Yöntem makalesi

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

10.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58368

⸱

2 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.

Özet

Peptidler katıldı yüksek sayıda genellikle üç boyutlu yapısı ile ilgili olarak onların disülfür bağlantısı tarafından etkilenmiştir. Bu tamamen farklı peptid yapısında neden olabilir çünkü böylece istenmeyen disülfit bağı oluşumu sırasında peptid sentez, önlemek son derece önemlidir ve sonuç olarak bioactivity değişmiş. Ancak, birden çok disülfür bağları bir peptid içinde doğru oluşumu birkaç disülfür connectivities oluşturulması mümkündür çünkü geleneksel arabellek oksidasyon iletişim kuralları gibi standart kendi kendine katlama yöntemleri kullanarak elde etmek zordur. Bu iletişim kuralının gelişmiş bir strateji hangi arabellek oksidasyon yüksek kalite ve miktar üzerinden sentezlenmiş değil birden fazla disülfür köprü peptidler hedeflenen sentezi için gerekli temsil etmektedir. Çalışma uygulamasının bir stratejinin farklı koruma grubu µ-conotoxin PIIIA, tüm olası peptid 3 disülfür bağ izomerler sentezi için hedeflenen bir şekilde gösterir. Peptidler tanımlanmış disülfit bağı oluşumu için bir koruma grubu strateji kullanarak katı faz Fmoc tabanlı peptid sentez tarafından hazırlanır. Katıldı ilgili çift trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) ve tertile korunmaktadır-bütil (tBu) koruma grupları her oksidasyon adımı sırasında yalnızca gerekli katıldı deprotected bağlı ve emin olmak için. Hedeflenen sentez yanı sıra çeşitli analitik yöntemlerin bileşimini doğru katlanır ve istenen peptit yapılarının üretimi açıklamak için kullanılır. Farklı 3 disülfür bağ izomerler karşılaştırılması disülfür bağlantısı üç boyutlu yapısı hesaplanması için ve biyolojik yorumlanması için bilgi ve doğru belirlenmesi önemi gösterir peptid izomerler faaliyet. Analitik karakterizasyonu adapte bir iletişim kuralı tarafından üretilen sağlam peptid izomer kısmen azaltılmış ve alkylated türevleri ile gerçekleştirilen tandem kütle spektrometresi (MS/MS) analizi ile tam disülfür bağ aydınlatma içerir. Ayrıca, peptit yapılarının 2D nükleer manyetik rezonans (NMR) deneyleri ve MS/MS analizinden elde edilen bilgi kullanılarak belirlenir.

Giriş

Biyolojik hedefler1için güçlü ve çok seçici bileşikleri gösterdiğinden ilaç araştırma ve geliştirme biyoaktif peptidler kullanımı son derece kabul edilmektedir. Kendi bioactivity için ancak, üç boyutlu yapısı yapısı-faaliyet ilişki çalışmaları2,3,4gerçekleştirmek için büyük önem taşıyor. Genel uyum etkileyen birincil amino asit dizini dışında disülfür bağları önemli ölçüde sistein-zengin peptidler5yapısını stabilize. Birden çok disülfür köprü peptidler µ-PIIIA altı katıldı onun sırayla içeren Conus purpurascens üzerinden gibi conotoxins içerir. Bu yüksek sistein içerik teorik olarak 15 disülfür izomerler oluşumunu sağlar. Doğru disülfür bağlantı biyolojik aktivitesi6,7için çok önemlidir. Ancak, doğal olarak meydana gelen peptidler ve bu yüzden, bu izomerler hangisinin en yüksek biyolojik aktivitesi sahiptir Eğer birden fazla biyoaktif biçimi olup doğar soru nedir? Μ-conotoxins söz konusu olduğunda, biyolojik hedefler voltaj kapılı Sodyum iyon kanalları ve μ-PIIIA özellikle için alt NaV1.2, Na en güçlüV1.4 ve NaV1.73.

Disülfür köprü peptidler sentezi çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Disülfür bağları bir peptid içinde oluşumu için en uygun yöntem olarak adlandırılan oksidatif kendi kendine katlanır yaklaşımdır. Burada, istenen döngüsel peptid doğrusal habercisi ilk bölünme polimer destek oksidasyon bir tampon sistemi tabi sonra olan katı fazlı peptid sentez kullanarak sentezlenir. Redoks aktif ajanlar azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) gibi sık sık disülfür bağları oluşumu tanıtmak için eklenir. Arabellek desteklenen kendi kendine katlama ana dezavantajı disülfür bağları seçmeli olarak kademeli bir biçimde oluşturulur değil olmasıdır. Kendisi için çoğunlukla belirli tek disülfit izomer tanımlanır, yerel peptid için karşılaştırıldığında bu yaklaşım8ile çok sayıda izomerler elde etmek mümkündür. Μ-PIIIA zaten bir önceki çalışmada3' te kendi kendine katlanır üzerine en az üç farklı şekilde katlanmış izomerler neden olduğu gösterilmiştir. Böyle bir izomer karışımı ayrılması kromatografik arıtma yöntemleri9kullanıyorsanız benzer saklama kez nedeniyle oldukça zordur. Belirli bir izomer hedeflenen sentezi bu nedenle avantajlıdır. Özellikle hangi disülfür bağları bir izomer ile tanımlanmış disülfür connectivity, özel bir strateji gerekli üretmek için sırayla kapalı. Bu nedenle, farklı koruma grupları bireysel sistein çiftleri taşıyan doğrusal habercisi polimer destek sentezlenir. Eleme sonra sistein çiftleri ayrı ayrı ve sırayla deprotected ve istenen disülfür bağları10,11,12,13, vermeye bir oksidasyon reaksiyonu bağlı 14 , 15 , 16. bir sentez ve reaksiyon ürünü arıtma sonra bu kimliği ve disülfür bağlantı onaylamak için uygun analitik yöntemler tarafından gerekli. Çok sayıda analitik yöntemleri birincil amino asit dizisi, e.gaydınlatma için kullanılabilir., MS/MS, disülfür bağlantı belirlenmesi hala daha az incelenen kalırken. Böyle birden çok disülfür bağ peptidler, ürünle ilgili yabancı maddelerin karmaşıklığı dışında (Örneğin., disülfür çabalıyorlar üzerinden), örnek nedeniyle hazırlık ve iş-up daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu yazıda, farklı analitik teknikleri bir arada kullanımı tümden µ-PIIIA izomerler disülfür bağları kimliğini açıklamak için gerekli olduğunu göstereceğiz. Biz kromatografik yöntemler kütle spektrometresi ile kombine ve NMR spektroskopisi için aynı örnekleri verilmektedir. Matris yardımlı lazer desorption/ionization(MALDI) MS/MS analiz, biz yukarıdan aşağıya doğru analiz için bu peptid mümkün değildir çünkü kısmi azaltma ve iodoacetamide derivatization kullanarak disülfür bağları tespit. 2D NMR deneyler her izomer üç boyutlu yapısını elde etmek için yapıldı. Böylece, farklı karmaşık analitik yöntemleri birleştirerek, bu düzgün disülfür bağlantı ve karmaşık üç boyutlu yapısı birden çok disülfür bağ peptidler7aydınlatmak mümkündür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Burada kullanılan tüm amino asit L-yapılandırmada vardı. Kısaltmalar amino asitleri ve amino asit türevleri IUB adlandırma Komitesi ve biyokimyasal adlandırma IUPAC-IUB Ortak Komisyonu önerileri göre kullanılmıştır.

1. katı faz peptid sentez (SPP'ler)

Not: Bir katı fazlı peptid synthesizer ile sentezi yürütmek. Genel sıra ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Kimya için standart bir protokol kullanarak doğrusal peptid öncüleri sentezi gerçekleştirir. Aşağıdaki korumalı amino asitler uygulamak: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-Sülfanil)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) ve onun (Trt). Trt, Acm veya tBu grupları sistein çiftiyle göre hedeflenen disülfür bağlantı korumak.

  1. Hazırlık
    1. Fmoc pisti-Amid reçine kuru (yükleme: 0,28 mmol/g) bir lyophilizer gecede kullanarak.
    2. İstenen peptit dizisi (1-harf kodu) synthesizer programı girin. Program her bireysel reaktif için gereken tutarı hesaplar ve solvent miktarları gösterir.
    3. Bireysel reaktifleri (amino asitler, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) protokolüne göre tartmak ve onları bir son konsantrasyon 2.4 M (amino asitler) ve 0,6 M (dimethylformamide (DMF) çözülür HBTU), anılan sıraya göre.
    4. Farklı reaktifler transfer (amino asitler, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, DMF % 50), Piperodin DMF (%20), DMF, diklorometan (DCM)) karşılık gelen damarları ve katı faz peptid synthesizer uygun raketleri içinde koyun.
    5. Kuru reçine 100 mg tepki sütunları ekleyin ve synthesizer raket koydu. Katı faz peptid sentez başlatın.
  2. SPP'ler-protokol (synthesizer tarafından sağlanan)
    Not: Protokol reçine 100 mg için geçerlidir (yükleme: 0,28 mmol/g) için 28 µmol ölçek bir reaksiyon sütun eklendi.
    1. Reçine hazırlanması
      1. Reçine ile 2500 µL DMF, 1400 µL DCM, ve 1400 µL DMF ve durulayın.
      2. Çözücü kaldırılana kadar reçine ile hava temizleme ve reçine ile 2500 µL DMF ve durulayın.
    2. Grup korumak Fmoc bölünme
      1. DMF içinde % 20 Piperodin ekleyin (1000 µL) reçine ve 6 dk. için beklemek için çözüm reçine kaldırın. 1.2.2.1 arasındaki adımları yineleyin.
      2. İki kez DMF ile (1st 4000 µL, 2nd1400 µL) durulayın, solvent kaldırılana kadar reçine ile hava temizleme ve ile iki kez µL 2000 DMF ve durulayın.
    3. Reaksiyon kaplin
      1. Ayrı bir şişe içinde aşağıdaki reaktifleri karıştırmak: HBTU (450 µL; 0,6 M DMF; 270 µmol; 9,6 EQ), NMM (125 µL; DMF % 50; 568 µmol; 20 EQ), Fmoc-amino asit (420 µL; 2.4 M DMF; 1,01 mmol; 36 EQ). Reçine karışımı ekleyin ve 13 dk. Kaldır reçine çözümden bekleyin. 1.2.3.1 arasındaki adımları yineleyin.
      2. DMF 3000 µL ile yıkayın. İle iki kez µL 1400 DMF, yıkamak. İle iki kez µL 2000 DMF, yıkamak.
      3. 1.2.2 ve amino asitler peptid sıra sayısına göre 1.2.3 adımları yineleyin.
    4. Son Fmoc bölünme ve reçine yıkama
      1. DMF içinde % 20 Piperodin ekleyin (1000 µL) reçine ve 6 dk. için beklemek için çözüm reçine kaldırın. 1.2.4.1 arasındaki adımları yineleyin.
      2. İki kez DMF ile (1st 4000 µL, 2nd 1400 µL) durulayın ve reçine ile hava temizleme. DMF, 2000 µL DCM, 1400 µL ile 4 kez iki kez ile durulayın ve iki kez hava ile yıkayın.
  3. İş-up
    1. Reçine sentezi tamamlandıktan sonra sütunlar gecede reaksiyon gelen lyophilize.

2. peptid bölünme reçine (Şekil 1A) üzerinden

Not: göğüs arası işlem sırasında tüm amino asit yan zincir Cys(Acm) ve Cys (tBu) dışında deprotected. Protokol reçine 100 mg için geçerlidir.

  1. 12 ml tüp içinde dondurularak reçine birleştirmek ve buz 0 ° C için serin.
  2. Bir çöpçü karışımı (hazır 0.75 g fenol, 0.5 mL thioanisole, 0.25 mL ethanedithiol) ve trifluoroacetic asit (TFA, su (H2O) % 95'i) 1 mL 150 µL buza reçine için ekleyin. Oda sıcaklığında 3 h için hafifçe sallayarak bırakın.
  3. Karışımı cam frit yoluyla filtre ve filtrate tek tek buz gibi dietil eter (8-10 mL dietil eter başına bölünme karışımı 1 mL) ile dolu tüpler toplamak. Peptid beyaz katı precipitates.
  4. Ek TFA (H2O, yaklaşık 1-3 mL % 95'i) filtre pastayla durulayın.
  5. Çökelti içeren tüpler kapatın ve (3400 x g) süspansiyonlar için 1 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve granül 8-10 mL buz gibi dietil eter ile yıkayın. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
  6. Kalan dietil eter izleri kaldırmak 5 min için tıpa ayakta granül bırakın. Ham ürün granül tert1 ml çözülür-butanol (H2O %80). Peptidler (-80 ° C) şeytanibir.

3. doğrusal habercisi yarı partiye hazırlık yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile saflaştırılması

Not: yarı partiye hazırlık ters faz (RP) C18 sütun ile donatılmış HPLC tarafından ham peptidler arındırmak (5 µm partikül büyüklüğü, 100 Å gözenek boyutu, 250 x 32 mm) ve 3.6 mL enjeksiyon döngü. %0.1 H2O TFA (a eluent) ve % 0.1 degrade elüsyon sistemi kullanmak TFA (9:1, eluent B) Asetonitril (MeCN) / h2O. Tepeler vasıl 220 algılamak nm.

  1. Ham peptid yaklaşık 70 mg 15 mL tüp eklemek ve HPLC örnek döngü hacmine katı peptid çözülür (Örn., 3,6 mL). % 0.1 karışımı kullanın TFA MeCN/H2O (1:1). Girdap kadar tamamlamak dağılması ve santrifüj (3400 x g) 1 dk. için çözüm.
  2. Örnek (3,6 mL) 5 mL şırınga kadar çizmek ve herhangi bir hava kabarcığı olmadan örnek enjeksiyon döngü içine enjekte. HPLC sistemi enjekte. 0-%50 eluent B 120 dk bir degrade 10 mL/dak bir akış hızında çalıştırarak peptid karışımı ayırın.
  3. Göründükleri gibi bireysel tüpler kesirleri toplamak. Çalışma tamamlandıktan sonra seçilen kesirler kütle spektrometresi (MS) ve HPLC analiz (adım 6.1 6.2) için hazırlayın. Kesirler şeytanibir ve onları-20 ° C'de depolayın
  4. MS ve HPLC analiz sonra doğrusal peptid saf kesirler birleştirin ve örnekleri için ilk oksidasyon hazırlamak.

4. seçici disülfür bağları oluşumu

  1. 1 st oksidasyon (resim 1B)
    Not: reçine üzerinden peptid bölünme sırasında Cys(Trt) deprotected, daha sonra ilk disülfür bağ için oksidasyon tabi olan iki korumasız Cys artıkları yol açmaktadır. Aşağıdaki iletişim kuralı doğrusal arıtılmış peptid 15 mg için geçerlidir (2864.5 g/mol; 5.2 µmol; 1 EQ).
    1. 105 ml bir isopropanol/H2O karışımı (1:2; 0.05 mM; sodyum hidroksit (NaOH) ile ayarlanır pH 8,5) doğrusal peptid (15 mg) dağıtılması ve yavaşça hava 12-48 h için temel koşullar altında sallayarak bırakın.
    2. HPLC ve MS. Onayla ilk köprü oluşumu ile oksidasyon reaksiyonu iodoacetamide (IAA) derivatization (adım 6) izlemek.
    3. Peptid şeytanibir ve 2nd oksidasyon için daha fazla arıtma kullanabilirsiniz.
  2. 2nd oksidasyon (resim 1C)
    Not: ikinci oksidasyon sırasında Acm korumalı katıldı deprotection ve ikinci köprünün oluşumu katalize iyot tarafından. Protokol 1st oksidasyon sonra peptid 15 mg için geçerlidir (2862.5 g/mol; 5.2 µmol; 1 EQ)
    1. Peptid (15 mg; son konsantrasyonu 0.05 mM) bir isopropanol/H2O/1 M hidroklorik asit (HCl) karışımı (80:12.5:7.5) 105 mL geçiyoruz.
    2. Metanol (MeOH) bir 0.1 M iyot çözümün 158 µL ekleyin (15,7 µmol; 3 EQ) çözüm için. 3-52 h, yanioda sıcaklığında tepki karıştırın., oksidasyon tamamlanana kadar.
    3. HPLC ve MS. Onayla ikinci disülfür bağ oluşumu ile oksidasyon reaksiyonu iodoacetamide (IAA) derivatization (adım 6) izlemek.
    4. Reaksiyon H2O bir 1 M askorbik asit çözümün 79 µL ekleyerek durdurmak (78.8 µmol; 15 EQ). Reaksiyon karışımı şeytanibir ve toz 3rd oksidasyon için kullanın.
  3. 3rd oksidasyon (resim 1D)
    Not: Son oksidasyon tBu korumalı katıldı deprotection için ve üçüncü disülfür Köprüsü oluşumuna yol açar. Protokol sonra 2nd oksidasyon peptid 15 mg için geçerlidir (2718.3 g/mol; 5.5 µmol; 1 EQ).
    1. Peptid (15 mg, 1 mM son konsantrasyonu) 5.5 mL TFA geçiyoruz. 11.2 mg, diphenylsulfoxide oluşan bir çöpçü karışımı içerir (55 µmol; 10 EQ), 60.2 ANISOL µL (0.6 mmol; 100 EQ) ve trichloromethylsilane 97.2 µL (0.8 mmol; 150 EQ). 3-5 h için karışımı oda sıcaklığında ilave edin.
    2. HPLC ve MS. Onayla üçüncü disülfür bağ oluşumu ile oksidasyon reaksiyonu iodoacetamide (IAA) derivatization (adım 6) izlemek.
    3. Soğuk dietil eter (0 ° C, 1 mL başına 8-10 mL dietil eter tepki çözeltisi) içeren tüpler peptid çökelti.
    4. Süspansiyonlar (3400 x g, 1 dk) santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve granül art arda (4 kez) 8-10 mL soğuk dietil eter (0 ° C) ile yıkayın.. Hava (3 dk) Kuru granül izin.
    5. 1 ml % 80 tertgranül çözülür-butanol (içinde H2O), peptid şeytanibir ve -20 ° C'de saklayın

5. peptid arıtma

Not: yarı hazırlık RP HPLC C18 sütun ile donatılmış tarafından okside peptidler arındırmak (10 µm partikül büyüklüğü, 300 Å gözenek boyutu, 250 x 22 mm) ve 3.6 mL enjeksiyon döngü. %0.1 H2O TFA (a eluent) ve % 0.1 degrade elüsyon sistemi kullanmak TFA (9:1, eluent B) MeCN/H2O. Tepeler vasıl 220 algılamak nm.

  1. Dondurularak ham ürün 15 mg 15 mL tüp 4.3.5 adımından ekleyin. HPLC örnek döngü hacmine ham ürün dağıtılması (Örn., 3,6 mL). % 0.1 karışımı kullanın TFA MeCN/H2O (1:1). Girdap kadar tamamlamak dağılması ve santrifüj (3400 x g) 1 dk. için çözüm.
  2. 5 mL şırınga 3.6 mL karışımı kadar çizmek ve herhangi bir hava kabarcığı olmadan örnek enjeksiyon döngü içine enjekte. HPLC sistemi içine enjeksiyon başlatın. 0-%50 eluent B 120 dk bir degrade 10 mL/dak bir akış hızında çalıştırarak peptid karışımı arındırmak.
  3. Göründükleri gibi bireysel tüpler kesirleri toplamak. Çalışma tamamlandıktan sonra seçilen kesirler MS ve HPLC analiz (adım 6.1 6.2) için hazırlayın. Tüm kesirler şeytanibir ve onları-20 ° C'de depolayın
  4. Çalışma tamamlandıktan sonra seçilen kesirler MS ve HPLC analiz (adım 6.1 6.2) için hazırlayın. Tüm kesirler şeytanibir ve onları-20 ° C'de depolayın

6. peptid Analytics

  1. Analitik HPLC
    Not: bir peptid C18 sütun ile donatılmış analitik RP HPLC tarafından saflığı onaylamak (5 µm partikül büyüklüğü, 300 Å gözenek boyutu, 250 x 4.6 mm) ve 500 µL enjeksiyon döngü. %0.1 H2O TFA (a eluent) ve % 0.1 degrade elüsyon sistemi kullanmak TFA MeCN (eluent B) içinde. Tepeler vasıl 220 algılamak nm.
    1. Peptid kesirler örneğini aktarmak veya bir HPLC denetimlere tepki şişe ve % 0.1 bir karışımı olarak dağıtılması TFA MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). HPLC şişe analitik RP HPLC Otomatik Örnekleyici yerleştirin.
    2. Her örneğinin 250 µL enjekte. %0.1 H2O TFA (a eluent) ve % 0.1 degrade elüsyon sistemi kullanmak TFA MeCN (eluent B) içinde. 10-%40 eluent B 30 dk bir degrade 1.0 mL/dak bir akış hızında çalıştırarak peptid arındırmak.
  2. MALDI TOF Kütle spektrometresi
    Not: α- cyano-4-hydroxycinnamic asit matrisi kullanarak MALDI TOF (uçuş süresi) kütle spektrometresi tarafından bir peptid kimliğini onaylamak.
    1. Peptid görünür bir miktarını 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak ve bir çözümün 37 mM α- cyano-4-hydroxycinnamic asit % 0,1 bir karışımı 10 µL içinde erimesi TFA H2O/MeCN (1:1).
    2. Girdap 10 için çözüm s, örnek 2 µL zemin çelik hedefe uygulamak ve örnek kuruması.
    3. Ölçümleri ve 6000 g/mol altında molar kitleler için standart bir peptid kalibrasyon için reflektör modunu kullanın.
  3. Iodoacetamide derivatization
    Not: iodoacetamide thiol gruplarıyla tepki olarak iodoacetamide derivatization peptidler, ücretsiz thiol grupları gösterir. Bu nedenle, ücretsiz thiol grupları yokluğu olarak MS ile tepki kontrolü 1st oksidasyon sırasında hizmet vermektedir.
    1. 10 mM fosfat tampon (100 µL; 0.05 mM; pH 7.8) 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde peptid geçiyoruz. İodoacetamide 100 µL peptid 10 mM fosfat tampon (4 mM) ekleyin ve hafifçe karanlık oda sıcaklığında 2 h için tepki sallamak. Reaksiyon karışımı şeytanibir ve -20 ° C'de saklayın
    2. C18-konsantrasyon Filtre Pipet ipucu kullanın ve %80 (3 kez), % 50 (3 kez), %30 (3 kere) ve %0 10 µL ucuyla durumu (3 kere) MeCN H2O (+ % 0,1 TFA).
    3. Adım 1'de 6.3.1 µL % 0.1 örnekten dağıtılması TFA H2O içinde ve çözümü için Filtre Pipet ucu eklemek. Böylece peptid boncuk için bağlar dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. H2O pipet ucu dışarı çıkarın ve Filtre Pipet Ucu 10 µL % 0.1 ile durulayın TFA H2O.
    4. 2 µl % 0.1 eklemek TFA H2O/MeCN (1:1) (filtre) olmadan peptid içeren boncuk üstüne başka bir pipet ucu ile. Filtrate zemin çelik hedefe uygulamak ve örnek kuruması.
    5. 37 mM α-cyano-4-hydroxycinnamic asit solüsyonu TFA H2O/MeCN (1:1) zemin çelik için örnek ile hedef ve örnek kuruması % 0,1 bir karışımı 1 µL uygulanır.
    6. Ölçümleri ve 6000 g/mol altında molar kitleler için standart bir peptid kalibrasyon için reflektör modunu kullanın.
  4. Amino asit Analizi
    Not: tam peptid konsantrasyon yanı sıra bir amino asit çözümleyicisini kullanarak peptid amino asit bileşimi analiz.
    1. Saf peptid (2604 g/mol; 0,04 µmol) 100 µg 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve 6 M HCL 200 µL toz geçiyoruz.
    2. Çözümün 200 µL cam ampul aktarmak ve durulama 1.5 mL microcentrifuge tüp iki kez, 6 M HCl. 200 µL ile Transfer durulama çözüm cam ampul de.
    3. Ampul ampul Bunsen burner alev ile boyun Isıtma tarafından kapatın. Ampül bir cam tüp içine koymak. Hidroliz için 110 ° C'de 24 h için ısıtma bloğu yerleştirin.
    4. Ampül açın ve çözüm 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Ampül (3 x 200 µL) ve çift-distile H2O şapkayla (3 x 100 µL) yıkama ve microcentrifuge tüp içine aktarın.
    5. 60 ° C ve dönme vakum yoğunlaştırıcı 210 x g 6 h için çözüm santrifüj kapasitesi. Örnek seyreltme arabelleği (200 µM) 192 µL hydrolyzed üründe dağıtılması ve çözüm mikro santrifüj filtrenin aktarın.
    6. 1 dk. için örnek bir amino asit Analizi örnek tüpüne 2300 g ve transfer 100 µL filtrate, x, santrifüj kapasitesi. Amino asit çözümleyicisine tüpü yerleştirin ve Analizi başlatın. Bir amino asit Standart kalibrasyon için kullanılır.

7. MS/MS Analizi disülfür bağlantısı

  1. Kısmi azaltma ve alkillenme17
    1. 1.2 ml 0,05 M sitrat arabellek (pH 3.0; 0.14 mM peptid konsantrasyon) saf peptid (2604 g/mol; 0,23 µmol) 600 µg dağıtılması 7.5 mg içeren tris(2-carboxyethyl) fosfamin (TCEP; 0,02 M; 0,03 mmol).
    2. Karışımı oda sıcaklığında kuluçkaya ve birkaç reaksiyon kontrol örnekleri (100 µL) 0 dk 30 dk arasında değişen al.
    3. 1.5 mL microcentrifuge tüp örneklerinde alkillenme arabellek 300 µL ile karıştırın (0,5 M tris-asetat; pH 8.0; 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA); 1,1 M iodoacetamide) reaksiyonu durdurmak ve carbamidomethylation ücretsiz thiol gruplarının gerçekleştirmek için.
    4. 5 dk sonra tepki %10 TFA (H2O) ve mağaza 100 µL ekleyerek durdurmak Kuru buz üzerinde örnekleri. 6.1.2. adımda açıklandığı gibi HPLC örnekleri hazırlamak ve 400 µL. (Şekil 2A) enjekte
    5. %0.1 H2O TFA (a eluent) ve % 0.1 degrade elüsyon sistemi kullanmak TFA MeCN (eluent B) içinde. Bir isocratic ayrılık (% 10 eluent B 15 dakika) kullanarak peptidler çözümlemek ve sonra % 10-35 eluent B 25 min 10 mL/dak akış hızında bir sonraki degrade algılamak doruklarına vasıl 220 nm.
    6. 1.5 mL microcentrifuge tüpler kesirleri toplamak ve peptidler şeytanibir. (Şekil 2B)
    7. Her kesir az miktarda (7.1.12 adımda devam) oksitlenmiş formları MS/MS analizi için 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
    8. %0,1 kalan peptid (10-100 µg) dağıtılması TFA (10-50 µL) H2O içinde ve 10 mM bir son TCEP konsantrasyon almak için 100 mM TCEP çözeltilerine (H2O) uygun bir hacmi ekleyin.
    9. Reaksiyon 37 ° C'de (Şekil 2C) 1 h için kuluçkaya. Reaksiyon karışımı şeytanibir ve -20 ° C'de saklayın
    10. Adım 6.3.2-6.3.5 içinde açıklandığı gibi MS/MS örnekleri hazırlayın.
    11. MS/MS ölçümleri bir MALDI TOF/TOF Kütle Spektrometre gerçekleştirin. MS/MS kapak (lazer kaynaklı decay) peptid parçalanma için kullanın ve 2 ve 4 kez carbamidomethylated türler habercisi kitlelerin seçin. İşlemek ve istenen disülfür bağlantı onaylamak için maldı verileri değerlendirmek.

8. NMR deneyleri ve yapısı analiz

  1. Saf peptid ürün 500 µL H2o/d2O (90:10) ve transfer karışımı içine bir NMR microtube erime yaklaşık 0,3-2 mg.
  2. Örnek bir NMR spektrometresi ölçülerde hazırlamak
  3. Kayıt 2 boyutlu [1H,1H] - DQF - COSY (Çift filtre kuantum korelasyon spektroskopisi), [1H,1H] - TOCSY (Toplam ilişkili spektroskopisi), [1H,1H] - NOESY (nükleer Overhauser geliştirme spektroskopisi) ve [1H,13C]-HSQC (heteronuclear tek kuantum tutarlılık) spectra su bastırma kullanarak.
  4. Proton rezonanslar kaydedilen spectra ürününün atayabilir ve atom ataması NOESY spectra oluşturmak. Peptid farklı atomlar arasında üst sınırı mesafe kısıtlamaları ayarlamak için NOESY spectra yoğunluklarda karşılaştırın. Germinal proton yoğunluğu en yüksek-yoğunluk ayarı'nı kullanın.
  5. Moleküler görüntülenmesi için bir bilgisayar programı ile arıtma ve yapısı hesaplama gerçekleştirmek ve ek sınırlamalar (Şekil 3) tanımlanan disülfür connectivities adım 7 kullanın.
  6. En düşük enerjileri yapılarla seçin ve moleküler dinamiği (MD) simülasyonları için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

15 farklı disülfür köprü izomerler µ-conotoxin PIIIA, sentez ve ayrıntılı olarak (Şekil 1) ile karakterizedir. Disülfür bağları kısmi azaltma ve daha sonraki MS/MS Analiz (Şekil 2) tarafından tanımlanır. Farklı izomerler NMR Analizi (bireysel peptid yapıları ortaya çıkarmak içinŞekil 3) yapılır. Özellikle, RP HPLC, MS/MS parçalanma ve NMR Analizi bir arada disülfür bağlantı benzersiz tanımlaması için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Μ-PIIIA seçerek disülfür bağ izomerler aynı amino asit dizisi üzerinden üretmek için bir olasılık temsil eder gibi sistein-zengin peptidler sentezi için burada açıklanan yöntemi. Bu nedenle, Fmoc tabanlı düz gibi yöntemleri peptid sentez18 faz ve disülfür bağları regioselective oluşumu için tanımlanmış bir koruma grubu strateji edildi kullanılan16kurdu. Katı faz peptid sentez otomatik sentezi ile polimer destek (reçine) amino asit dizileri üretebilir. Bu amino asitler isten...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

A. Resemann, F. J. Mayer ve ö. Suckau Bruker Daltonics GmbH Bremen dan teşekkür etmek istiyorum; Ö Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts ve C. Thiele Darmstadt Teknoloji Üniversitesi üzerinden; FLI Jena, M. Engeser Bonn Üniversitesi üzerinden O. Ohlenschläger; K. Kramer, A. Harzen ve H. Nakagami dan bitki ıslahı araştırmaları, Köln Max Planck Enstitüsü; Susanne Neupert Zooloji, Köln Enstitüsü'nden; ve biyomoleküler manyetik rezonans spektroskopi Frankfurt Üniversitesi için imkanlar teknik desteği, modüller, eğitim ve aletleri için erişim. University of Bonn için Dedektif tarafından mali destek minnetle kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PS PEG2000 Fmoc Rink-amid ReçineVarian, Inc.PL3867-3764Amfi Küreler 40 RAM
Pir(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiyoteknolojiFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trtİris BiyoteknolojiFDP1200
2- (1H-Benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronyumhekzafluorphosphatSigma Aldrich8510060Yanıcı
DMFFisher ScientificD119Yanıcı, Toksik
DCM Fisher ScientificD37
Kanserojen PiperidinAlfa Aesar A12442Yanıcı, Toksik, Aşındırıcı
N-Metil-MorfolinSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
trifloruasetik asitSigma Aldrich74564Toksik, Aşındırıcı
fenolMerck1002060Toksik
tiyoanisolAlfa AesarA14846
ethanedithiolFluka Analitik2390
dietil eterVWR100,921Yanıcı
tert-bütanolAlfa AesarL12338Yanıcı
asetonitrilFisher ScientificA998Yanıcı
suFisher ScientificW5
izopropanolVWRACRO42383Yanıcı
sodyum hidroksitAppliChemA6579,1000Aşındırıcı
iyodoasetamidSigma AldrichI6125
iyotSigma AldrichI0385
Hidroklorik asitMerck110165Korozif
askorbik asitSigma AldrichA4403
difenilsülfoksitSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109Yanıcı
triklorometilsilanSigma AldrichM85301Yanıcı
numune seyreltme tamponuLaborservice Onken
sodyum dihidrojen fosfatSigma Aldrich106370
disodyum hidrojen fosfatSigma Aldrich795410
(2-karboksietil) fosfin hidroklorürSigma AldrichC4706
sitrik asitSigma Aldrich251275
sodyum sitrat dihidratSigma AldrichW302600
tris-asetatCarl Roth, 7125
Etilendiamintetraasetik asitSigma AldrichE26282 
peptit kalibrasyon standardı IIBruker Daltonics GmbH8222570
EkipmanŞirketinin
Katı Faz PeptitSentezleyici Intavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
liyofilizatör Martin Christ GmbH  Alfa 1-2 Ldplus
yarı hazırlayıcı HPLCJascosistemi PV-987
Eurospher 100 C18 kolonu (RP, 5 & m parçacık boyutu, 100 Å gözenek boyutu, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Jlineer peptit
Vydac 218TP1022 kolonunun saflaştırılması (RP C18, 10 & mikro; m parçacık boyutu, 300 Å gözenek boyutu, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022oksitlenmiş peptit
analitik HPLC Shimadzusistemi LC-20AD
Vydac 218TP54 sütunu (C18 RP, 5 ve mikro; m parçacık boyutu, 300 Å gözenek boyutu, 250 x 4,6 mm) Hichrom-VWRHICH218TP54Analitik Kolon
Taşlanmış Çelik Hedefi (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI hazırlama 
C18 konsantrasyon filtresi (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI hazırlama 
MALDI kütle spektrometresiBruker Daltonics GmbHultraflex III TOF/TOF
amino asit analizörüEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 sistem
NMR spektrometresi Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
moleküler görselleştirme için bilgisayar programıYASARA Biosciences GmbHYasara yapılarıNMR yapısı hesaplaması
MALDI veri değerlendirmesi için bilgisayar programı Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS parçalanma
analog vorteks karıştırıcıVWRVM 3000
MikrosantrifüjEppendorf5410
SantrifüjHettichEBA 20
Rotasyonel vakum yoğunlaştırıcıChrist2-18 Cdplus
Analitik TeraziA& D AletleriGR-202-EC
Adı

Kaynaklar

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Etiketler

Dis lf r Ba Olu umuPeptit SenteziKat Faz SenteziTandem K tle SpektrometrisiN kleer Manyetik RezonansSe ici OksidasyonHPLC PurifikasyonuAmino Asit AnaliziPeptit Karakterizasyonu

İlgili makaleler