıngalarıBD324826
Falcon 40 & mikro; m Hücre SüzgeciCorning352340
2 mL ŞırıngaBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G iğnelerBD304622
Introcan Safety 20 G (kateter)Braun4251652.01
6 Kuyulu Hücre Kültürü KümesiCostar3516
RPMI orta 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-0184 derece; C
Liberase TL Araştırma SınıfıRoche5401020001Mağazası -20 &°C; C / kollajenaz (I ve II) karışımı
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KU-20 °C'de saklayın; C
CellTrace Menekşe lekesiThermoFisher ScientificC34557-20 ° C'de saklayın; C
EDTASigmaEDS-500G
Fetal Sığır SerumuGibco10270-106-20 ° C'de saklayın; C
PE-10 Mikro Tıbbi Boru2Biyolojik Aletler SNC#BB31695-PE/1
Cerrahi Plastik BantM Plast
ViscotearsBausch & RT
HamuruOhropax
Yüksek Toleranslı Cam Lamel 15 mm YuvarlakWarner Instruments64-0733
SomnoSuite Portatif Hayvan Anestezi SistemiKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (gazlı anestezi ve ısıtma tezgahı)Tem Sega
CERRAHİ KURULUBern
TrimScope II İki fotonlu mikroskopLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lazerlerCoherent Inc.
25X NA 1.05 suya daldırma objektifiOlympusXLPLN25XWMP2
The Cube & Kutu inkübasyon odası ve sıcaklık kontrolörüYaşam görüntüleme Hizmetleri
Imaris 9.1.0BitplaneGörüntüleme yazılımı
GraphPad Prism 7GraphPadİstatistiksel yazılım
olmadan modifiye edilmiş Fosfat Tamponlu SalinÜniversitesi

Kaynaklar

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Trakeal Mukoza G r nt lemeN trofil Dendritik H cre Etkile imiAk Sitometrisi AnaliziCerrahi Trake Ekspozisyonuntranazal nfluenza EnfeksiyonuKemik li i N trofil zolasyonuPercoll Yo unluk GradyanBa kl k H cresi Motilite Analizi
İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.