Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Alt akut serebral Microhemorrhages sıçanlarda Lipopolysaccharide enjeksiyonla indüklenen

6.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

17 Ekim 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz neden ve LPS enjeksiyon olabilir Sprague-Dawley sıçanlarda neden CMHs gelecekte CMHs patogenezinde üzerine araştırma araştırmalar kullanılan algılamak için bir protokol mevcut.

Özet

Serebral microhemorrhages (CMHs) yaşlı hastalarda yaygındır ve çeşitli Nöropsikiyatrik bozukluklar correlated. CMHs etyolojisinde karmaşıktır ve neuroinflammation kez ortak bir olay görülmektedir. Burada, biz alt akut tarif CMHs fare modeli lipopolysaccharide (LPS) enjeksiyon yanı sıra CMHs. sistemik LPS enjeksiyon algılamak için bir yöntem tarafından indüklenen nispeten basit, ekonomik ve uygun maliyetli. LPS enjeksiyon bir büyük avantajı istikrarı iltihap neden olduğunu. LPS enjeksiyonu ile neden CMHs brüt gözlem, Hematoksilen ve eozin (o) boyama, Perl Prusyalı boyama, Evans mavi (EB) çift-etiketleme ve manyetik rezonans görüntüleme-duyarlılık ağırlıklı görüntüleme (MRG-SWI) teknolojisi tarafından tespit edilemedi. Son olarak, CMHs hayvan modelleri, kendi avantajları ve dezavantajları, dahil olmak üzere gelişmekte olan diğer yöntemleri de bu raporda ele alınmıştır.

Giriş

Kırmızı kan hücrelerinin beyin1' den küçük perivasküler mevduat hemosiderin gibi kan bozulma ürünleri klasik serebral microhemorrhages (CMHs) bakın. Tarama Rotterdam araştırmaya göre CMHs kişi 60-69 yaş arası yaklaşık % 17,8 ve %38.3 80 yıl2üzerinde bulunamadı. CMHs yaygınlığı yaşlılarda nispeten yüksektir ve CMHs birikimi ve bilişsel ve nöropsikiyatrik disfonksiyon arasında bir ilişki kurulmuş3,4olmuştur. CMHs çeşitli hayvan modeller son zamanlarda, tip IV collagenase stereotaksik enjeksiyon5, APP transgenik6, β-N-methylamino-L-alanin pozlama7ve hipertansiyon8tarafından indüklenen kemirgen modelleri de dahil olmak üzere bildirilmiştir, bir en iyi kabul edilen seçenek sistemik inflamasyon tarafından indüklenen CMHs ile. Fisher vd. 9 ilk LPS Salmonella typhimurium türetilmiş bir akut CMHs fare modeli geliştirmek için kullanılır. Daha sonra aynı grup aynı yaklaşım2kullanarak alt akut CMHs fare modeli geliştirilmesi bildirdi.

LPS bir standart inflamatuar uyarıcı ile mayi enjeksiyon kabul edilir. Önceki çalışmalarda LPS enjeksiyon neuroinflammation microglia büyük miktarlarda tarafından yansıtıldığı gibi neden olabilir ve2,10astrocyte harekete geçirmek içinde hayvan modelleri doğruladı. Ayrıca, neuroinflammation harekete geçirmek harekete geçirmek ve CMHs sayısı arasında pozitif bir korelasyon kurulmuş2,10olmuştur. Bu önceki çalışmalar üzerinde bağlı olarak, biz bir CMHs fare modeli geliştirmek LPS mayi enjeksiyonu ile isteniyor.

Algılama teknolojileri CMHs üzerine araştırma araştırmalar sayısındaki bir artış sonuçlandı içinde ilerler. En yaygın CMHs algılama yöntemleri şunlardır kırmızı kan hücreleri hematoksilen eozin (HE), ferrik demir algılama tarafından Prusya Mavisi9, boyama boyama tarafından algılanmasını kabul Evans tespiti (EB) ifade ayirt tarafından mavi görüntü ve 7.0 Tesla manyetik rezonans görüntüleme-duyarlılık ağırlıklı görüntüleme (MRG-SWI)10. Bu da çalışmanın tarama için CMHs bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) PLA Ordu Genel Hastanesi tarafından onaylanmıştır.

1. malzeme

  1. LPS enjeksiyon hazırlanması
    1. S. typhimurium son konsantrasyonu 1 mg/mL için türetilmiş LPS tozu 25 mg 25 mL distile su ekleyin. Enjeksiyon steril tüp 4 ° C'de depolayın
      Dikkat: LPS zehirli.
    2. EB enjeksiyon çalışma konsantrasyonu tutmak için normal % 0,9 serum fizyolojik çözüm % 2 EB çözeltilerine hazırlayın.

2. hayvanlar

  1. LPS 10 hafta yaşlı erkek Sprague-Dawley (SD) rats için yönetmek (Ortalama ağırlık: 280 ± 20 g) mayi enjeksiyonla.
    Dikkat: fareler başka bir kuruluştan satın aldıysanız, o zaman adaptif faz 7 günden az olmamalıdır.

3. LPS enjeksiyonları

  1. LPS intraperitoneally 1 mg/kg doz, her fare içine enjekte ve fareler için ev onların kafes dönmek.
    Not: Anestezi gerekli değildir.
  2. Altı saat sonra LPS enjeksiyon fareler içine aynı doz enjekte.
  3. On altı saat sonra LPS aynı doz fareler enjekte.
    Dikkat: SD fareler bir doz 1 mg/kg LPS ile enjekte bir % 5 mortalite hızında neden olabilir. Ölüm oranı daha da genç ya da yaşlı fareler veya hamile dişi rats artırmak olabilir.
  4. Fareler için onların kafes LPS enjeksiyon sonra dönün ve yiyecek ve içecek ad libitum erişim sağlar.
    Not: Fareler ayrı bir sistemik inflamatuar yanıt sergileyecek ve böylece kafesleri deney boyunca temiz kalması şarttır. Sıçanlar sık (2 x gün) ağırlık, genel görünüm ve tutum için ilk LPS enjeksiyon sonra izleme olması. Fareler bir Kambur duruş, isteksizlik taşımak için önemli kilo kaybı sergilemek başlatırsanız (> % 20), porfirin insancıl olması boyama euthanized 7 gün önce EB çalışma bitiş noktası.

4. örnek koleksiyonu

  1. EB enjeksiyon
    1. Yedi gün sonra ilk enjeksiyon anestezi sıçan tarafından onaylanmış, IACUC protokolüne göre intraperitoneally.
    2. Fareler Korneal refleks yanıt-e doğru göstermek değil kadar 1-2 dk bekleyin. 5-8 mm gerçekleştirmek-derin kalp ponksiyon üzerinde her fare; puncturing noktası 3 ve 4 kurulu alanı, göğüs kemiğinin sol kenar boşluğuna 5 mm olmalıdır.
    3. Kan kurtarma görülmektedir kadar bekleyin ve sonra EB 0.2 mL/100 g vücut ağırlığı bir doz sol kalp karıncığı enjekte.
      Dikkat: Kalp ponksiyon ve EB enjeksiyon dikkatle yapılmalıdır. EB göğüs boşluğuna veya kalp zarını yerine sol kalp karıncığı içine enjekte.
      1. Geri boş bir tüp ile emmek ve bir EB tüp önce enjeksiyon başarısızlık oranı azaltmaya yardımcı olmak için bu birim yerine (Örn., göğüs kafesi hata enjeksiyon).
    4. Fareyi 10 min için sırtüstü pozisyonda tutmak.
      Not: ayirt görüntülemede EB kaçağı tespit etmek için örnek kullanılırsa, bu adım sonra atlanabilir.
  2. Brüt gözlem
    1. Kardiyak perfusions serebral damarlara ve beyin temizlemek için buz gibi 1 M fosfat tampon serum (PBS) kullanarak gerçekleştirin.
      1. Bir neşter kullanmadan, karın bir kesi diyafram tüm uzunluğu boyunca olun.
      2. Sadece kaburga ile kesme göğüs kafesi orta hat yaptı.
      3. Göğüs boşluğuna aç. Kelepçeler kalp göstermek için ve drenaj kan ve diğer sıvıların kolaylaştırmak için kullanın.
      4. Giriş noktası sıkma o konumdaki iğne Ekle yaklaşık 5 mm. için genişletmek için sol ventrikül çıkıntı içine bir iğne güvenli doğrudan tutarken sürekli kalp (kalp hala yenerek) forseps ile.
        Dikkat: iç duvarı delip olarak çözümler dolaşımını uzlaşma aşırı iğne genişletmek değil.
      5. Yaklaşık 20 mL/dk bir perfüzyon pompa kullanarak yavaş ve istikrarlı bir hızda akışı buz gibi PBS çözüm (200-300 mL) izin vermek için vana serbest bırakın. Hayvanlar fiksasyon brüt gözlem yerine gerektiriyorsa, buz gibi % 0,9 serum fizyolojik çözüm aynı doz kullanın.
      6. Keskin makas kullanırken, bir kesi çözüm sürekli akar sağlanması avluda olun. Sıvı serbestçe akmaz veya hayvanın burun veya ağız gelen, iğne yeniden konumlandırın.
    2. Brüt gözlem tarafından ekran CMHs için.
      Not: örnek CMHs sayısını hesaplamak için brüt gözlem tarafından kullanılırsa, sonra bu adımı ihmal.
  3. Fiksasyon
    1. Kardiyak perfusions serebral damarlara temizlemek için buz gibi % 0,9 serum fizyolojik çözüm (200-300 mL) ve beyin kullanarak gerçekleştirin.
    2. Kardiyak perfusions buz gibi %4 paraformaldehyde fiksasyon için kullanarak gerçekleştirin.
    3. Fareyi başını kesmek, beyin ayırma ve % 20 sükroz çözüm için en az 6 h beyinde bırakın.
    4. % 30 sukroz ve düzeltme başka bir 6 h. için çözüm değiştirmek
  4. 10 mm kalınlığında beyin dokuları bölümleri bir cryostat kullanarak hazırlayın.

5. O boyama

Not: Bu yordam bir o Kit boyama kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Slaytlar distile suda yıkayın.
  2. 8 dk. yıkama hematoksilen çözümde musluk suyu 5 min için çalışan leke.
  3. Musluk suyu 1 dk. için çalışan 30 s. Yıkama için % 1 asit alkol ayırt etmek.
  4. Leke % 0,2 Amonyaklı su (mavileştirme) veya doymuş Lityum Karbonat çözüm için 30 s 1 dk. yıkama musluk suyu 5 min için çalışan için.
  5. % 95 alkol (10 dips) durulayın.
  6. Counterstain eozin çözüm için 30 ile 1 dk s.
  7. % 95 alkol, 5 min için mutlak alkol iki değişiklik ile kurutmak.
  8. Net 30 ksilen içinde s.
  9. Liu'nun yöntemi9kullanarak bağlayın.
  10. Aydınlık alan floresan mikroskop kullanarak analiz.
    Not: kırmızı kan hücreleri CMHs bileşenleri olan kan damarlarının yayımlanan kırmızı-turuncu o boyama altında görünür.

6. Perl Prusya Mavisi boyama

Not: Bu yordam Perls boyama seti kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Slaytlar distile su ile yıkayın.
  2. Ferrocyanide ve hidroklorik asit, 10 min için eşit parçaya karışımı ile reaksiyon çözümde leke.
  3. Kurutmak, Sil, mount ve slaytları 5,7-5.10 adımlarda açıklandığı gibi analiz.

7. EB çift-boyama

Not: Bu yordam adım 4.1.3 izler.

  1. Slaytlar PBS ile 5 min için üç kez yıkayın.
  2. Slaytlar ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  3. PBS çözüm 5 min için üç kez slaytlarla yıkayın ve slaytlar PBS-gliserol çözüm ile bağlayabilirsiniz.
  4. Floresan mikroskop görüntülerde analiz. EB ifade kırmızı floresans tarafından belirtilir; çekirdek tarafından mavi floresans gösterilir.

8. MR SWI

  1. MRI aktif korumalı bir degrade sistemi (16 cm iç çapında) ile donatılmış bir 7-T mıknatıs gerçekleştirin.
  2. Yedi gün sonra tedavi, fareler bir isoflurane anestezi sistemi kullanarak 1.5-%2.0 isoflurane sağlamlılık zehirlenmesinden anestezi.
  3. Veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için fareyi gözleri üzerine uygulayın.
  4. Fareler eğilimli pozisyonda tutun ve bir Mr-SWI taraması gerçekleştirin.
  5. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir hızlı-spin yankı sırası kullanılarak ağırlıklı SWI taramaları elde etmek: zaman (TE) 8 ms, echo tekrarlama (TR) 40 ms zaman, fiske vurmak açı 12 1 mm kalınlığında dilimler elde etmek için °, görüş alanı (FOV) 35 mm × 35 mm, edinme matris 384 × 384, =.
  6. CMHs Mr-SWI Greenberg ve ark. göre tanımlamak Aşağıdaki ölçütlere dahil 11,: (1) (2) dairesel, izole ve düşük sinyal şiddeti noktalar ve ≤10 mm çapında.
  7. Deney sonunda, aşırı dozda karbon dioksit (6 L/min akışı) veya konteyner hacmi %30 yöntemini kullanarak fareler ötenazi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CMHs çeşitli yaklaşımlar kullanarak tespit edilebilir. En iyi kabul edilen yöntemler şunlardır: (1) Brüt gözlem ve değerlendirme yüzey CMHs ( Şekil 1' de üst panel gösterilen); (2) o kırmızı kan hücreleri (gösterildiği Şekil 2A, üst panel) veya algılama ferrik demir boyama Prusya tespiti için boyama kırmızı kan hücreleri (Şekil 2A, alt panel); lizis türetilmiş (3) BBB sızıntı (paneli yaptı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Araştırma çalışmaları CMHs üzerinde son birkaç yılda artmıştır. Ancak, CMHs mekanizması bilim adamları bu belirli bir koşula taklit hayvan modeller kurmak isteyen, belirsizdir. Örneğin, Hoffmann vd. CMHs hipoksi ve serebrovasküler autoregulation12bozulmasına neden olduğu gösteren hipoksi indüklenen CMHs fare modeli geliştirdi. Reuter vd. 5 bu serebral amiloid angiopathy önemli bir rol CMHs. Fisher ve ark. etyolojisinde bildirdi LPS enjeksiyon

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz öğretmen Jian Feng Lei ve sermaye Tıp Üniversitesi meslektaşlarıyla MRG sırasında rehberlik için teşekkür ederiz. Biz de Jing Zeng Nöroloji ikinci People's Hastanesi teknik destek sağlamak için Yichang dan teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Enflamasyon indüksiyonu içinLPSSigma-AldrichL-2630
EB sızıntı tespiti içinEBSigma-aldrichE2129
DAPI boyama solüsyonuServicbioG1012için sayım ortamı
s Prusya boyamaSolarbioG1424Prusya boyama kiti
HE boyamaSolarbioG1120HE boyama için kit
kloral hidratSigma-Aldrich47335UAnestezi için
fosfat tampon salin (PBS)SolarbioP1022deneyde yaygın olarak kullanılan bir tür tampon çözelti
%0.9 tuzlu su çözeltisiHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Çinperfüzyon
paraformaldehitSigma-Aldrich158127fiksasyon için yaygın olarak kullanılan bir tür çözeltidir
%20 sükroz çözeltisiSolarbioG2461fiksasyon için yaygın olarak kullanılan bir tür çözelti
%30 sükroz çözeltisiSolarbioG2460fiksasyon
veteriner merhemiSolcoseryl göz jeli, Bacel,sıçan gözlerinin korunması için
IF Perl' , için çözüm , , için yaygın olarak kullanılan bir tür çözeltidir İsviçre

Kaynaklar

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Evans Blue BoyamaHematoksilin ve Eozin BoyamaPrusya Mavisi BoyamaManyetik Rezonans G r nt lemeSuseptibilite A rl kl G r nt lemeKardiyak Perf zyonBeyin Dokusu Kesit AlmaFloresan Mikroskobu
Alt akut serebral Microhemorrhages sıçanlarda Lipopolysaccharide enjeksiyonla indüklenen
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.