Yöntem makalesi

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 Ekim 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz x-ışını soğurma kontrast Mısır doku sıradan microcomputed tomografi taramak için uygun geliştirmek için yeni bir yöntem sağlar. CT görüntüleri baz alınarak, biz görüntü işleme iş akışları için etkili bir şekilde Mısır Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleri ayıklamak farklı Mısır malzeme bir dizi tanıtmak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu doğru bir şekilde yüksek üretilen iş görüntü analiz teknikleri dayalı Mısır malzemelerin anatomik yapıları ölçmek gereklidir. Burada, bir 'örnek hazırlama protokol' Mısır malzemeler (yani, kök, yaprak ve kök) tarama sıradan microcomputed tomografi (mikro-CT) uygun için sağlar. Mısır kök, yaprak ve kök yüksek çözünürlüklü CT görüntüleri baz alınarak, biz iki protokol Vaskular demetleri fenotipik analizi için tarif: (1) Mısır kök ve yaprak CT görüntü dayalı, geliştirdiğimiz otomatik olarak 31 ayıklamak için bir belirli görüntü analiz boru hattı ve damar demetleri 33 fenotipik özellikleri; (2) Mısır kök CT görüntü dizisi dayalı, biz üç boyutlu (3-D) ayrılmasını metaxylem gemiler için bir görüntü işleme düzeni kurmak ve iki boyutlu (2-B) çıkarılan ve gibi cilt, 3-b fenotipik özellikleri yüzey alanı metaxylem gemileri, vb Vaskular demetleri Mısır malzemelerin geleneksel manuel ölçüm ile karşılaştırıldığında, önerilen iletişim kuralları önemli ölçüde verimlilik ve mikron çaplı fenotipik miktar doğruluğunu artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mısır damar sistemi aracılığıyla tüm bitki, kök ve yaprakları, su, mineral besin ve organik maddeler1teslim etmek için anahtar ulaşım yolları oluşturan kök çalışır. Damar sistemi başka bir önemli fonksiyonu için Mısır bitki mekanik destek sağlamaktır. Örneğin, morfoloji, numarası ve dağıtım kökleri ve sapları Vaskular demetleri mısır bitkileri2,3lojman direnç yakından ilgilidir. Şu anda, çalışmaları Vaskular demetleri anatomik yapısını esas olarak kök, yaprak veya kök, belirli bir kısmını anatomik yapıları görüntülemek için mikroskobik ve ultramicroscopic teknikleri kullanmak ve sonra ölçmek ve bu yapıları saymak el ile soruşturma tarafından ilgi. Hiç şüphesiz, büyük ölçekli microimages çeşitli mikroskobik yapıları Manuel ölçüm çok sıkıcı ve verimsiz bir iş ve ciddi bir şekilde kendi öznellik ve tutarsızlık4sayesinde microphenotypic özellikleri duyarlığını sınırlar, 5.

Mısır ikincil hiçbir büyüme vardır ve hücre içeriğini aslında birincil meristem suda oluşur. Herhangi bir ön Mısır dokuların taze örnekler doğrudan bir mikro-CT cihazı kullanarak taranabilir; Ancak, tarama sonuçları muhtemelen kötü ve kaba. Başlıca nedenleri şöyle özetlenebilir: (1) düşük zayıflama yoğunluğu atom numarası ve yüksek gürültü görüntüler; düşük kontrast sonuçlanan bitki dokuların (2) taze bitki malzeme Du6tarafından belirlendiği şekilde kurutmak ve normal tarama ortamı sırasında küçültmek yatkındır. Yukarıda belirtilen sorunları geliştirme ve Mısır, buğday, pirinç ve diğer monocotyledons için microphenotyping teknolojisi uygulama için ana kısıtlamaları haline gelmiştir. Burada, 'örnek hazırlama protokol' tanıtmak Mısır kök, yaprak ve kök örnekleri pretreat için. Bu iletişim kuralı dehidratasyon ve CT tarama sırasında bitki malzemelerin deformasyon önler; Böylece, bitki örnekleri nondeformation ile koruma zaman artırmak yararlıdır. Ayrıca, katı iyot bağlı boyama adımda da bitki malzeme zıtlığını arttırır; Böylece, mikro-CT görüntüleme kalitesi önemli gelişmeler sağlar Ayrıca, görüntü işleme yazılımı, VesselParser Mısır sapları ve yaprakları CT görüntülerini işlemek için adlandırılmış geliştirdik. Bu yazılım bir dizi görüntü işleme boru hatları farklı bitki dokuları 2B CT görüntülerde yüksek üretilen iş ve otomatik fenotipleme analiz gerçekleştirmek için entegre. Mısır kök ve yaprak tüm kesit Vaskular demetleri algılanır, çıkarılan ve otomatik bir görüntü işleme yöntem kullanarak tanımlanan. Sonuç olarak, Mısır kök 31 mikroskobik fenotipleri ve mikroskobik 33 fenotipleri Mısır yaprak elde etmek. Mısır kök CT resim serisi için 3-b fenotipik özellikleri metaxylem gemilerin elde etmek için bir görüntü işleme düzeni geliştirdik. Bu düzen içinde resim alma ve geleneksel yöntemlere göre imar verimliliğini üstündür.

Bu sonuçlar bu görüntü işleme sıradan röntgen mikro-CT görüntüleme özelliklerini Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleme için etkili bir yöntem sağlar dikkate alınarak boru hatları olduğunu gösterir; Bu son derece CT teknikleri bitki biliminde uygulamaları genişler ve hücresel çözünürlük6,7bitki malzemelerin otomatik fenotipleme artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. örnek hazırlama Protokolü

  1. Örnekleme, kök, yaprak, toplar ve taze mısır bitkilerden kök ve onları üç tür örnek grup (her grup dört çoğaltmalar ile) bölün. Sonra aşağıdaki şekilde bir cerrahi bıçak kullanarak küçük parçalara kesmek: (1) pay ortasında bir bölümünün kök düğümler arası 1-1.5 cm uzunluğunda; (2) 0.5 - 3 cm uzunluğunda ana ven ile düşey yönde boyunca yaprak maksimum genişliği bir parçasını kesme; (3) bir parçasını taç kök 0.5 cm boy içinde kesme.
  2. FAA fiksasyon için örnek kesimleri bir çözümde FAA (90:5:5 v/v/v, % 70 etanol: %100 formaldehit: %100 asetik asit) en az 3 d için emmek.
  3. Dehidratasyon yordamı altı sıralı etanol gradyanlar içinde (Örneğin, % 30, % 50, % 70, % 85, % 95 ve % 100) gerçekleştirmek ve her etanol geçişin işlem süresi 30 dk ayarlayın.
  4. Bitki malzemeler 3-b bir yazıcı kullanarak üretilen karşılık gelen örnek sepetler içinde yer; sonra hızlı bir şekilde örnek sepet bir CO2 kritik nokta kurutma sistemi örnek hücreye taşıma. Kurutma parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
    (1) CO2 ': hızlı hız. Tutucu dolgu maddeleri: % 100.
    (2) ücreti: CO2 şarj gecikme 120 s çevrimi. Değişim hızı: 5. döngüsü sayı: 12.
    (3) gazı: ısı, hızlı. Hız: yavaş, %50.
    1. Mısır kök, kök ve yaprak, tasarım ve 3-b Yazıcı (Örneğin, Şekil 1) kullanarak yazdırma örnek sepetleri morfolojik farklılıkları göre.
  5. Kurutulmuş bitki malzemeleri (Mısır kök, kök veya yaprak) uçucu iyot buharı ile bitki malzemeleri boya ve ardından, 4-5 h için lightproof bir odada tüpler yerleştirmek için katı iyot 2 g ile 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin.

2. mikro-CT tarama protokolü

  1. Ham CT veri inceden inceye gözden geçirmek için CT tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 40 kV/250 µA (için kök ve yaprak) veya 34 kV/210 µA (kök için). Aralıkları farklı boyutları ve kullanılan bitki malzemelerin birimleri için tarama karşılık gelen ayarlayın ve görüntüleme piksel boyutları aşağıdaki gibi ayarlayın: 2.0 µm (Mısır kök için) (için mısır sapı) 6,77 µm ve 10.0 µm (Mısır yaprak için).
  2. Dilim görüntüleri yeniden oluşturmak için bir resim yeniden yapılanma yazılımı kullanarak ham CT verileri CT dilim görüntüleri 2 K çözünürlük (2.000 x 2000 piksel) dönüştürün. Daha fazla bilgi NRecon Kullanım Kılavuzu (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) sağlanır.

3. görüntü analiz protokolü için bir Mısır kök ve yaprak bir tek CT görüntüleri

Not: Mısır kök ve yaprak (Şekil 2) CT dilim görüntülerini içinde damar demetleri fenotipleme çözümleme yapmak üzere Vaskular paketler için otomatik görüntüleme yazılımı kullanın. Yazılım kullanım adımları aşağıda açıklanmıştır.

  1. Farklı algoritma boru hatları başlatmak için organ türü tayin. Yöntem parametreleri düğmesini tıklatın ve Mısır kök veya Mısır yaprak ilk açılan kutusunda seçin.
  2. Görüntüleri içe aktarmak için veri yönetimi düğmesini tıklatın, çalışma dizini ayarlama ve otomatik olarak bu dizindeki tüm dilim görüntüleri içe. Tek veya birden çok dilim görüntüleri görüntü boru hatları seçin.
  3. Görüntünün gerçek piksel boyutunu belirlemek. Yöntem parametreleri düğmesini tıklatın ve görüntünün gerçek piksel boyutunu piksel boyutu Düzenle öğesini girin.
  4. Fenotipleme hesaplama için otomatik olarak tüm seçili dilim görüntüleri için damar demetleri fenotipik özellikleri ayıklamak için fenotipleme hesaplama düğmesini tıklatın.
  5. Sonuçları bir TXT veya CSV dosya biçimi olarak çıkış için istatistik analiz düğmesini tıklatın.

4. görüntü analiz Protokolü Mısır kök CT resim serisi için

Not: Mısır kökleri CT resim dizi metaxylem damarları görüntü işleme yazılımı kullanarak 3 boyutlu yapıları ayıklamak için kullanılmaktadır. Ana adımları aşağıdaki gibidir.

  1. (BMP dosya biçiminde) Mısır köklerinin yeniden oluşturulan görüntüleri içe ve doğru aralığı parametreleri (voxel [yani, x, y, z] boyut) belirleyin. Görüntü kalitesini artırmak için bu görüntüleri düzeltmek için özyinelemeli Gauss aracını kullanın.
  2. 3-b segment metaxylem gemilerin eşik parametreleri ayarlayarak kuralları; Her bağlı metaxylem araç için bir tek tip renk etiket oluşturur.
  3. Geliştirmek ve etkileşimli morfoloji, bitwise, kullanarak metaxylem damarları ve sel-dolgu işlemleri tanımlar.
  4. Birim görselleştirme ve yüzey gemi inşası kuralları. Maske istatistik aracı ve 2-B ve 3-b seviyelerinde bir gemi fenotipik özellikleri ölçmek için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıradan mikro-CT tarama için uygun örnek hazırlama Protokolü sadece bitki doku deformasyon engeller, ancak aynı zamanda x-ışını soğurma zıtlığını arttırır. Ön işleme tesisi malzemeleri bir mikro-CT sistemi yüksek kaliteli dilim görüntüleri kullanılarak taranır ve en yüksek çözünürlükte 2 µm/piksel ulaşabilirsiniz. Şekil 4 taranan mikro-CT görüntüleri, kök, yaprak ve kök gösterir ve görüntü kontrastı taze bitki malzemelerden taranan sonuçları ile karşılaştırıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CT teknolojisi biyomedikal ve malzeme bilimi alanlarında başarılı uygulama ile bu teknoloji yavaş yavaş Botanik ve bitki yaşam bilimleri araştırmaları umut verici bir teknik araç olarak teşvik tarım alanlarına kullanılmaya başlanan . 1990'ların sonunda CT teknolojisi ilk çalışma morfolojik yapıları ve bitki kök sistemlerinin geliştirilmesi için kullanıldı. Geçtiğimiz on yılda, sinkrotron HRCT bitki biyologlar için güçlü, zararsız bir araç haline geldi ve başarıyla doku yapıları üzüm damar sistemi8...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma desteklenen Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin (No.31671577), bilim ve teknoloji yenilik özel inşaat finanse edilen Program Pekin Akademi, tarım ve ormancılık Sciences(KJCX20180423), araştırma Kalkınma Programı Çin (2016YFD0300605-01), Beijing doğal Bilim Vakfı (5174033), Beijing doktora sonrası Araştırma Vakfı (2016 ZZ-66) ve Tarım Akademisi Pekin ve ormancılık Bilimler Grant (KJCX20170404), () JNKYT201604).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Skyscan 1172 X-ışını bilgisayarlı tomografi sistemiBruker Corporation, BelçikaCTtaraması için
NA CO2 kritik nokta kurutma sistemi (Leica CPD300)Leica Corporation, AlmanyaNANumune kurutma için
EtanolFAA fiksasyonu içinherhangi birNA
FormaldehitFAA fiksasyonu içinherhangi birNA
Asetik asitHerhangi birNAFAA fiksasyonu için
Cerrahi bıçakHerhangi birNANumune sistemlerini kesmek için
3D yazıcıMakerbot çoğaltıcı 2, MakerBot Industries, ABDNAMısır kökü, sapı ve yaprağının numune sepetlerini yazdırmak için
Santrifüj tüpüCorning, ABDNAKök, gövde veya yaprak malzemelerini yerleştirin
Katı iyotHerhangi birNAÖrnek boyama için
SkyScan Nrecon yazılımıSkyScan NRecon, Sürüm: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelçikaNAGörüntü rekonstrüksiyonu için
VesselParser yazılımıVesselParser, Sürüm: 3.0, Tarımda Bilgi Teknolojileri Ulusal Mühendislik Araştırma Merkezi (NERCITA), Pekin, ÇinNAsapı veya yaprağının tek CT görüntüsü için görüntü analiz protokolü
ScanIPScanIP, Sürüm: 7.0; Simpleware, Exeter, UKNA3D görüntü işleme yazılımı
Lateks eldivenlerHerhangi birNA
CımbızHerhangi birNA
Mısır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Numune Haz rlama ProtokolFenotipik Analiz Ak3 Boyutlu SegmentasyonMetaksilem DamarlarBT G r nt Rekonstr ksiyonuOtomatik G r nt leme Yaz l mHacimsel G rselle tirmeY zey Rekonstr ksiyonu

İlgili makaleler