Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58439

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Autoimmunity, Transplantation and Inflammation, Novartis Institutes for BioMedical Research

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Özet

Çok sayıda çalışma tarafından ele onun fonksiyonu yanında lenfoid hücrelerde paracaspase MALT1 da doğuştan gelen hücrelerin aşağı desen tanıma reseptörleri önemli bir rol oynar. En iyi okudu bir SYK ve CARD9 art arda sıralı bir MALT1 bağlı şekilde NF-κB harekete geçirmek için önde gelen sinyal bağımlı neden Dectin-1 ve Dectin 2 C tipi lektin benzeri reseptör aile üyesidir. Buna karşılık, Toll benzeri reseptörler (TLR), TLR-4 gibi NF-κB harekete geçirmek ama bir MYD88/Irak-bağımlı cascade üzerinden sinyal yaymak. Yine de, ister MALT1 TLR-4 sinyal için katkıda belirsiz kalmıştır. Son kanıtlar ile MIT-827, güçlü ve selektif inhibitörü olan MALT1 paracaspase etkinlik, MALT1 olan TNF-üretim aşağı TLR-4 insan myeloid hücrelerin Dectin-1, bağımsız olarak MALT1, TNF-üretim akıntıya karşı olduğunu gösterir bağımlı. Burada, biz MALT1 seçici katılımı daha da algılama, insan ve fare hücresel ürünleri ve Dectin-1, MINCLE veya TLR-4 yolları uyarılması çeşitli kullanarak örüntü tanıma içinde ele. Biz de sitokinler ötesinde TNF-keşfetmek ve MIT-827 SYK inhibitörü (Cpd11) ve bir IKK inhibitörü (AFN700) karşılaştırma ek anlayışlar sağladı. Topluca, sağlanan verileri C tipi lektin benzeri reseptör MALT1-bağımlılık için daha fazla kanıt — buna karşılık TLR sinyalli için sinyal.

Giriş

MALT1 paracaspase etkinliği (mukoza ilişkili lenfoid doku Lenfoma translocation protein 1) 20081,2' ortaya koydu. O zamandan beri çalışmalar bir dizi kritik katkısının antijen reseptör yanıtları lenfositler bildirdin. Genetik modelleri T hücreleri, T-hücre bağımlı otoimmünite ve B hücreli lenfoma ayarları3,4önemli bir rol Farmakoloji veri desteği yanı sıra Mouse. Lenfosit, derleme antijen reseptör proksimal sinyal tarafından tetiklenen bir CARD11-BCL10-MALT1 karmaşık5' in üzerine MALT1 paracaspase etkinleştirme oluşuyor T veya B hücre reseptörü aşağı. Ayrıca benzer bir CARD9-BCL10-MALT1 kompleksi örneğin C tipi lektin-benzeri reseptörler (CLLR), akıntı yönünde sinyaller yayma için önemlidir yeterli kanıt olduğunu, Dectin-1, Dectin-2 ve MINCLE içinde myeloid hücrelerin6,7. Dectin-1, özellikle de bu yolu mantar enfeksiyonları8,9karşı ana savunma için önemli olduğundan çalışılmıştır. MALT1 dolaylı olarak Toll benzeri reseptör (TLR) yollar, ancak, tartışmalı10kalmıştır. Son kanıtlar insan myeloid hücrelerin TNF-üretim aşağı TLR-411tür ile MALT1 paracaspase etkinliği için doğrudan bir rol dışarı karar verdi.

Mevcut çalışma, biz çeşitli deneysel ayarları ve uyarıcı koşullarda insan ve fare myeloid hücrelerin belirli farmakolojik aracı inhibitörleri ve ölçüm sitokin üretiminin güvenerek doğuştan gelen sinyal yolları, soruşturma için kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler kuralları ve standartları Novartis insan araştırma etik kurulu göre yapılmıştır.

1. hazırlık periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) insan Buffy kat

Not: Bir gün sonra 50 mL çanta koleksiyonunda sağlıklı gönüllü buffy kat aldık. Onlar onam altında sağlanan ve Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuztoplanan. Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında, aşağıdaki yordamı kullanarak idare ettik.

  1. Makas ve bir 1 L ölçek (altında lamina akışı) plastik bir torba ile steril ve temiz bir çifti hazırlayın.
  2. Buffy kat kabı aktarmak ve dikkatle makas ile açın.
  3. 25 mL pipet kullanarak eklemek 100 mL fosfat tamponlu tuz arabellek/ethylenediaminetetraacetic asit (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 hiçbir CaCl2 ve hiçbir MgCl2, içeren takviye ile 2 mM EDTA pH 8.0).
    Not: İstimal ayni pipet ve yavaş yavaş çözüm yukarı ve aşağı pipetting sonra seyreltilmiş buffy kat 25 mL 50 mL polisakkarit tabanlı yoğunluk gradient 15 mL ile önceden dolu 6 konik santrifüj tüpler içine dağıtmak.
  4. Orta ivmesi (4 dışarı-in 9'ayarla) vasıl 800 x g 20 dk santrifüj kapasitesi ve onların yoğunlukları dayalı hücreleri ayrılması için izin vermek için fren olmadan.
    Not: Santrifüjü sonra üç katmanı görünür hale gelir; kırmızı kan hücreleri ve granülosit, plazma ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) içeren bir beyaz yüzük arasında yapılan bir üst katman içeren bir pelet.
  5. Bir 10 mL pipet ve yeni 50 mL tüpler için transfer kullanarak PBMC yüzük hasat.
    Not: 2-3 50 mL tüpler normalde buffy kat gereklidir. Bu aşamada, bazı plazma büyük olasılıkla herhangi bir etkisi sonraki zenginleştirme merdivenlerinde olmalıdır toplanan PBMCs kirlenmektedir.
  6. İlâ 50 mL her tüp PBS/EDTA kullanarak üst ve azalan Santrifüjü zaman ve hız (520 x g, 330 x g, 10 min, 150 x gde 8 dk, 15 dk) ile üç ardışık yıkar geçin.
    Not: Her adımda, süpernatant kapalı bir sıvı atık kap içinde dökülür ve hücre Pelet PBS/EDTA 50 mL resuspended (Granül havuza alınmış sonra ilk yıkama).
  7. Son yıkama sonra Pelet buz gibi lizis arabelleği 25 mL resuspend (kırmızı kan hücrelerinin ozmotik basıncı parçalayıcı için Malzemeler tablobkz:).
  8. Çözüm açık hale gelinceye kadar kuluçkaya (Oda sıcaklığında ≤5 dk).
  9. Reaksiyon ayrılık arabelleği (PBS 1 x pH 7.4 hiçbir CaCl2 ve % 2 ısı inaktive fetal Sığır serum ile (FBS) takıma hiçbir MgCl2, içeren ve 1 mM EDTA pH 8.0) 25 mL ekleyerek durdurmak.
  10. Bir kez daha vasıl 150 x g 8 dakika yıkayın.
    Not: Bu aşamada PBMCs toplu nüfus kullanılabilir (bkz. Adım 3: PBMCs ve monosit tedaviler ve uyarıcı koşullar) veya monosit zenginleştirme için işlenen (bkz. Adım 2: monosit PBMCs üzerinden hazırlanması), ya da buz aşağı sonraki kullanım için (bkz: adım 5: Monosit ve yordamlar donma/çözülme PBMCs).

2. monosit PBMCs üzerinden hazırlanması

  1. Ayrılık arabellek 1,10 adımda elde PBMCs resuspend ve bunları 5 x 107hücre/mL ulaşmak için kabul.
  2. Hücre süspansiyon 14 mL konik santrifüj tüpü kap ile içine aktarın.
  3. Monosit zenginleştirme antikor hücre süspansiyon, mL kokteyl 50 µL eklemek girdap ve 4 ° C'de 10 dakika kuluçkaya
  4. Monosit zenginleştirme boncuk mL hücre başına 50 µL ekleyin.
    Not: Boncuk iyice süspansiyon polimerlerin sağlamak için vortexed olması gerekir.
  5. Boncuklar, kısa bir süre sonra girdap hücre süspansiyon ekleme ve kuluçkaya 4 ° C'de 5 dk sonra
  6. Tüp 10 mL doldurulana kadar ayrılık arabellek ile tüp üst kısmındaki durulayın.
  7. Yavaş yavaş çözüm yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
  8. Tüp cap olmadan bir ayrılık mıknatıs yerleştirin.
  9. 2.5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  10. Yavaş yavaş bir 15 mL konik santrifüj tüpüne dökün.
  11. Bu aşamada, monosit doğrudan kullanın (bkz. Adım 3: PBMCs ve monosit tedaviler ve uyarıcı koşullar) veya bunları mmature Monocyte türetilmiş Dendritic Cells (iMoDCs) benayırt (bkz. Adım 4) veya sonraki kullanım için bunları dondurmak (bkz. Adım 5).

3. PBMCs ve monosit tedaviler ve uyarıcı koşulları

  1. Saymak hücreleri ve onları kültür ortamında seyreltik (Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI) %10 FBS + 1 mM sodyum Pyruvate + 100 U/mL penisilin streptomisin (kalem/Strep) + 5 mikron β-mercaptoethanol), 1,25 x 104 hücreleri/iyi aşağı.
  2. Hücre süspansiyon 384-şey plaka kuyu başına 30 µL dağıtın.
  3. 4 konsantre bileşik çözümleri x 15 µL ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO21 h için önceden kuluçkaya.
  4. Lipopolysaccharide (LPS) 10 ng/mL, son bir konsantrasyon için ekleme veya 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon zymosan (DZ) tükenmiş veya düz ortamda tutmak.
  5. Gecede 37 ° C, % 5 CO2kuluçkaya.
  6. TNF-a salgılanan düzeylerini ölçmek için süpernatant ile 10 µL al (bkz. Adım 7: sitokinler ve canlılığı ölçümler).

4. monosit farklılaşma iMoDCs ve uyarıcı koşullar içine

  1. Monosit (vasıl adım 2 zenginleştirilmiş) sayısı ve hücre süspansiyon vasıl 520 x g 5 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant pipet ve kültür orta ekleyin (RPMI + % 10 x 106 hücre/mL 0,4 bir son hücre askıya almak için FBS.
  3. 80 ng/mL rekombinant insan Il-4 + 100 ng/mL GM-CSF ekleyin.
  4. Hücre süspansiyon 6-şey plaka bir kuyu başına 5 mL dağıtmak.
  5. 37 ° c, % 5 CO27 gün kuluçkaya.
  6. Gün 7, yavaşça onların harekete geçirmek önlemek için pipetting tarafından hücre hasat.
  7. 5 min için 520 x g , santrifüj.
  8. Vakum aspiratı ve büyüme faktörleri olmadan kültür ortamının 50 ml resuspend.
  9. Vasıl 520 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve 1 x 106 hücre/mL kültür ortamında, resuspend.
  10. Hücre süspansiyon (105 hücreleri), 100 µL 96-şey düz alt plaka kuyu dağıtmak.
  11. 37 ° C'de 50 ekledikten sonra 1 h için önceden incubate µL 4 x 8 adımda açıklandığı gibi hazırlanan bileşik çözümleri konsantre: bileşikler hazırlık.
  12. 50 µL uyaranların (4 x) konsantre, hazırlanan 9 adımda açıklandığı gibi ekleyin.
  13. 37 ° C'de 24 saat kuluçkaya
  14. Her şey ve transfer hücreleri ve (SN) süpernatant 96-şey V-alt plaka karıştırın.
  15. Spin aşağı 475 x g 5 min için de.
  16. Süpernatant yeni bir 96-şey düz alt plaka aktarmak, mühür ve daha fazla kullanılmasını kadar-20 ° C'de dondurmak.

5. monosit ve PBMCs yordamları donma/çözülme

  1. Buz gibi
    1. Spin aşağı PBMC veya monosit hücre hazırlıkları vasıl 520 x g 5 dak.
    2. Vakum süpernatant Aspire edin ve hücreleri orta 1 x 107 hücre/mL, dondurma resuspend.
    3. Hücre süspansiyon 1 mL cryotubes dağıtmak, tüpler için belirli bir soğutma aygıtı transfer (bkz: malzemeler tablo) ve-80 ° C'de yer
  2. Çözdürme
    1. Cryotube çözülme ve hızlı bir şekilde içeriğini kültür ortamının 9 mL içeren bir 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
    2. 5 min için 520 x g , santrifüj.
    3. Vakum aspiratı süpernatant ve resuspend hücre Pelet kültür orta 5 ml. Şimdi daha fazla deneysel işleme için hazır hücrelerdir.

6. fare dalak hücreleri hazırlık ve tedavi

Not: Biz hayvan kurban kuralları ve standartları Novartis hayvan refah kuruluşun göre yapılan. Çalışmalar bölgesel hükümet yetkilisi Etik Komitesi tarafından kabul (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılan isoflurane tarafından aşırı pozlama, hayvanlar kurban.

  1. Dalak hasat ve mekanik doku değirmeni aygıt ile donatılmış ve soğuk RPMI orta 5 mL ile dolu bir tüp kullanarak doku ayırmak.
  2. Organları öğütmek için ayrılma makinenin dalak programını kullanın.
  3. Hücreleri 100 mm naylon hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
  4. Süspansiyon 50 mL tüpler ve 320 x g, 10 min için 4 ° C'de santrifüj içine aktarın.
  5. Vakum aspiratı süpernatant, hücre Pelet 3 mL buz gibi lizis arabellek resuspend ve ≤2 min buz için kuluçkaya.
  6. Lizis RPMI orta 7 mL ekleyerek durdurmak.
  7. Yine bir 100 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
  8. Spin aşağı vasıl 330 x g 4 ° C'de 10 dakika için hücre süspansiyon
  9. Aspiratı süpernatant vakum ve hücreleri 11 x 106 hücre/mL tam orta (RPMI %10 FBS, 100 U/mL kalem/adım ve 5 mikron β-Mercaptoethanol ile birlikte), resuspend.
  10. 1 x 106 hücreler/iyi (90 µL) bir 96-şey plaka (düz dipli) plaka.
  11. 20 x 5 µL konsantre daha önce RPMI ortamda 8.3 adımda anlatıldığı gibi seyreltilmiş bileşik çözüm ekleyin: fare dalak hücreler için seri seyreltme.
  12. 30 dk 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.
  13. 20 x 5 µL DZ (son konsantrasyonu 30 µg/mL) konsantre veya 20 x konsantre LPS + IFN-g (TLR-4) (son konsantrasyonu 1 µM LPS ve 10 ng/mL IFN-g) ekleyin.
  14. Gecede 37 ° C, % 5 CO2kuluçkaya.
  15. 330 x g , santrifüj 10 dk için.
  16. Supernatants Yeni tabaklar içinde transfer, mühür ve daha fazla kullanılmasını kadar-20 ° C'de dondurmak.

7. sitokinler ve canlılığı ölçümleri

  1. TNF-a insan ölçüm HTRF (homojen zaman çözüldü floresan) tarafından
    Not: İletişim kuralı kısaca aşağıda özetlenmiştir tedarikçi firmanın tavsiyeleri takip.
    1. 1 (anti TNF-a-cryptate ve XL665 anti TNF) Sulandırılan reaktif hacmi sulandırma arabellek (50 mM fosfat tampon pH 7,0, 0, 8 M potasyum florür (KF), % 0,2 sığır serum albumin (BSA)) 19 birimleri ile karıştırın.
    2. İki kullanıma hazır antikor çözüm 1:1 sadece reaktifleri dağıtımı önce karıştırın.
    3. Supernatants adım 3.6 beyaz 384-şey tabak içine 10 µL dağıtmak.
    4. Antikor Mix 10 µL dağıtmak.
    5. Bir mühürleyen ile plaka kapak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
    6. Plaka üzerinde bir Mikroplaka Okuyucu (50-200 flash) okuyun.
  2. İnsan IL-23 ölçüm HTRF (homojen zaman çözüldü floresan) tarafından
    Not: İletişim kuralı kısaca aşağıda özetlenmiştir tedarikçi firmanın tavsiyeleri takip.
    1. Bir birim (anti IL-23-cryptate-antikor ve anti-IL-23 D2-antikor) Sulandırılan reaktif algılama tampon #3 19 birimleri ile karıştırın.
    2. İki kullanıma hazır antikor çözüm 1:1 sadece reaktifleri dağıtımı önce karıştırın.
    3. Supernatants adım 3.6 beyaz 384-şey tabak içine 10 µL dağıtmak.
    4. Antikor Mix 10 µL dağıtmak.
    5. Bir mühürleyen ile plaka kapak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
    6. Plaka üzerinde bir Mikroplaka Okuyucu (50-200 nm flash) okuyun.
  3. İnsan Il-6, Il-8, IL-1β ve TNF-α ölçümleri electrochemiluminescence tarafından
    Not: Tüm örnekleri 1/150 Dilüent 2 seyreltilmiş (ilk seyreltme: 150 µL 10 µL sonra 180 µL 20 µL). Protokol tedarikçi firmanın tavsiyeleri takip:
    1. Örnekleri ve standart Dilüent 2 oranında seyreltin.
    2. Dilüent 2 1/4 seri kat dilüsyonu kullanılarak Standart seyreltme için devam edin.
    3. Tabak yıkama arabelleği ile üç kez yıkayın.
    4. Örnekleri veya standart iyi başına 50 µL dağıtmak.
    5. Ajitasyon altında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    6. Dört kez PBS + % 0.05 ile tabak yıkama Polysorbate 20.
    7. Algılama antikor (her antikor için 3 mL son 60 µL) 25 µL Dilüent 3'te ekleyin.
    8. Ajitasyon altında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    9. Dört kez PBS + % 0.05 ile tabak yıkama Polysorbate 20.
    10. Bubbles kaçınmak, okuma tamponu kuyu başına 150 µL eklemek (tripropylamine, içeren Tris tabanlı arabellek seyreltilmiş GKD20 2 x) olarak electrochemiluminescence uzun ışık üretimi için ortak bir kapatsınlar.
    11. (Gecikme) olmadan plaka üzerinde bir multiplex plaka okuyucu okumak.
  4. Fare TNF-a tedarikçinin protokol sonrası ELISA tarafından ölçüm
    1. 1: tahlil seyreltici (protein içeren bir arabellek kullanmaya hazır) 1 süpernatant sulandırmak.
      1. Reaktifler, örnekler ve standart dilutions Kit'te açıklandığı şekilde hazırlayın. Testin Dilüent 50 μL her şey için ekleyin.
      2. 50 μL standart, denetim veya örnek iyi başına ekleyin.
    2. Plaka çerçevesi 1 dk. için hafifçe dokunarak karıştırın.
    3. Sağlanan yapıştırıcı şerit ile kapak ve oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    4. Her iyi ve yıkama 400 μL/iyi (Bu adım toplam beş kez tekrar) ile Aspire edin.
    5. Son yıkama sonra kalan herhangi bir yıkama arabellek tarafından alıyorum kaldırın.
    6. Plaka ters çevir ve karşı temiz kağıt havlu leke.
    7. Fare TNF-α eşlenik 100 μL her şey için ekleyin. Yeni bir yapıştırıcı şerit ile kapak.
    8. Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    9. Aspirasyon/yıkama adım 7.4.4 olduğu gibi tekrar.
    10. Her şey için 100 μL substrat çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    11. Seyreltik hidroklorik asit çözüm (durmak eriyik) 100 μL her şey için ekleyin. Ayrıntılı karıştırma sağlamak için plaka hafifçe dokunun.
    12. 450 de optik yoğunluk ölçmek nm (560 ayarla düzeltme dalga boyu ile nm) Mikroplaka Okuyucu (30 dk içinde yapılması gereken) kullanarak.
  5. Hücre canlılığı
    1. Supernatants PBMC veya monosit hazırlıkları çıkardıktan sonra % 10 son konsantrasyonu hücre süspansiyon doğrudan eklenen resazurin çözümü (korunmada gereken indirgeme potansiyelini göstergesi) kullanmak için bir hazır kullanarak hücre canlılığı değerlendirmek.
    2. 1-2 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.
    3. Floresans 590, okumak bir Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm (uyarma 540 nm).

8. bileşik hazırlık

  1. İMoDCs için seri seyreltme
    1. MIT-827 hisse senedi çözüm (dimetil sülfoksit (DMSO) bir seferde (4 x konsantre) 8 µM ulaşmak için orta içine 10 mM. seyreltik
    2. Kullanarak orta + %0,08 DMSO altı-adım 1:5 seri seyreltme gerçekleştirin. Aynı orta + %0,08 DMSO çözeltisi için araç (bileşik) koşul kullanın.
  2. Tek doz iMoDCs için test
    1. MIT-827, AFN700 ve Cpd11 hisse senedi çözümler tek seferde (4 x konsantre) 4 µM ulaşmak için orta içine oranında seyreltin.
  3. Fare dalak hücreler için seri seyreltme
    1. (Bir git seyreltme ortamda takip bir 10 mM hisse senedi çözüm elde edilen) bir 10 µM MLT-827 çözüm DMSO son konsantrasyonu % 0.1 ile 0,01 µM oranında seyreltin.
    2. Seyreltme adımlar için her seyreltme 2 µL al, 38 µL RPMI ve damlalıklı 5 µL kuyunun içine ekleyin.
      Not: Tüm tedaviler nüsha gerçekleştirilir.

9. uyaranlara hazırlık

  1. Tükenmiş zymosan (DZ)
    1. DZ için 10 mg 2 mL steril su endotoksin-ücretsiz Ekle
    2. Stok belgili tanımlık eriyik, girdap da önceki her kullanımdan homojenize girdap.
    3. -20 ° C'de aliquot çözüm ve mağaza aliquots
  2. Trehalose-6,6-dibehenate (TDB)
    1. DMSO 100 µL 1 mg TDB, 15 – 30 s için bir su banyosunda 60 ° C'de ısı ekleyin.
    2. Girdap ve hemen steril PBS, girdap tekrar 900 µL ekleyin.
    3. 10-15 dk 60 ° C'de ısı ve vortexing rahip tarafından her kullanımdan lunaparkçı.
    4. Çözüm 4 ° C'de tutmak
    5. Seri dilutions ve tek doz hazırlık MLT-827 bileşik gelince gerçekleştirin.
      Not: TDB DMSO içinde hazırlanması gerekir çünkü bir son %1 DMSO konsantrasyonu hücre stimülasyon sırasında mevcuttur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Myeloid hücrelerin içinde harekete geçirmek sinyalleri aşağı Dectin-1, Dectin-2 ve MINCLE6gibi birkaç C tipi lektin-benzeri reseptörler MALT1 aktarır. Bu yollar üzerinde (hem) ITAM motifi içeren reseptörleri itimat (örneğin, Dectin-1) veya ITAM motifi içeren ortak reseptörleri (örneğin, FcRγ, Dectin-2 ve MINCLE için) bu işe ve SYK kinaz (Şekil 1) etkinleştirin. Bu bir protein kinaz C izoformu, yani PKCδ, CARD9, böylec...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, insan sinyal yolları ve fare doğuştan gelen hücreler çalışma ve kendi bağımlılık MALT1 proteolitik işlevi sorguya basit deneysel ayarları kullanılır. Önceki çalışma11tarihinde genişletilmesi, bizim çalışma MALT1 paracaspase etkinliği C tipi indüklenen lektin benzeri reseptör sitokin üretim, TNF-α da dahil olmak üzere denetler gösterdi. Buna ek olarak, TLR-4-indüklenen TNF-α her iki tür MALT1 bağımsız. Toplu olarak, bu veri hangi önceki çalışmalar6,<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Elsevier burada Şekil 2A Unterreiner vd yeniden kendi yetkilendirme (lisans numarası 4334770630127) için teşekkür ederiz (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 ve mikro; m naylon hücreli süzgeçSigmaCLS431752
14 mL Falcon tüpBD Falcon352057
15 mL Falcon tüpFalcon352090
50 mL Falcon tüpFalcon352070
6 kuyulu plakaCostar3516
96 kuyulu düz tabanlı plaka, düşük buharlaşma kapaklıCostar3595
96 kuyulu V-alt plakaCostar734-1798
Amonyum Klorür - NH4ClSigmaA9434
Test seyreltici RD1-W ELISAR& D895038Seyreltici Deney Hücre
kültürü mikroplakası, 384 kuyu, siyahGreiner781986
Tükenmiş ZymosanInvivogentlrl-dznşimdi: tlrl-zyd
Dimetil sülfoksitSigmaD2650DMSO
EDTA-Na2< / sub>SigmaE5134Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat
ELISA muTNF-&alfa;Ar-Ge DSMTA00
Ficoll-Paque PlusGE Sağlık17-1440-03
gentleMACS C tüpleriMACS Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS ayrıştırıcıMACS Miltenyi Biotec130-093-235
GM-CSFNovartis-Isı
ile inaktive edilmiş Fetal sığır serumuGibco10082FBS
HTRF hu IL-23CisBio62HIL23PEG
HTRF hu TNF-&alfa;CisBio62TNFPEC
HTRF sulandırma tamponuCisBio62RB3RDE50mM Fosfat tamponu, pH 7.0, 0.8M KF, %0.2 BSA
IFN-&gama;Ar-Ge DL4516
IL-4Novartis-İzofluran
AbbottForene
Lipopolisakkaritler (LPS)SigmaL4391İnsan örneklerinde kullanılan LPS
LipopolisakkaritlerSigmaL4516Murin örneklerinde kullanılan LPS
Lizis tamponuKendindenyapılan-155mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
MıknatısKök Hücre18001
Mikroplaka, 384 kuyu beyazGreiner784075
Monosit zenginleştirme kitiKök Hücre19059
Nalgene Bay Frosty Cryo 1 & deg; C Dondurma KabıNalgene5100-0001soğutma cihazı (Propanol-2 içeren)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2Gibco10010Fosfat tamponlu salin
Penisilin/StreptomisinGibco15140Kalem/Strep
Potasyum bikarbonat - KHCO3SigmaP9144
PrestoBlueInvitrogenA13262Canlılık değerlendirmesi için Resazurin çözeltisi
Propanol-2Merck1.09634
Okuma tamponuMesoScale DiscoveryR92TC-3Tripropilamin içeren Tris bazlı tampon
Geri kazanım hücre kültürü dondurma ortamıGibco12648-010dondurma ortamı
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) GlutamaxGibco61870+ ile iMoDC'ler
için %10 FBS + %10 FBS + 1 mM Sodyum Piruvat + 100 U/mL Kalem/Strep + 5 &mikro; İnsan PBMC'leri ve monositleri için M ve beta;-merkaptoetanol
+% 10 FBS + Kalem / Strep + 5 &mikro; Murin splenositleri için M β-merkaptoetanol
Ayırma tamponuKendindenyapılmış-PBSpH 7.4 +% 2 FBS + 1 mM EDTA pH 8.0
Sodyum PiruvatGibco11360
Trehaloz-6,6-dibehenatInvivogentlrl-tdbTDB
Tween 20SigmaP7949Polisorbat 20
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15675Etilendiamintetraasetik asit
Viewseal mühürleyenGreiner BioOne676070
V-PLEX Proinflamatuar Panel 1 İnsanKiti MesoScaleKeşfi K15049Delektrokemilüminesan multipleks testi (IL-1 ve beta;, TNF-&alfa;, IL-6, IL-8)
ve beta; -MerkaptoetanolGibco31350

Kaynaklar

  1. Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
  2. Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
  3. Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
  4. Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
  5. Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
  6. Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
  7. Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  8. Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
  9. Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
  10. Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
  11. Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
  12. Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
  13. Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
  14. Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
  15. Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
  16. Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
  17. Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
  18. Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
  19. Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).
  20. Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , In press (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dectin-1 YolağıTLR-4 Sinyal iletimiSYK İnhibitörü Cpd11IKK İnhibitörü AFN700MLT-827 BileşiğiPeriferik Kan Mononükleer HücreleriTNF Alfa ÖlçümüSeri Dilüsyon Protokolü
Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.