Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme
Bu makalede
Özet
Özet
Oksijen tüketimi, proton sebep kuvvet (PMF) ve proton sızıntı mitokondriyal solunum veya ne kadar iyi mitokondri NADH ve FADH ATP dönüştürmek mümkün ölçülerini vardır. Nasıl verimli oksijen kullanımı ve doğrudan ATP üretmek mitokondri de oksijen ve karbon dioksit ve su besin oksidasyon birincil site olduğundan, besin metabolizma, verimliliği ile ilgilidir hayvanın besin gereksinimleri ve hayvan sağlık. Bu yöntemin amacı farklı ilaçlar, diyetler ve mitokondriyal metabolizma üzerindeki çevresel etkileri etkilerini incelemek için kullanılan mitokondrial solunum incelemektir. Sonuçları proton bağlı solunum (durum 3) ve proton sızıntı bağımlı solunum (devlet 4) ölçülen oksijen tüketimi içerir. Devlet 3 / devlet 4 Solunum oranı solunum denetim oranı (RCR) tanımlanır ve mitokondrial enerjik verimliliği temsil edebilir. Mitokondrial proton sızıntı ADP ATP sentezi verimliliğini azalan dan uncoupling Oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri zar potansiyel (MMP) dağılımı sağlar bir süreç var. Oksijen ve TRMP + Hassas elektrotlar mitokondrial yüzeylerde ve elektron taşıma zinciri inhibitörleri ile durum 3 ve devlet 4 solunum, mitokondri zar PMF (veya ATP üretmek için potansiyel) ölçmek için kullanılır ve proton sızıntısı. Bu yöntem için kısıtlamaları karaciğer dokusu gibi taze olmalı ve tüm biyopsi ve deneyleri az 10 h içinde gerçekleştirilmesi gerekir vardır. Bu toplanan ve bir günde yaklaşık 5 için tek bir kişi tarafından işlenen örneklerin sayısını sınırlar. Ancak, yalnızca 1 g karaciğer doku, bu yüzden örnek gerekli miktarda süt sığır gibi büyük hayvanlarda karaciğer boyutuna göre küçük ve küçük kurtarma zaman gerekli gereklidir.
Giriş
Mitokondri stres çok duyarlıdır ve hücresel çevreleri çok çeşitli metabolik hastalıklar katkıda bulunabilir. Oksijen tüketimi ve mitokondri proton sızıntısı mitokondri sağlık göstergeleri vardır. Bu kağıt tahmin mitokondrial enerji verimliliğinde oksijen tüketimi ve proton sızıntısı olmayan temel RCR kullanarak açıklanan yöntemleri. Bu sonuçlar besin kullanımı1' kayıp enerjinin % 30 için hesap. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikleri için metabolik hastalık katkıda bulunur ve azalan enerji verimliliği sonuçları mitokondrial disfonksiyon tanımlayabilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda mitokondrial solunum üzerinde farklı tedaviler etkis....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntemleri, protokolü ve burada açıklanan çalışmaları Davis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. alma karaciğer biyopsisi bir Holstein süt ineği
Not: Karaciğer biyopsisi lisanslı bir veteriner tarafından gerçekleştirilmelidir. Karaciğer biyopsi inekler konumlandırıldığı sitenin süt gerçekleştirilebilir. Laktasyondaki süt inekleri normalde Sağılan devam edebilir ve süt gıda tedariki önce veya sonra yordamın geri olması gerekmez. Bu en az 4 kişi karaciğer biyopsisi süt ineği üzerinde gerçekleştirmek için gereken önerilir: biyopsi, ineğin beyinsiz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
RCR ve proton sızıntı kinetik gösteren olumlu sonuçları Tablo 1 ve Şekil 15, sırasıyla gösterilir. Bu çalışmada7, RCR ve protein sızıntısı kinetik ölçülen Holstein Süt ineklerin süt 70 gün, inekler 28 gün boyunca 1, Cu, Zn ve Mn 5 farklı seviyelerde beslenen sonra. Devlet 4, en fazla proton sızıntı bağlı solunum, Cu, Mn ve Zn (p < 0,1) mineral alımını tarafından etkilenmiş gibi bir eğilim vardı. Devlet 3 so.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
En kritik nokta protokolündeki temsilcisi karaciğer doku örneği alma ve mitokondri yalıtım en kısa zamanda biyopsi sonra başlangıcı. Solunum ölçüleri içinde çeşididir inek laboratuvar bir kısa ulaşım zaman nedeniyle düşük (Tablo 1). Taşıma süresini azaltmak için küçük bir laboratuvar süt ofiste kurulmuştur ve mitokondri biyopsi 10 dk içinde izole böylece her toplanan gibi karaciğer örnekleri için office laboratuvar sürüldüler. Kurulum ve proton degradeler kayıt farklılıkları için toplama ve işleme örnekl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, gıda hayvan sağlığı, UC Davis Veteriner Tıp Fakültesi için merkezi aracılığıyla Alltech ve USDA kapak fon tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Karaciğer Biyopsisi< / güçlü > | |||
| < güçlü > Ekipman< / güçlü > | |||
| Schackelford-Courtney sığır karaciğer biyopsi aleti | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Sütür | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Sütür iğneleri | NA | NA | Dahil Sütür |
| Neşterli | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # sap ve bıçaklar için |
| Ameliyat havluları | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Şahin tüpleri 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cımbız | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL şırınga | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Enjeksiyon iğneleri (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| yular | Traktör Tedarik A.Ş. | ||
| Pamuklu çubuk | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| pamuklu gazlı bez kareler (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Tıbbi makas | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Aşısı 0.75 şişe/ | Tarafından sağlanan Veteriner | ||
| Clostridia Aşısı | Veteriner Hekim Tarafından Sağlanan | ||
| Karaciğer biyopsisi antibiyotikler 3 gün | Veteriner | ||
| tarafından sağlanır Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Etanol% 70 | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Ksilazin hidroklorür 100 mg / mL IV 0.010-0.015 mg / kg'da vücut ağırlığı | Veteriner Hekim tarafından sağlanan | ||
| % 2 lidokain HCl (10-15 mL) | Veteriner Hekim tarafından sağlanan | ||
| 1 mg / kg IV fluniksin meglumin | Veteriner Hekim tarafından sağlanan | ||
| Mitokondri (karaciğer) izolasyonu< / güçlü > | |||
| < güçlü > Ekipman< / güçlü> | |||
| Wheaton flakon 30 mL, 0,16 mm boşluklu Teflon havaneli | ile Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homojenizatör Motoru | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homojenizatör Probu | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Otomatik Pipet (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Buzlu Beher (500 mL) | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Soğutmalı mikrofüj | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Mikrofüj tüpleri (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Kimyasallar | |||
| Bikchinoninik asit (BCA) protein tahlil kiti (plaka okuyucu için mikroplakalar) | abcam | ab102536 | |
| Sükroz | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (yağ asidi içermez) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deiyonize su | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Mitokondri izolasyon ortamı oluşturmak için kullanın: 220 mM mannitol, 70 mM sükroz, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ve %0.1 (a/h) yağ asidi içermeyen BSA, pH 7.4 4 ° C'de; C, buzdolabında | |||
| Mitokondriyal Oksijen Takviyesi< / güçlü> | |||
| Ekipman< / güçlü> | |||
| Oksigraf Kurulumu + Clark tipi oksijen elektrodu | Hansatech (PP Sistemleri) | OXY1 | |
| Termoregüle Su Pompası | Ekipmanları | MLE2001 | |
| Clark tipi Oksijen elektrodu | NA | NA | |
| Otomatik Pipet (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Oxy1 ile birlikte verilir |
| Küçük manyetik karıştırma çubuğu | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Mikropipet (10 & mu; L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH metre | VWR | ||
| < güçlü > Kimyasallar< / güçlü > | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Mitokondriyal oksijen tüketim ortamı yapmak için kullanın: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA, pH 7.4 30 ° C'de; % 0.3 yağı alınmış BSA | |||
| Rotenone içeren C (4 mM çözeltisi) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Süksinat (1 M çözeltisi) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM çözeltisi) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomisin (8 & mu çözeltisi; etanolde g / mL) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| < güçlü > Mitokondriyal Membran Potansiyeli ve Proton Hareket Kuvveti< / güçlü > | |||
| < güçlü > Ekipman< / güçlü > | |||
| TPMP elektrot | Dünya Hassas Aletleri. | DRIREF-2 | |
| kimyasal çözeltilerin taze olması gerekmez, ancak çalışmalar arasında bir dondurucuda saklanmaları gerekir | |||
| Malonat (0.1 mM çözelti) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomisin (8 & mu; etanolde g/mL), dondurucuda saklayın | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (etanolde 80 ng/mL), dondurucuda saklayın | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP çözeltisi: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA, pH 7.4 30 &°C'de; %0,3 yağı alınmış BSA |
Kaynaklar
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
