β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Alzheimer hastalığı (Ah), yaşlı hastalarda bilişsel gerileme önde gelen bir nörodejeneratif hastalık çoğunlukla anormal beta-amiloid (Aβ) ifade, toplama ve engelli izni nörotoksisite¹'^, kaynaklanan kaynaklanmaktadır ². Aβ toplamları ve reklam³arasında iyi karakterize derneğin rağmen altta yatan hastalık patoloji kesin mekanizmaları iyi anlaşılan⁴değildir. Aβ doğrudan⁶dolaşım sistemi bileşenleriyle etkileşimli çalışır gibi öneriyor kanıt artan nörovasküler açıkları ilerleme ve reklam⁵, şiddeti bir rol oynamaktadır. Aβ da reklam hastalar ve fare modelleri^9,10,11Aβ yataklarında yerelleştirir fibrinojen^7,8, yüksek-benzeşme etkileşim vardır. Ayrıca, Aβ-fibrinojen etkileşim anormal fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı, aynı zamanda direnç fibrinolitik^9,12neden olmaktadır. Reklam, tedavisinde bir tedavi imkanı hafifletilmesi dolaşım açıkları Aβ ve fibrinojen^13,14arasındaki etkileşimi engelleyerek. Biz, bu nedenle, birkaç küçük bileşikler yüksek aktarım tarama ve tıbbi Kimya yaklaşımlar^13,14kullanarak Aβ-fibrinojen etkileşim inhibe tespit. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkinliğini test etmek için biz iki yöntem vitro fibrin pıhtısı oluşumu analizi için en iyi duruma getirilmiş: pıhtısı bulanıklık tahlil ve Tarama elektron mikroskobu (SEM)¹⁴.

Pıhtı bulanıklık tahlil fibrin pıhtısı oluşumu UV-görünür spektroskopi kullanarak izlemek için düz ileri ve hızlı bir yöntemdir. Fibrin pıhtısı formlar, ışık giderek dağınık ve çözüm bulanıklık artar. Diğer taraftan, Aβ olmadığı durumlarda, fibrin pıhtısı yapısı değişmiş ve karışım bulanıklık azalır (Şekil 1). İnhibitör bileşiklerin etkisi pıhtı bulanıklık Aβ kaynaklı anormallikler geri yüklemek için potansiyel için tespit edilebilir. Bulanıklık tahlil birden çok koşul hızlı analiz için izin verirken, pıhtı şekli ve yapısı üzerinde sınırlı bilgi sağlar. SEM, katı cisimlerin topografya elektron sonda tarafından kendiliğinden ortaya sağlar pıhtı^15,16,17,18 3D Mimarlık ve nasıl bir değerlendirme analizi için Aβ varlığı ve / veya inhibitör bileşikler o yapısı^9,14değiştirir. Her iki spektrometresi ve SEM çeşitli amaçlar için kullanılan klasik laboratuvar teknikleri vardır, mesela spectrophotometry amiloid toplama^19,20izlenmesi için kullanılır. Benzer şekilde, SEM Ayrıca Parkinson ve tromboembolik inme hastalarında^21,22,23Alzheimer, plazma oluşan fibrin pıhtısı analiz etmek için kullanılır. Burada sunulan protokolleri fibrin pıhtısı oluşumu tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir.

Aşağıdaki iletişim kuralı bir vitro fibrin-pıhtı ile ve ezelî Aβ hazırlanması için yönergeler sağlar. Ayrıca fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı üzerinde Aβ etkisini analiz yöntemleri ayrıntıları. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibisyonu ölçmek için bu iki yöntem etkinliğini TDI-2760, küçük bir inhibitör bileşik¹⁴kullanarak gösterilmiştir. Bu yöntemler, ayrı ayrı ve birlikte, hızlı ve basit bir analiz vitro fibrin pıhtısı oluşumu için olanak sağlar.

1. hazırlanması Aβ42 ve fibrinojen analizi için

1. Liyofilize toz üzerinden monomeric Aβ42 hazırlamak
   1. 1500 x g 30 için de aşağı Aβ42 toz oda sıcaklığında ve spin sıcak s.
   2. Buz gibi hexafluoroisopropanol (HFIP) 100 µL 0.5 mg Aβ42 tozu ekleyin ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
      Dikkat: HFIP ele alırken dikkatli olun ve kimyasal bir mahallede tüm adımları gerçekleştirin.
   3. 20 µL aliquots ve kuru kimyasal başlıklı 2-3 h. filmleri filmleri hava-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de izin hazırlamak
   4. Monomeric Aβ42 filmde 10 µL taze dimetil sülfoksit (DMSO) Oda sıcaklığında 10 dakika içinde bir banyo sonicator ajitasyon tarafından yeniden oluşturma.
   5. 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) arabelleği (pH 7,4) 190 µL ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet.
   6. Santrifüjü 20 dk için 4 ° C'de 20,817 x g de protein toplamları kaldırın.
   7. Süpernatant 20 dk için gece ve sonraki gün santrifüj 20,817 x g 4 ° c de çözüm için 4 ° C'de daha fazla protein toplamları atmak için kuluçkaya.
   8. Aβ42 konsantrasyonu bicinchoninic asit (BCA) tahlil tarafından ölçmek. Seri seyreltik Sığır serum albumin (BSA) 1 mg/mL den bir protein standart üretmek, çok iyi bir tabak içinde nüsha kuyu her standart 10 µL eklemek için 0.0625 mg/ml saf. Aβ örnekleri 1:4 sulandırmak ve 10 µL nüsha wells ekleyin. BCA çözümleri A ve B mix ve her şey için 200 µL ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya ve 562 bir plaka okuyucu okumak nm. Buz üstünde kalan Aβ çözüm almak ve bu hazırlık bulanıklık tahlil ve SEM için kullanma
2. Fibrinojen çözüm hazırlamak
   1. Fibrinojen liyofilize toz 20 mg 15 mL tüp içine ölçmek ve önceden ısıtılmış 2 mL ile 20 mM hydroxyethylpiperazine etan sülfonik asit (HEPES) arabellek (pH 7,4) yeniden askıya alma.
   2. 10 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya.
   3. Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre ve 30 dk için 4 ° C'de depolayın. 4 ° C ve filtre çözümden daha 0,1 µm şırınga filtreden fibrinojen toplamları kaldırmak için çıkarmak veya fibrin önceden var olan.
   4. Fibrinojen konsantrasyonu BCA tahlil tarafından ölçmek. 1.1.8 adımından yönergelere bakın. Kalan fibrinojen çözüm 4 ° C'de almak ve bu hazırlık bulanıklık tahlil ve SEM için kullanma

2. kan pıhtısı bulanıklık tahlil

1. 96-şey plaka deneysel her şey için onun son arabellek 200 µL 3.0 µM bölgedir 1.1.8 adımından 20 µL 30 µM Aβ42 çözüm ekleyin. %5 DMSO aynı hacmi 96-şey plaka kontrol wells arabellek için 50 mM Tris tampon (pH 7,4) ekleyin.
   Not: Aβ42 tam birim bu aşamada önemli değil. Düşük konsantrasyon hazırlıklar için daha fazla kullanılabilir ve pıhtı oluşumu arabellek ses seviyesi ayarlanabilir. Son hacim 200 µL kalmalıdır.
2. İnhibitör bileşikler sınama olumlu sonuçlanırsa, bileşik olarak DMSO çalışma konsantrasyonu oranında seyreltin. Bileşik eklemek veya DMSO yalnız bir denetimi Aβ42 ve mix iyi kuyuları için.
   Not: Ayrı bir damlacık bahçedeki kuyu dibinde Aβ42 çözüm oluşturması gerektiğini veya DMSO damlacığı merkezine doğrudan pipetted.
3. Pıhtı oluşumu arabellek 1.2.4 adımda hisse senedi fibrinojen çözümden seyreltik (20 mM HEPES tampon (pH 7,4), 5 mM CaCl₂ve 137 mM NaCl) ve Aβ42 içeren ve denetim kuyuları 96-şey plaka için ekleyin. Böylece onun son konsantrasyonu 1,5 µM toplam 200 µL tepki birim içinde olur fibrinojen çözüm ses düzeyini ayarlayın. Çözüm yavaş yavaş pipette ve kabarcıklar oluşturan kaçının. Plaka, oda sıcaklığında 30 dk dönen bir platform üzerinde sallayarak için kuluçkaya.
   Not: Fibrinojen çözüm hacmi, hisse senedi toplama bağlı olarak değişebilir, ama her toplam hacim de 170 µL kuluçka sırasında olmalıdır.
4. Trombin çözüm ticari olarak saflaştırılmış Trombin toz yapmak 50 U/mL stok a eriyik için GKD₂O çözülerek hazırlayın. 5 U/mL çalışma çözüm içinde 20 mM HEPES tampon (pH 7,4) kullanmadan doğrudan oranında seyreltin.
5. Kuluçka 30 dk sonra aynı anda 30 µL Trombin çözüm (5 U/mL) 96-şey plaka fibrinojen çözümlerinde içine adım 2.3 çok kanallı pipet kullanarak ekleyin. Trombin eklenmesi hemen pıhtı oluşumu başlatacaktır. Bu nedenle, Trombin kabarcıklar oluşturan önlemek için itina ile fibrinojen çözüm merkezi doğrudan içine ekleyin.
   Not: Trombin aktivitesi Trombin çok yanı sıra deneysel koşullar arasında değişebilir. Sağlam pıhtıları üretmek için gereken doğru konsantrasyon ampirik olarak belirlenecek olabilir.
6. Vitro pıhtı hemen ardından Trombin ek bir plaka okuyucu üzerinde absorbans okuyun. 350 absorbans ölçmek nm 10 dk, her 30-60 s. Perform tüm tahlil oda sıcaklığında boyunca.
   Not: Bazı önleyici bileşikler 350 çözüm absorbans değiştirebilir nm, hangi durumda bulanıklık ölçülebilir 405 nm.

3. Tarama elektron mikroskobu

1. Pıhtı, fiksasyon ve çamaşır hazırlanması
   1. Yer temiz cam daire kapak slaytlara (12 mm) 12-şey ya da 24-şey plaka forseps kullanarak silikonlu.
   2. Fibrinojen içinde pıhtı oluşumu tampon hazırlayın. Ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı adıma 1.2 bakın.
   3. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri fibrin pıhtısı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için (adım 2) bulanıklık tahlil için anlatılan kuluçka için talimatları izleyin. Her zaman yokluğunda Aβ ve inhibitörleri, fibrinojen içeren denetim wells içerir.
   4. Adım 3.1.3 kapak slaytlara fibrinojen karışımı 80 µL pipet. Böylece kapak slayt üzerinde eşit olarak dağıtılır çözüm yavaşça yayıldı.
   5. Trombin stok (50 U/mL) 20 mM HEPES tamponlu tuz 2.5 U/mL nihai bir konsantrasyon için içine sulandırmak ve 20 µL doğrudan fibrinojen çözüm merkezine olmadan ekleyin.
      Not: gerekirse, Trombin çalışma yoğun (5 U/mL) kullanılabilir.
   6. 12-şey plaka plastik bir kapak ile kapak ve 30-60 dakika oda sıcaklığında bekletin.
   7. Reaksiyon pıhtılaşma çalışırken, dehidratasyon ve fiksasyon çözümleri hazırlayın. Sodyum cacodylate arabellek (0.1 M, pH 7,4) hazırlayın. % 10 oxazolidin hisse senedi çözüm içinde sodyum cacodylate tampon (%0.1 2 oxazolidin çözüm çalışma yapmak için M, pH 7,4) oranında seyreltin. Bu çözümler buz üzerinde tutun. Taze seyreltilmiş oxazolidin (% 2) 1 hafta içinde kullanılması gereken düzgün bir buzdolabı 4 ° C'de saklandığında
   8. Mutlak etanol (% 100) Çift Kişilik distile su (etanol %80, % 50 ve % 20) oranında seyreltin. Bu etanol çözümleri ve mutlak etanol (% 100) buz üzerinde tutun.
      Dikkat: Sodyum cacodylate ve oxazolidin ele alırken dikkatli olun, kimyasal bir mahallede aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   9. 30 dakika sonra yavaşça pıhtıları buz gibi sodyum cacodylate arabellek (0,1 M) ile iki kez yıkayın. Öyle ki pıhtı tamamen sular altında her şey için arabellek 2 mL ekleyin. Bir kapak ile iyi plaka kapak ve 2 dakika oda sıcaklığında bekletin. 2 dakika sonra yavaşça 1 mL pipet veya dar kök transfer pipet kullanarak çıkarın. Bir kez yinelenir.
   10. Pıhtı buz gibi oxazolidin (% 2) ile düzeltmek. İyi plaka buz üzerinde tutarak, yaklaşık 2-3 mL % 2 oxazolidin, her şey için ekleyin. Pıhtı tamamen sular altında emin olun. Kapak ve plaka buz 30 dk bekletin.
   11. 30 dk sonra yavaşça oxazolidin her kuyudan çıkarın ve sodyum cacodylate tampon (0,1 M) (2 dk, iki kez) açıklandığı gibi kullanarak pıhtıları yıkayın. İyi plaka buz üzerinde tutun.
2. Seri susuzluktan pıhtı ve kritik nokta kurutma
   1. Buz gibi soğuk etanol yıkar adım 3.1.8 (% 20, % 50, % 80'i, % 100 ve again100%) 5 min için hazırlanan dereceli bir dizi pıhtıları kurutmak. Her etanol dizi için 2-3 mL, pıhtı batık emin ekleyin. Kapak ve buz üzerinde kuluçkaya.
   2. Her etanol adımdan sonra 1 mL pipet veya tek kullanımlık pipet damlalık kullanarak etanol çözüm kaldırın. Etanol tam olarak kaldırmaz. Pıhtı yüzey havaya maruz değil emin olun.
      Not: Dehydration içinde mutlak etanol (% 100) iki kez yapılmalıdır.
   3. Son %100 etanol sular altında örnek tutarken, bir kritik nokta için kurutma makinesi (GBM) aktarın. CPD örnek sahibi veya bir kapak fişi tutucu bir çamaşır makinesi ile slaytlar CPD odanın içine aktarmak için kullanın. Her slayt arasında en az bir çamaşır makinesi yerleştirin.
   4. CPD odasından kapak kaymak dışarı almak ve karbon bant kullanarak bir SEM saplama üzerinde monte edin.
3. Kaplama ve görüntüleme şaplatın
   1. SEM saplama ile tüm örneklerini sputter kaplama odasına aktar.
   2. Sputter kat az 20 nm altın/Paladyum veya karbon, bir vakum sputter coater kullanarak gibi diğer iletken malzemeler.
      Not: Biz-si olmak kullanılmış 18 altın/Paladyum kaplama nm. Sputter kaplama için 45 gerçekleştirildi ve kaplama hızı s yapıldı 4 Å / s. kaplı Sputter örnekleri düzgün oda sıcaklığında kuru bir ortamda birkaç hafta boyunca tutulur kararlı. SEM analiz her zaman yapılabilir.
   3. Saat 4'te SE2 bulmak ile donatılmış bir taramalı elektron mikroskobu görüntüleri elde kV.
      Not: Bu görüntü görüntü piksel boyutunu 13 nm-31 nm aralığı ayarlayın.

(Bulanıklık) tahlil pıhtılaşma vitro , fibrinojen, fibrin ağı24oluşumunda kaynaklanan enzim Trombin cleaves. Bu fibrin pıhtısı oluşumu artan bulanıklık (Şekil 1), (Şekil 2, yeşil) okuma süreniz bitmeden karıştırmadan sonuçlanan çözüm, buradan geçen ışık saçılma neden olur. Fibrinojen Aβ42 huzurunda inkübe zaman çözüm bulanıklık azalmıştır, kabaca yarısı maksimum yüksekliğe ulaşan eğrisi ile fibrinojen yalnız (Şekil 2A, mavi) olan. Son bir yayında Aβ toplama blokerler bir dizi sentezlenmiş ve yeteneklerini bileşik TDI-276014tanımlayan Aβ-fibrinojen etkileşim inhibe için değerlendirildi. Biz bizim çalışma Aβ-fibrinojen etkileşimi engellemek için TDI-2760 kullandık. Bulanıklık Aβ yalnız (Şekil 2Aile kırmızı) daha yüksek olduğu gibi daha önce TDI-2760 huzurunda etkisini bildirildiği gibi Aβ, iyileştirmiştir. TDI-2760 etkisini Aβ (2A rakamyok, mor) ne zaman bileşik arka plan bulanıklık nedeniyle olmak fibrin pıhtısı bulanıklık değişmedi görünmez. Burada açıklanan bulanıklık tahlil pıhtılaşma vitro tarafından hangi fibrin pıhtısı oluşumu ve bu sürecin azaltmak faktörler gözlenen hızlı ve basit bir yöntemdir. Fibrin monomer topuzu delikli etkileşimleri18,25 ile müdahale ile fibrin polimerizasyon müdahale bilinmektedir GPRP (Şekil 2B) bulanıklık tahlil için olumlu bir denetim olarak kullanılabilir. Önceki raporlar ile25, GPRP peptid, varlığı ile tutarlı fibrin pıhtısı bulanıklık önemli ölçüde fibrin pıhtısı oluşumu (Şekil 2B, mavi vs yeşil) onun yokluğu ile karşılaştırıldığında düşürüldü.

Aynı protokol ve koşulları olarak yukarıda açıklanan bulanıklık tahlil, fibrin pıhtısı varlığı ve yokluğu Aβ ve/veya TDI-2760 hazırlanmıştır. Pıhtı sonra elektron mikroskopi için fiksasyon, dehidratasyon, kritik nokta kurutma ve altın-sputter kaplama (Şekil 1) tarafından işlendi. Fibrinojen sadece Trombin ve CaCl2 huzurunda bir fibrin mesh ile daha uzun ve ara konu fibrin hem de daha büyük paketler (Şekil 3A) kurdu. Aβ mevcuttu, fibrin konu çeşitli yapışkan kümeleri/yapısal anormallikler (Şekil 3B) Aβ kaynaklı belirten toplamları ile daha ince, çıktı. Bulanıklık tahlil sonuçları ile tutarlı, TDI-2760 kısmen fibrin pıhtısı yapısını Aβ kaynaklı değişikliklerden geri, daha az kümeleri olduğu gibi (Şekil 3 C) mevcut. Bulanıklık tahlil ile birlikte SEM ölçüde ve fibrin pıhtısı oluşumu Aβ kaynaklı değişikliklere kalitesini, hem de bir inhibitör bileşim, TDI-2760 etkinliğini ortaya koymaktadır.

Resim 1 : Fibrin pıhtısı analiz bulanıklık tahlil ve SEM tarafından şematik Gösterim Şematik fibrin pıhtısı bulanıklık ve yapısal topografya üzerinde fibrin pıhtısı analizde ilgili adımlar ve Aβ etkisini gösterir. SEM görüntüleri (sol alt) ölçek çubukları 2 µm ve büyütmeyi 10, 000 X. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Ölçüm-in vitro etkisi Aβ42 fibrin pıhtısı oluşumu ile bulanıklık tahlil. (A) fibrinojen Aβ42 ile inkübe. Pıhtı oluşumu Trombin, çözüm (yeşil) artan bulanıklık içinde kaynaklanan tarafından akımıdır. Aβ42 huzurunda, fibrin pıhtısı normal olmayan bir şekilde, azalan bulanıklık (mavi) kaynaklanan yapısal. Bileşik TDI-2760 veya DMSO fibrinojen çözüm olan ve olmayan Aβ42 ile inkübe. TDI-2760 Aβ42 kaynaklı azalma normal pıhtı oluşumu (mor) değiştirmeden (kırmızı) bulanıklık geri. (B) bir bilinen fibrinolitik inhibitörü, GPRP bulanıklık de bu tahlil için pozitif kontrol olarak ölçüldü. Fibrinojen varlığı ve yokluğu 1,5 µM GPRP ve Trombin ekledikten sonra ölçülen bulanıklık inkübe. Benzer şekilde Aβ42, fibrin pıhtısı oluşumu bulanıklık önemli ölçüde GPRP (yeşil ve mavi) huzurunda düşürüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Tarama elektron filmler fibrin pıhtısı mimarisine Aβ kaynaklı anormalliklerin. Elektron filmler fibrin pıhtısı yapısının tarama elde edilen arıtılmış fibrinojen (A), fibrinojen + Aβ42 (B), fibrinojen + Aβ42 + TDI-2760 (C). Pıhtı oluşumu Trombin ve CaCl2 karışıma ekleyerek başlatıldı. Yapısal analizi Aβ42 varlığında oluşan pıhtıları fibrinojen için kendi kendine göre daha ince ve anormal derecede olmalı olduğunu ortaya koydu. Aβ42-fibrinojen etkileşim inhibe bilinmektedir, TDI-2760 kısmen fibrin pıhtısı indüklenen Aβ42 yapısal anormallik düzeltildi. Ölçek çubuğu var. 1 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.