Method Article

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

DOI:

10.3791/58451

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Receptor Discovery group, Microchemistry, Proteomics and Lipidomics Department, Genentech, 2Portfolio Management and Operations, Genentech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salgılanan faktörler, membran hayvan zinciri reseptörleri ve etkileşen eşleri hücresel iletişim ana düzenleyiciler ve inisiyasyon cascades homeostazı ve hastalık sırasında sinyal ve bu nedenle ana tedavi hedefleri temsil. Kendi alaka rağmen bu etkileşim ağları önemli ölçüde geçerli veritabanlarında underrepresented kalır; Bu nedenle, en hücre dışı proteinler belgelenmiş bağlama ortak var. Öncelikle fonksiyonel proteinler ve zayıf, düşük benzeşme kez hücre yüzey reseptörlerinin arasında kurulan protein etkileşimleri ifadesi de dahil olmak üzere hücre dışı proteinler incelenmesi ile ilgili sorunlar nedeniyle bu tutarsızlık olduğunu. Bu yöntemin amacı bir kütüphane Mikroarray kartvizitlere protein-protein etkileşimleri ile taranması için hücre dışı proteinlerin baskısı tarif etmektir. Zayıf etkileşimlerin algılamasını etkinleştirmek için multimerization sorgu protein altında eğitim dayalı bir yöntemi açıklanmıştır. Artan multivalency için bu multimerization microbead tabanlı yaklaşımın birleştiğinde, protein mikroarray geçici protein-protein etkileşimlerinin sağlam algılama içinde yüksek üretilen iş sağlar. Bu yöntem bir hızlı ve düşük örnek tüketen-yaklaşım yeni etkileşimler ilgili ekstraselüler herhangi bir protein tanımlanması için sunuyor. Protein mikroarray baskı ve protokol filtreleme açıklanmıştır. Bu teknoloji araştırmacılar protein etkileşimleri ekstrasellüler alanda keşfi için sağlam bir yöntem arayışı için faydalı olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gözden yöntemi Mikroarray biçiminde, bu kütüphane karşı ilgi bir hedef ile taranması için bir yöntem ve ardından hücre dışı proteinler topluluğu yazdırma işlemi açıklar. Biz düşük bağlama benzeşim tarafından karakterize etkileşimleri algılanması için çok önemli bir adım olarak protein multimerization belirledik. Bu etkileşimlerin algılama geliştirmek için üzerinde ilgi lastikteki kullanarak sorgu proteinin multimerization dayalı bir iletişim kuralı açıklar.

Salgılanan ve hücresel iletişim, sinyal ve microenvironment ile etkileşim anahtar düzenleyiciler (toplu olarak adlandırdığı hücre dışı proteinler) hücre yüzey-proteinlerin etkileş....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre dışı insan proteinler Kütüphanesi nesil

  1. Hücre yüzey reseptörlerinin veya protein mikroarray kütüphane oluşturmak ilgi salgılanan proteinler listesini derleyin. Belirli protein aileler (örneğin, immünglobulin süper) ya da proteinler seçmeli olarak özellikle türleri çalışma için seçili hücrenin dile getirdi.
  2. Hücre için yüzey reseptörlerinin, sinyal peptid ve yazılım araçları kullanarak transmembran bölge tespit ederek ekstrasellüler etki alanı (ECD) sınırları belirlemek. Bazıları ilgili araçları, çevrimiçi serbestçe kullanılabilir, Malzemeler tablo15,16,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı protein mikroarray teknolojisi için iş akışının bir şematik resim 1' de gösterilen. Hücre dışı protein kitaplığı içeren Mikroarray slaytlar kullanılabilir olduğunda, faiz ve veri analizi protein testi ile taranması 1 gün içinde tamamlanabilir. Membran gömülü reseptörleri arasındaki birçok fizyolojik ilgili etkileşimler çok zayıf bağlama güçlü (KD micromolar aralığında) ile karakterizedir. Bu tür etkileşimler tespiti geliştirmek için sorg.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetim reseptörleri önemli sayıda insan genom kalır ve Roman etkileşen ortakları daha önce karakterize ligandlar ile hücre dışı proteinler için ortaya çıkmaya devam edin. İnsan etkileşimlerde reseptör-ligand ve model organizmalar tanımlama hücresel iletişim homeostazı yanı sıra hastalığı için önde gelen bozukluk sırasında dikte mekanizmaları anlamak ve bu nedenle yeni veya geliştirilmiş bilgilendirmek için önemlidir tedavi olanakları. Yine de, hücre dışı protein etkileşimler tarafından yaygın olarak kullanılan teknolojile.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H., S.R-R ve N.M-M. GreenTech çalışanları ve kendi hisselerine Genentech A.ş. / Roche Grubu vardır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Philamer Calses ve Kobe Yuen eleştirel yazı okumak için teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik danışmanlık için Randy Yen için müteşekkiriz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ultra Saf MB Sınıfı gliserolUSB Corporation56-81-5Protein depolama
SeptoMark engelleme tamponu ZeptosensBB1, 90-40Blokaj tamponu mikrodizi slaytları
Sığır serum albüminiRoche03-117-957-001Maske montajı için kaydırma kontrolü (isteğe bağlı)
Polipropilen çok kuyulu plakalarGreiner Bio One82050-678Protein depolama
Polipropilen çok kuyulu plakalarArrayitMMP384Slayt baskı
NanoPrint LM60 veya benzeri temas mikroarrayerArrayitNanoPrint LM60 veya benzeri temaslı mikroarrayerSlayt baskısı
Mikro spotting pinleriArrayitMikro spotting pinleriSlayt baskısı
ZeptoFOG engelleme istasyonuZeptosensZeptoFOG engelleme istasyonu, 1210Baskıdan sonra slaytları engelle
Yağsız süt tozuThermo FisherLP0031Engelleme çözümü
Epoksisilan kaplı cam kaydırakNextrion Slide E1064016Mikroarray slaytlar
Cam tutucu ve sürgülü raf setiWheaton900303Slayt saklama
Cy5 monoreaktif boyaGE HealthcarePA23031Albümin etiketleme
Cy5 monoreaktif boyaGE HealthcarePA25001İnsan IgG etiketleme
Pro-spin tuz giderme sütunuPrinceton AyırmalarCS-800Serbest boyayı çıkarın
Yapışkanlı alüminyum folyo contaAlumaSealF-384-100Conta stok plakaları
Polipropilen kriyojenik şişelerCorning430658Protein kütüphanesi depolaması için ana şişeler
Protein A mikro boncuklarıMiltenyi120-000-396Sorgu protein multimerizasyonu
İnsan IgGJackson İmmünoaraştırmave nbsp; 009-000-003Protein A Sigma'yı etiketlemek için alakasız IgG
  P7837Mikrodizi slayt engelleme
Hibridizasyon istasyonu, a-Hyb veya benzeriMiltenyiHibridizasyon istasyonu, a-Hyb veya benzeriOtomatik mikrodizi işleme (isteğe bağlı)
GenePix 4000B tarayıcı veya benzeriMoleküler CihazlarGenePix 4000B tarayıcı veya benzeriSlayt tarama
GenePix Pro veya eşdeğeri veri çıkarma yazılımıMoleküler CihazlarGenePix Pro veya eşdeğeri veri çıkarma yazılımıVeri işleme
Signal P4.1DTU Biyoinformatik, Danimarka Teknik Üniversitesiçevrimiçi yazılımSinyal peptit bölünme bölgelerinin varlığını ve yerini belirlemek için tahmin aracı
TMHMM 2.0 sunucusuDTU Biyoinformatik, Danimarka Teknik Üniversitesiçevrimiçi yazılımProteinlerdeki transmembran sarmallarının tahmini
FobiStockholm Biyoinformatik Merkeziçevrimiçi yazılımıBirleşik bir transmembran topolojisi ve sinyal peptit tahmincisi
TOPCONSStockholm Üniversitesiçevrimiçi yazılımıMembran topolojisi ve sinyal peptitlerinin tahmini

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  2. Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interact....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein MicroarrayExtracellular ProteinLow Affinity InteractionsMultimerization ApproachMicrobead Based DetectionHigh Throughput ScreeningProtein A Coated BeadsFC Tagged ProteinsCy3 Cy5 FluorescenceArray Scanner

Related Articles